Információ

Bakteriofágok és szerepük a genetikai szerkesztésben?

Bakteriofágok és szerepük a genetikai szerkesztésben?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tudom, hogy a plazmidok és restrikciós enzimek hogyan változtatják meg a baktériumsejt DNS-ét, de nem igazán értem, hogyan működik a bakteriofág a sejt genomjának szerkesztésében. Rokon-e a crispr, mivel ez egy vírus, amely genetikát épített be a baktériumokba? Továbbá, a lizogén vagy litikus szakaszban változtatja meg a bakteriofág a DNS-t?


Amint az a Wikipédia oldalon található, amelyre hivatkozott, transzdukció egy adott jelenség elnevezése, amelynek során a fág felhasználható a bakteriális DNS mozgatására a sejtek között.

A fágtól függően néhány aberráns vagy ritka folyamat a gazdasejt DNS-ének fágrészecskévé való becsomagolását eredményezheti a lítikus ciklus során. A létrejövő hibás fágrészecske azonban továbbra is fertőző, és amikor új gazdasejtet fertőz meg, beinjektálja az általa hordozott bakteriális DNS-t. Ez a DNS ezután rekombinálódhat a gazda DNS-ével.

Így például, ha a második gazdagép a lacZ mutáns, de a szülőgazda volt lacZ⁺, akkor lehetne választani lacZ⁺ a második gazdában.

A transzdukció fontos eszköz volt E. coli genetika. A P1 fág erre használható Tábornok transzdukció, ami azt jelenti, hogy a DNS bármely darabja mozgatható. Ahogy a kommentemben is mondtam: bármi megtörténhet, megtörténik.


Mi az a bakteriofág?

A bakteriofág egy vírus, amely megfertőzi a baktériumokat. A bakteriofágok, amelyeket először 1915 körül fedeztek fel, egyedülálló szerepet játszottak a vírusbiológiában. Talán ők a legjobban érthető vírusok, ugyanakkor szerkezetük rendkívül összetett is lehet. A bakteriofág lényegében egy fehérjehéjba zárt DNS-ből vagy RNS-ből álló vírus. A fehérjehéj vagy kapszid védi a vírus genomot. Néhány bakteriofág, például a T4 bakteriofág, amely fertőz E. coli, fehérjefarokkal is rendelkezik, amely rostokból áll, amelyek segítenek a vírusnak a gazdaszervezethez való kötődésében. A bakteriofágok alkalmazása kiemelkedő szerepet játszott annak tisztázásában, hogy a vírusoknak két elsődleges életciklusuk van: a lítikus ciklus és a lizogén ciklus.


Bakteriofág alapú szintetikus biológia fertőző betegségek tanulmányozására

A multirezisztens fertőzések új érdeklődést váltottak ki a bakteriofágok iránt.

A szintetikus biológia lehetővé tette a következő generációs fágtervezési technológiákat.

A módosított fágok és a származtatott részek új antimikrobiális paradigmát alkotnak.

A bakteriofág alapú riporterek lehetővé teszik bizonyos kórokozók kimutatását.

A fágból származó komponensek a szintetikus biológia eszköztárában egy alapvető részegységet alkotnak.

Felfedezésük óta a bakteriofágok óriási mértékben hozzájárultak ahhoz, hogy megértsük a molekuláris biológiát mint modellrendszert. Ezenkívül a bakteriofágok számos olyan eszközt biztosítottak, amelyek előremozdították a géntechnológia és a szintetikus biológia területét. Itt a bakteriofág alapú technológiákat és azok fertőző betegségek tanulmányozására való alkalmazását tárgyaljuk. A genomok tervezésére vonatkozó új stratégiák felgyorsíthatják az új fágok tervezését, mint terápiákat, diagnosztikát és eszközöket. Bár csaknem egy évszázad telt el felfedezésük óta, a bakteriofágok továbbra is jelentős hatást gyakorolnak a modern biológiai tudományokra, különösen a multirezisztens baktériumok szaporodásával és a mikrobiom iránti érdeklődéssel.


A bakteriofág biológia jövője

A molekuláris biológia alapjait megalapozó egyik elsődleges eszköznek számító jeles történelem után a bakteriofágkutatás most reneszánszát éli, amelyben magukra a fágokra helyezik a hangsúlyt, nem pedig az általuk magyarázott molekuláris mechanizmusokra. Virágoznak a fágok evolúciójával és a természetes ökoszisztémákban betöltött szerepükkel kapcsolatos tanulmányok. Fokozott figyelmet kapnak az olyan gyakorlati kérdések, mint a fágok felhasználása a baktériumok által okozott emberi betegségek leküzdésére, a fágkártevők felszámolása az élelmiszeriparban, illetve ezek szerepe az emberi betegségek előidézésében. A fágok hasznosak az alapvető molekuláris és biofizikai kérdések mélyebb feltárásában is.

Körülbelül 25 évvel 1915-ös felfedezésük után (1. hivatkozás) megkezdődött a fágok használata az öröklődési mechanizmusokkal kapcsolatos alapvető kérdések megválaszolására, kihasználva a manipulálhatóságuk egyszerűségét 2 . 1940 és 1970 között a fágkísérletek lefektették a molekuláris biológia tudományának alapjait. Ezt a tudományt, amelyet egykor „modernnek” neveztek a „klasszikus” biológiától eltérően, már régóta beépítik a tankönyvekbe. A legújabb kutatások azonban azt mutatják, hogy a fágok tanulmányozásának a molekuláris biológiához való történelmi hozzájárulását beárnyékolhatja általában a biológiára és különösen a genetikára gyakorolt ​​jövőbeli hatás. A fágok fontos szerepet játszanak a globális ökológiában és a bakteriális patogenitásban. Ezek a feltörekvő szerepek, valamint a fággenomikával kapcsolatos újabb publikációk növekvő száma rávilágít a fágbiológia és annak fényes jövőjének időbeni értékelésére. Itt összefoglalom a fágok molekuláris, ökológiai és evolúciós biológiájával kapcsolatos tanulmányokat, amelyek az érdeklődés e reneszánszához vezettek, és meghatározok néhány kulcsfontosságú megválaszolatlan kérdést.

A bakteriofágok (más néven fágok) olyan vírusok, amelyek megfertőzik a baktériumokat. Mint minden vírus, a fágok fertőző részecskék, amelyek legalább két komponensből állnak: nukleinsavból és fehérjéből. Ha egy fág megtámad egy fogékony baktériumsejtet, a fág (vagy legalábbis a nukleinsavja) belép a sejtbe, és beindítja a fágtermelési ciklust (1. ábra). Ebben a ciklusban a sejtet átprogramozzák, hogy fággyárrá váljon, amelyben a bioszintetikus apparátus komponensei (például riboszómák és ATP-generátorok) eltérnek a baktériumok szaporodásának szokásos feladataitól. Az újraprogramozás különböző útvonalait fágspecifikus fehérjék indítják el, amelyek a fertőzés után keletkező fág mRNS-ből transzlálódnak.

A fágrészecske a farka hegyével találkozik a sejtfelszínnel, és hozzátapad, és bejut a fág DNS-be, amely egy üres fehérjehéjat hagy a sejt külsejére tapadva. Ezután a lineáris DNS-molekula végei kört alkotnak. A záródási pontot kohéziós helynek (cos) nevezzük. Egyes fertőzött sejtekben a DNS átíródik, transzlálódik és replikálódik. A replikációnak két útja van: a θ-forma és a gördülő kör. A gördülő körben végzett replikáció során lineáris kettős szálú DNS (dsDNS) multigenomikus farkokat hoz létre, amelyekből a DNS-t előre kialakított fehérjehéjakba vonják be, és a sejteket adják hozzá, és a sejt lizál, hogy felszabadítsa a fág utódokat. Más fertőzött sejtekben a fágfejlődés visszaszorul, és a fág DNS beépül a bakteriális kromoszómába. Az így létrejövő lizogén sejt korlátlanul replikálódhat, de a fág DNS kromoszómából való kivágásával a lítikus ciklusba való visszatérésre indukálható.

Az időbeli program rendezett és szabályozott. Általában először a nukleinsav-replikáció megy végbe, majd ezt követi a fágrészecske szerkezeti fehérjéinek szintézise. Ezután új fágrészecskéket állítanak össze, és később kiszabadulnak a sejtből. A legtöbb klasszikusan vizsgált KOLIFÁG esetében a felszabadulás a sejtburok felbomlásával és a sejt hirtelen lízisével történik, amelynek tartalma (beleértve az új fágrészecskéket is) kiömlik a táptalajba. A teljes ciklus körülbelül 40 percig tarthat, és körülbelül 100 új fágot termel (1. ábra).

Ez a típusú lítikus ciklus sok fág egyetlen szaporodási módja. Más KÖRÉSZLETES fágok alternatív életciklussal rendelkeznek, amelyben a fertőzött sejtek egy része bemegy a lítikus ciklusba, míg más sejtek túlélik a fertőzést, és tartósan nyugvó formában tárolják a fág genomját (PROPHAGE). A profágot hordozó sejteket LISZOGÉNEKNEK. Bizonyos ágensek (például ultraibolya fény) arra késztethetik a lizogén sejteket, hogy újra belépjenek a lítikus ciklusba (1. ábra).

Az egyik oka annak, hogy a fágok hasznosak voltak a kutatásban, az a sejtpopulációban a litikus ciklus egyszerű szinkronizálása, így a molekuláris események előrehaladása az egész tenyészetben mérhető. A szinkronizálás megvalósítható akár egyidejű fertőzéssel, akár a lizogén sejtekben a fágfejlődés indukálásával. A második ok az, hogy a ciklus bizonyos szakaszait befolyásoló mutációk könnyen izolálhatók és elemezhetők.

A fágok mérete és formájuk ugyanolyan változatosak, mint az eukariótákat megfertőző vírusok. Számos formális osztályozási sémát javasoltak, de egyik sem széles körben hasznos vagy ismert, hogy tükrözné a filogenezist. Az 1. táblázat összefoglalja a gyakori modellfágokra vonatkozó alapvető információkat, és szemlélteti a fágok morfológiájának és életmódjának sokféleségét.

A vírusok törzse elkerülte a virológusok generációit. A modern módszerek inkább újradefiniálták a kérdéseket, mintsem végleges válaszokat kaptak. A közeli rokonságban álló csoportokban az izolátumok a hasonlóság foka szerint rendezhetők, de az, hogy az összes vírus (vagy akár az összes fág) egy MONOFILETIKUS CSOPORTOT alkot, továbbra is bizonytalan.

Az eszmék fejlődését a genom előtti korszaktól kezdve a fágokon és rokonaikon végzett munka szemlélteti. Az 1950-es években számos mérsékelt égövi fágot (LAMBDOIDS) fedeztek fel, amelyek morfológiailag hasonlítanak a λ fágra, és képesek voltak vele rekombinálni. A HETERODUPLEXES elektronmikroszkópos vizsgálata, a genetikai keresztezések eredményeivel párosítva, igazolta, hogy a lambdoid fágok közös genetikai térképpel rendelkeznek, de eltérő sajátosságokat mutatnak az olyan tulajdonságok tekintetében, mint az integráció, az elnyomás és a gazdakör. Ezek a vizsgálatok azt is kimutatták, hogy bármely két lambdoid fág genomjának egyes szegmenseiben hasonló, másokban pedig eltérő, a hasonlóságból a különbözőségbe hirtelen átmenetekkel 3.

A kiterjedt DNS-szekvenálás megerősítette ezt az általános képet. Azt is kimutatta, hogy a megváltozott specificitású szegmensek (például a represszorgének), bár szekvenciájukban nagymértékben különböznek egymástól, ennek ellenére ORTOLÓGUSAK. Összehasonlítva az összes ismert lambdoid fágot, aligha kétséges, hogy a természetben kiterjedt rekombináción mentek keresztül, keveredve és egyeztetve a heterológ specificitást meghatározó tényezőket. A szekvenálás azt is ellenőrzi, hogy a legtöbb határ éles-e a közeli hasonlóság és a szélsőségesen eltérő szegmensek között.

A Hendrix 4 kínálta ezen eredmények legátfogóbb értelmezését. Ha a különböző, egymással szorosan összefüggő fágok, mint például a lambdoidok, találkoznak egymással a természetben, rekombinálódhatnak. A rekombináció gyakorisága a két partner hasonlóságának mértékétől függ a rekombinációs pontokon. Tehát bármely két fág között a HOMOLOGY megosztott szegmensei rekombinációs linkerként szolgálhatnak, és még az oligonukleotid hosszúságú azonosságok is előnyös cserepontokat hozhatnak létre. Ezek egyike sem új. Azonban a törés és az összekapcsolás néha akkor is előfordul, ha nincs homológia – ami új alapot jelent –, és az evolúciós idők során ez elég gyakran megtörténik ahhoz, hogy éles határokat hozzon létre a homológia és a nem homológia között, amelyek a fágokban megfigyelhetők. A legtöbb ilyen új csomópontnak halálosnak vagy károsnak kell lennie, de a természetes szelekció megőrzött néhány jóindulatú kombinációt.

Ez felveti a kérdést, hogy a szülői fágok, amelyek egy új csomópontot eredményeztek, hogyan különböztek annyira egymástól. Mielőtt azonban ezzel a kérdéssel foglalkoznánk, hagyjuk a lambdoid fágok rövidlátó vizsgálatát, hogy megvizsgáljuk, mit jelent a genomelemzés az olyan fágokról, amelyek lényegében nem rokonok, még akkor is, ha nagyon sokféle gazdaszervezetből származnak.

Ezen a szinten az üzenet egyértelmű. A természetes fággenomok gyakran kiméra eredetűek, és nagy evolúciós távolságokra átvitt géneket tartalmaznak 5 . A lambdoid fágok közötti új csomópontok létrejöttéhez hasonlóan az ilyen transzferek potenciális számának nagymértékben meg kell haladnia a természetes szelekció rostáján áthaladó számot. A molekuláris kimérizmus markánsabb példái közé tartozik az N15 fág. Míg a legtöbb fággén egy lambdoid fág génjeivel rokon, és abban a sorrendben van, mint egy lambdoid fág génjei, a profág formája lineáris plazmidként megmarad, amely olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek rokonok a lambdoid fág génjeivel. Escherichia coli valamint a P1 és P4 kolifágokra (6. hivatkozás).

Ez a széles körben elterjedt kimérizmus arra késztet bennünket, hogy elhiggyük, hogy a fággenomok együttesen egy olyan készletet alkotnak, amely folyamatos keveredésnek van kitéve. Ez a csoport olyan csoportokat tartalmaz, mint például a lambdoid fágok, amelyekben a keveredés még gyakoribb. Azonban néhány génblokk, amely a lambdoid fágokban található, előfordulhat, hogy történetük nagy részében máshol lakott, és hosszú időszakok során tértek el egymástól, amely során nem voltak kitéve gyakori rekombinációnak más lambdoid fágokkal. Meg kell jegyezni, hogy a molekuláris óra becslései azt mutatják, hogy a λ-gének egyes allélváltozatai már jóval azelőtt eltértek egymástól. E. coli, amely a λ gazdája, talán még olyan régen, mint a baktériumok archaeából és eukariótákból való elágazása 4,7 . Számos oka van annak, hogy megkérdőjelezzük a molekuláris órákkal való kormeghatározás pontosságát 8 . A vírusgének ősiségét azonban egy független bizonyítéksor is jelzi 9 . Vannak markáns példák (például adenovírusok és reovírusok), amelyekben a víruskapszid morfológiája hasonló egy olyan csoportban, amely állati vírusokat, növényi vírusokat és bakteriofágokat foglal magában. Ezek a hasonlóságok az egyes fehérjék alakjától a (több fehérjefajtából álló) vírusrészecske általános morfológiájáig terjednek, és nem valószínű, hogy evolúciós konvergenciát jelentenek. Ez például a reovírusok és a φ6 fág közös felmenőire utal, bár az RNS- és fehérjeszekvenciák nem mutatnak jelentős hasonlóságot, és ezért már régen eltértek egymástól, talán az élővilág fő doménjeinek szétválása előtt.

A fágcsaládok, például a lambdoidok egyik jellemzője a közös genetikai térkép. A fággenom szerkezeti és szabályozó elemeinek fő meghatározói ugyanabban a sorrendben vannak jelen az egész családban. Amint azt korábban tárgyaltuk, ezeket az elemeket időnként más fágokból származó homológokkal vagy ANALÓGOKKAL helyettesítették. Azonban valamikor a múltban ezeknek a genomoknak létre kellett jönniük, valószínűleg kisebb, korlátozottabb funkciójú genomok összeolvadásával. Tehát az eredeti lambdoid fág a replikációs génjeit egy forrásból, a lízis génjeit egy második forrásból, a szerkezeti génjeit pedig egy harmadik forrásból származtatta. A géneket egyenként vagy nagyobb blokkokban adhatták hozzá 3,4.

Az izgalmas pont az, hogy az ilyen génhozzáadás nem csupán egy réges-rég fait accompli, hanem egy aktív, folyamatos folyamat. A 4-es Hendrix-csoport azonosította a lambdoid fágok genomjának olyan szegmenseit, amelyek úgy tűnik, hogy a közelmúltban beleilleszkedtek a fág genomjába. Ezek a szegmensek („moronok”) jellemzően egyetlen gént tartalmaznak, amely gyakran ismeretlen funkciójú, és általában bázisösszetételében különbözik a fággenom többi részétől. Mindegyik idióta jelen van néhány lambdoid fágban, másoktól hiányzik. A toxingének fágok általi beépülése és a hosszabb patogenitási szigetek példája lehet ugyanilyen folyamatnak (lásd később).

Az új fágtípusok rekombinációs eredetének hátterében álló természetes dinamika teljes megértéséhez pontosabb információra lesz szükség a természetes szelekció szerepéről – nemcsak a rosszul adaptált típusok kiküszöbölésére (ahogy korábban említettük), hanem a néhány kiváló variáns aktív szelekciójára is. További erőfeszítések kívánatosak ebben az irányban, nemcsak belső érdeklődésük miatt, hanem például az eukarióta gazdaszervezeteket megfertőző vírusok modelljeként is. Jól dokumentált, hogy a koronavírus-csoport tagjai, amely a közelmúltban egy halálos új vírus megjelenésével hívta fel magára a figyelmet. súlyos akut légúti szindrómát (SARS) okozó humán kórokozó, amely a természetben gyakori rekombináción megy keresztül 10,11 .

Az a régóta fennálló gyanú, hogy a fágok mindenütt jelen vannak a prokarióta világban, beigazolódott, mivel ismereteink bővültek, és több fágot és fágokkal rokon szekvenciát is tartalmaznak a prokarióta genomokban. A fágszerű részecskék számszerű mennyisége a vízi ökoszisztémákban általában meghaladja a prokarióta sejtekét, és e sejtek biomasszájának >10%-át képviselheti. Továbbá, amint azt a legutóbbi áttekintések 12, 13, 14 dokumentálják, egyre több bizonyíték utal arra, hogy ezeknek a látható részecskéknek a nagy része életképes fertőző fágokat tartalmaz.

A természetes tápláléklánc bázisán a fotoszintetikus mikrobák állnak: zöld algák és cianobaktériumok. Mindkét csoport biomasszájának jelentős része vírusfertőzés következtében oldott szerves anyagként szabadul fel. Az oldott szerves anyagok heterotróf fogyasztóit is gyakran elpusztítja a vírusfertőzés. A bakteriofágokat kihagyó természetes táplálékhálózatról még csak közel sem teljes a leírás 15,16 .

Modellek a molekuláris biológiához

Molekuláris gépek. A biokémia fókusza az egyes fehérjék általi kémiai katalízistől a molekuláris együttesek által végrehajtott mechanikai folyamatok felé haladt. A fágrendszerek számos tanulságos példával szolgálnak.

A nagy farkú DNS-fágok általi fertőzés során a DNS-injekciót előidéző ​​erők sokáig elkerülték a közvetlen azonosítást. Sok gyakori fág esetében, mint például a λ és a T4, ez továbbra is fennáll. Több előrelépés történt a fágokkal, például a T7-tel, amelyek lassan injektálják be DNS-üket. A kezdeti lépés a T7 fehérjék beinjektálása a fágrészecskéből, hogy a sejtburkon át egy csatornát alakítsanak ki, amely a DNS-t a sejtbe vezeti egy látszólag enzimatikus folyamat révén17. Ezt követően a DNS-t egy hatékonyan stacionárius RNS-polimerázzal (először a gazdaszervezet, majd a fágpolimeráz) történő transzkripcióval húzzák a sejtbe, amely a DNS-t önmagán keresztül tekercseli18,19. Az I. TÍPUSÚ RESTRICTION ENZYME Eco KI képes helyettesíteni az RNS-polimerázt a DNS 20 feltekercseléséhez.

A nagy, kétszálú DNS (dsDNS) fágok összeállítása során a vírus DNS-t az ikozaéder egyik csúcsán elhelyezkedő portálfehérje az előre kialakított fejekbe húzhatja. A fizikai mechanizmusról részletes tanulmányok készültek Bacilus φ29 fág (21. hivatkozás). A dodekamerikus portálfehérje 12°-os lépésekben forog a fág fehérjehéjában, amely a fág DNS-ben tekergőzik, és ATP hidrolízissel működik (2. ábra).A φ29 fejébe csomagolt egyedi DNS-molekulákra ható erőket pontosan megmérték, és azt mutatják, hogy a φ29 portálfehérje az egyik legerősebb ismert molekuláris motort 22 hozza létre.

A csatlakozót forgató és a DNS-t a fejbe fordító mechanizmus egy ciklusának illusztrációja. A csatlakozó tengelye (felső sor) felőli nézet a fej felé mutat, míg az alsó sorban a panelnek megfelelő oldalnézetek láthatók. b. A csatlakozó tizenkét alegységéből (A–L) tizenegy zöld színnel, az egy „aktív” monomer pedig pirossal látható. A csatlakozót keskeny végén kis gömbökből, a széles végén pedig nagyobb gömbökből álló halmazként ábrázolják, amelyeket egy vonal köt össze, amely a központi spirális régiót képviseli. A keskeny végét körülvevő plazmid RNS (pRNS)-ATPáz komplexeket (I-V) négy kék gömbből és egy piros gömbből álló halmaz mutatja. Az aktív összekötő monomerhez igazodó DNS-bázis szintén piros színnel látható. a | Az aktív pRNS-ATPáz I kölcsönhatásba lép a szomszédos összekötő monomerrel (A), amely viszont érintkezik az összehangolt DNS-bázissal. b | A csatlakozó keskeny vége 12°-kal az óramutató járásával ellentétes irányban elmozdult, hogy a C monomer keskeny vége az ATPáz II-vel szemben helyezkedjen el, a következő ATPáz aktiválásakor a csatlakozó hosszirányban kitágul azáltal, hogy kissé megváltoztatja a csavarvonal szögét. központi tartomány (fehér nyíl csillaggal). c | A csatlakozó széles vége követte a keskeny végét, ahogy a csatlakozó ellazul és összehúzódik (fehér nyíl két csillaggal), ezáltal a DNS lefordítva a fág fejébe. A következő ciklusban az ATPase II aktiválódik, ami a csatlakozót további 12°-kal elforgatja, és így tovább. Az ábra a Ref. engedélyével reprodukálva. 21.

Az ilyen motorok mellett a fágok számos molekuláris gépet használnak. Jó példa a fág DNS beépítése a kromoszómába a lizogenizáció során. Számos λ-integráz molekula alkot egy halmazt (az INTASOME), amely a fág DNS egy specifikus szegmenséhez kötődik, a bakteriális inszerciós helyeket toborozza a komplexbe, majd összehangolt egyszálú vágásokat hajt végre a két DNS-ben. A szálvágás egy 3'-foszfát és az integráz fehérje tirozinjának kovalens kapcsolódásán keresztül megy végbe. A szabad 5′ végek három terminális bázisa ezután cserepartnerekké forog, majd ligálással eltávolítjuk az integráz fehérjét a 3′ végekről, hogy HOLLIDAY JUNCTION jöjjön létre. Az összlet ezután átrendeződésen (izomerizáción) megy keresztül, és a találkozás másik oldalán lévő két, korábban nem vágott szál elvágásával feloldja a Holliday-struktúrát, ami lehetővé teszi a partnerek cseréjét a felszabadult 5′ végek által, majd az újrazárást 23 . A fordított reakció (kivágás a kromoszómából) egy második fág-specifikus fehérjét (excisionázt) igényel, és egy analóg mechanizmus szerint megy végbe, ami azonban nem az integrációs reakció egyszerű kémiai megfordítása 24 .

Valószínűleg a közelmúlt legfontosabb áttörése az a felfedezés volt, hogy mind az iniciáció, mind a felbontás magában foglalja a szabad 5′ végek szálcseréjét, amint azt korábban leírtuk 22 . Korábban azt gondolták, hogy a Holliday csomópontok a vágás helyén történő újraligálással jöttek létre, majd az ágak vándorlásával a feloldóhelyre (7 bps eltávolítva). Azóta jelentős előrelépés történt a kezdeti DNS-fehérje kölcsönhatások természetében 25, 26 és a DNS-fehérje komplex köztes szakaszainak jellemzésében 27, 28 .

Génszabályozás. Egy sor mélyreható kísérletben Ptashne és munkatársai meghatározták a működési módja a lízis/lizogén döntés fágban, mint egy modell genetikai kapcsoló, amely a megfelelő operátor helyeken (oR) működik 29 (3. ábra). Ezt a munkát a közelmúltban kiterjesztették azzal a felfedezéssel, hogy a természetes váltást erősen befolyásolja a represszor és a bal oldali operátor (oL) egyidejű kölcsönhatása, amely több mint 3 kb távolságra van 30,31,32 hogy a represszor összeáll oktamerekké, ahogy az a kooperatív kötéshez szükséges 33 .

a | A bakteriofág életciklusában (1. ábra) a fág vagy beléphet a lítikus ciklusba – amelyben szaporodik, majd lizálja gazdáját – vagy a lizogén ciklusba, amelyben a fág DNS beépül a gazda DNS-ébe, és korlátlan ideig replikálódik. . A szaggatott négyzetek olyan operátorhelyeket tartalmaznak, amelyek egy promoter-vezérlő komplexumot tartalmaznak. A három üzemeltetői oldal OR1–3 a 'λ-kapcsoló' szabályozza a promótereket PRM és PR. A Cro és CI dimerek különböző affinitással és ellenkező sorrendben kötődnek a három helyre, hogy szabályozzák a PRM és PR promóterek 29 . Ha a protein N elérhető, az RNS-polimerázok (RNAP-k) átírása ANTI-TERMINÁLTÁBÓL a NUT-banR és DIÓL oldalak a befejező helyek TR1 és TL1 nem működnek az anti-terminált RNAP-k esetében. A CI dimer vagy a promoter represszoraként vagy aktivátoraként működik PRM, koncentrációjától függően. A P1 és P2 olyan proteázok, amelyek lebontják a CII fág fehérjét. A CIII egy fággéntermék, amely egyben a P1 szubsztrátja is. A P1-hez kötődve a CIII gátolja a CII lebomlását. b | λ-döntési kör DNS-szervezet. A döntési áramkör fág által kódolt genetikai elemei a fág DNS 5000 nukleotid hosszúságú régiójában helyezkednek el. A géneket balra és jobbra átírt szálakra különítik el, amint azt a nyilak jelzik. Az anti-terminált jobbra kiterjesztése PR átirat átírni a O és P a fággenom replikációjához nélkülözhetetlen gének, és a K gén, amely szabályozza a későbbi gének transzkripcióját a lítikus útvonalon. Az anti-terminált balra kiterjesztése PL átirat átírja xis és int gének, amelyek nélkülözhetetlenek a fág-kromoszóma integrációjához és a gazda kromoszómába történő kivágásához. Négy végállomás helyét a jelzi TR1–2 és TL1–2. Az ábra a Ref. engedélyével módosult. 33.

Kezdeti megértésünk in vivo az átállás más szempontból is hiányos volt. A korábbi munka azt mutatta, hogy az orR kapcsoló önmagában is BISTABLE. Az cI A represszort kódoló gén az oR-ből balra íródik át, míg a másodlagos Cro represszor és más géntermékek a jobb oldali üzenetből származnak. Mind a represszor, mind a Cro három helyhez kapcsolódhat az orr-ban, és mindkét irányban leállíthatja a transzkripciót. Egyik vagy másik azonban előbb-utóbb fölénybe kerül. Ha létrejön a represszor szintézis, a Cro szintézis leáll, és oda-vissza. A rendszer ezért elegáns modellt nyújt arra vonatkozóan, hogy a váltási eseményeket miként lehet más kontextusban irányítani, például a sejtdifferenciálódás során többsejtű eukariótákban28,34.

Ami a fágrendszert illeti, indokolatlannak tűnhet a kérdés, hogy a döntő eseményeket sikerült-e azonosítani, mivel az egyszerű modell elegendő magyarázatot ad. A represszor szintézis Cro általi leállítása attól függ, hogy Cro kötődik az oR3 operátor helyhez, ami a lítikus ciklus aktiválásának döntő lépése lehet. Ebben a nézetben az elnyomás létrejötte a Cro és az elnyomó közötti versenytől függ. Azonban már a kezdetektől ismert volt, hogy egy másik fehérje, a CII, amely a pRE promoter helyén hat, kulcsfontosságú a 35 represszor létrehozásában, és hogy a többi oR helyhez (oR2 és oR1) kötődő Cro csökkenti a CII termelést. Ez ugyanúgy lehetővé teszi, hogy a döntő verseny a Cro és a CII között legyen, ahol az oR3 legfeljebb kiegészítő szerepet tölt be.

A végleges kísérletek még hátravannak. A kapcsoló átfogó modellezése elérhető 36 , amely megegyezik a lizogenizációs frekvenciákról publikált adatokkal az átlagos fágbevitel függvényében 37 . A kapcsoló összetett szabályozása a 3. ábrán látható. Ebben az úttörő munkában azonban a legtöbb kinetikai paraméter becslés, nem pedig közvetlen mérés. Ez a munka aláhúzza a teljes sejt fiziológiájának modellezésének lehetőségét a jelenlegi nagy áteresztőképességű transzkripciós sebességre és fehérjebőségre vonatkozó adatokkal. Még mindig hiányzik egy teljes modell, amely megjósolja a represszorkoncentráció erős túllövését, amelyet a lizogenizáció során figyeltek meg34. Mivel a CII-stimulált pRE-ből származó represszor szintézis sebessége sokkal magasabb, mint a lizogénben megfigyelhető, valószínűtlennek tűnik, hogy az oR3-hoz kötődő Cro megakadályozza a represszor kialakulását, ha a CII szintézis eléri a maximális sebességét.

Fágterápia. Felfedezésüket követően a fágokat a patogén baktériumok elleni küzdelem lehetséges ágenseinek tekintették (ahogyan Merril is tárgyalta et al. 38). A legtöbb korai fágterápiás kísérlet sikertelen vagy eredménytelen volt, nyilvánvalóan triviális technikai okok miatt, mint például a placebokontroll hiánya vagy az injektált fág gyors kiürülése a véráramból, mielőtt elérte volna a kitűzött célt38,39. Az antibiotikumok megjelenésével a fágterápia fejlesztése és alkalmazása szinte eltűnt a nyugati világból, bár a Szovjetunióban és Kelet-Európában folytatódott 39 . Mivel az antibiotikum-rezisztencia előfordulási gyakorisága folyamatosan növekszik, a területet újraaktiválták 38 . A fágterápiának van néhány eredendő előnye az antibiotikumokkal szemben, mind a specifikusságban, mind a szer kívánt helyen való elterjedésének képességében (olyan előnyök, amelyeket a szennyezett fágkészítményekkel végzett korábbi munkák során ritkán realizáltak) 39 . Az antibiotikumokhoz hasonlóan a hatékonyságot a bakteriális mutáció korlátozza, ami kétségtelenül nagy kihívást jelent majd a jövőbeli fejlődés számára.

Jelenleg a fágterápia ígéretesnek mondható, de hosszú története ellenére még teljes mértékben bizonyítani kell, hogy képes-e beváltani az ígéretet. A kísérletileg fertőzött állatokkal azonban egyértelmű sikereket értek el 40,41, és a matematikai modellezés megerősíti a megvalósíthatósággal kapcsolatos elvárásokat 42 . A korábbi munkák nagy része viszonylag nyers és kevésbé ellenőrzött volt, és az egész területet alapos értékelés nélkül elbocsátották (főleg az antibiotikum-terápia elérhetősége és gazdaságossága miatt). Most még szigorúan foglalkozni kell a számos lehetséges problémával, mint például maguknak a fágoknak a káros hatásaival, a fágok inaktiválásával az antitestek semlegesítésével és a fágrezisztens mutánsok keletkezésével.

A fágok, mint kártevők az élelmiszeriparban. Más területeken, ahol a baktériumok túlélése szükséges a nem teljes sterilitás mellett, például az ipari fermentációban, a fágok az ellenségek. A tejsavbaktériumok fág lízise régóta zavaró a sajtgyárakban. A tejsavbaktériumokat megfertőző fágokkal kapcsolatos kiterjedt vizsgálatok sok országban folynak 43,44,45. A probléma kiküszöbölésére irányuló kutatások hosszú ideje „szent grálja” olyan stabil bakteriális mutánsok izolálása vagy megtervezése volt, amelyek rezisztensek minden olyan fágra, amely megtámadhat egy adott kultúrát46,47.

Phage display könyvtárak. Számos alkalom van, amikor a molekuláris biológusok a fehérjék vagy peptidek nagy gyűjteményéből szeretnék azonosítani azokat a keveseket, amelyek valamilyen különleges tulajdonsággal rendelkeznek (például egy kis molekulatömegű LIGAND-hoz vagy egy fehérje vagy DNS meghatározott helyéhez kötődnek). molekula). Könnyű frakcionálni a gyűjteményt a kötési tulajdonságai alapján, de ha egy kötőfaj ritka, akkor nem lehet praktikus elegendő anyagot elkülöníteni a szerkezetének meghatározásához.

Ilyen esetekben célszerű nem a fehérjét vagy peptidet izolálni, hanem az azt kódoló és könnyen amplifikálható DNS-t. Ennek legegyszerűbb módja egy olyan rendszer, amelyben a frakcionálási folyamat a DNS-t az általa kódolt fehérjével együtt hozza. A baktériumsejtek felületi antigénjei így kezelhetők.

Hatékonyabb módszer a fehérje vagy peptid megjelenítése egy fág felszínén. A fágrészecskék sokkal kisebbek, mint a baktériumok, így nagyobb könyvtárak szűrhetők. Ha a könyvtár TRANSLATIONAL FUSIONS-ből áll egy fehérjéhez, amely bőségesen fordul elő egy fágrészecske felületén, akkor az érzékenység egyszeri fertőzés körülményei között magas, a fágrészecske kötési tulajdonságait a DNS-ében lévő génfúzió határozza meg.

A legújabb példák közé tartoznak a humán patogén felületi antigénjeinek doménjeinek fúziói Neisseria meningitidis a T4 fág felszíni fehérjére, vakcinakészítésben való lehetséges felhasználásra, és véletlenszerű öt aminosavszekvencia fúziójával, hogy azonosítsák a T4 DNS-t a csomagoláshoz hasító nukleáz lehetséges kötőpartnereit48,49.

Fágok bakteriális patogenitásában

Korán felfedezték, hogy néhány fontos bakteriális betegségben, mint például a diftéria 50 és a botulizmus 51 , a patogenitás bizonyos profágok jelenlététől függ, amelyek általában toxinokat kódolnak. Fokozatosan gyűlt a tudás, de a terület az utóbbi időben legalább két okból kivirágzott. Először is, az eukarióta sejtbiológia és a bakteriális génszabályozás fejlődése lehetővé teszi a patogén baktériumok és az emberi sejt közötti kölcsönhatás mélyebb megértését. Másodszor, a patogén baktériumok teljes genom szekvenálása nemcsak a prófágok, hanem a potenciálisan fágokkal kapcsolatos patogenitási szigetek előfordulását is feltárta. Így a fágok által közvetített betegségek mélyreható tanulmányainak kerete kidolgozott52,53.

Könnyebb megjósolni a mechanisztikus tanulmányok jövőjét, mint az evolúciós tanulmányoké, amelyekben számos vizsgálódási vonal találkozik. Még a teljes genom szekvenálás szempontjából is alábecsülhető a lizogén prevalenciája, mivel a próféták azonosítása homológiát igényel az ismert fágokkal. Régóta ismert az is, hogy a komplett prófágok, amelyek plakkképző részecskéket képesek létrehozni, gyakran nem teljes (hibás) profágokká bomlanak a pontmutációktól a kiterjedt deléciókig és/vagy inszerciókig terjedő változások révén. A hibás fágok egy bizonyos típusa – speciális transzdukáló fágok – a kromoszómából való hibás kivágás eredménye lehet, amely a fág DNS egy részét az inszerciós hellyel szomszédos gazda-DNS-sel helyettesíti54. Ez az egyik olyan mechanizmus, amellyel a fágok toxingéneket szerezhettek. Egy másik a toxingének közvetlen beépítése a fág DNS-be, amely transzpozon által közvetített lehet. Ez utóbbi lehetőség valószínűbb, ha a toxin gén nem a profág végén, hanem a közepén található, mint például a λ-rokon 933W kolifágban, amely egy Shiga-szerű toxint 55 kódol.

A bakteriális patogenitás evolúciója csak a fágok és a patogenitási szigetek szerepének figyelembevételével érthető meg. A prófészok és a patogenitási szigetek úgy tűnik, hogy szorosan összefüggenek, azonban a kapcsolat természetére vonatkozó feltételezések koraiak lehetnek. A patogenitási szigetek a DNS szélesebb kategóriájába tartoznak, amelyeket specializációs szigeteknek neveznek. A specializációs szigetek összefüggő gének blokkjai, amelyeket több kritérium különböztet meg. Először is, egy közös funkciónak vannak szentelve, mint például a patogenitás, amelyre nincs közvetlenül szükség az egyszerű túléléshez. Másodszor, különböznek a környező DNS-től olyan molekuláris statisztikákban, mint a G+C tartalom, a kodonhasználat és a szomszédos kapcsolatok. Harmadszor, jelen vannak a baktériumfajok bizonyos törzseiben, míg másokban hiányoznak. Széleskörű előfordulásukra csak a teljes genom szekvenálása során derült fény, és molekuláris statisztikáik azt mutatják, hogy az ilyen elemeket a viszonylag közelmúltban más baktériumfajokból származtatták, amelyekben esetleg őshonosak 56 . A most megfigyelt fajoknak csak bizonyos törzseiben való interkalációjuk egy inszerciós mechanizmus működését jelzi, mint például a fágintegráció vagy a TRANSPOSITION is, egyes szigeteket fág-inszerciós helyek szegélyezik, ami technikailag az egész egységet minősíti, bármilyen legyen is. történeti eredetű, mint hibás próféta 57,58 .

Ez számos kérdést vet fel a jövőbeli kutatások számára. Az egyik forgatókönyv (talán túlságosan is egyszerű) az, hogy az egész egység a származási fajban a gazdaszervezet és a fág DNS átrendeződése révén keletkezett, és bekerült abba a fajba, amelyben most találjuk, fágburokba csomagolva, majd injekcióval és lizogenizáció, és hogy jelenlegi gazdaszervezetében fertőzés és lizogenizáció révén egyik törzsből a másikba kerül. Jelenleg rendkívül kevés bizonyíték áll rendelkezésre annak bizonyítására, hogy a törzsek közötti átvitel ezzel a módszerrel történik, nem pedig olyan genetikai rekombinációs mechanizmusok révén, amelyek az összes kromoszómális gént érintik.

A másik végletben azt képzelhetjük, hogy a patogenitási szigetek más, idegennek minősített 59 génekhez hasonlóan más mechanizmussal (talán TRANSFORMÁCIÓS vagy KONJUGÁCIÓS) mozoghatnak a fajok között, és transzpozícióval vagy más mechanizmussal beépülhetnek a befogadó kromoszómába. . Ezen a képen az ilyen idegen DNS gyakran megtalálható a profágokban vagy a hibás profágokban, pusztán azért, mert bakteriális szempontból a prófészok ócska DNS-t alkotnak, amelynek megzavarása nem befolyásolja a baktériumok túlélését. Úgy tűnhet, hogy a sziget-DNS beillesztése egy már létező prófágba szükségtelen lépést jelent az eredet mechanizmusában, de ez nem így van. A sziget-DNS beépülése a környező fágokhoz kapcsolódó DNS-be valahol valamikor megtörténhetett, és mostanában gyakran nincs nyoma az ismert inszerciós folyamatoknak, például a transzpozíciónak.

A további munkának két megoldatlan kérdést kell megvilágítania. Először is, ha ez és más „idegen” DNS néhány távoli rokon donor baktériumfajtól származik, mi volt a donor? Az eddig szekvenált baktériumgenomok csak néhány példát szolgáltatnak az oldalirányú transzferre, amelyből mind a donor, mind a recipiens következtethet – talán egyszerűen azért, mert még nem szekvenáltak elegendő baktériumot. Másodszor, az elem potenciális mobilitása jelenlegi gazdájában jelentős tényező a betegségek epidemiológiájában?

Egy tudományterület érdeklődése kevésbé abból származik, amit tudunk, mint a megválaszolatlan kérdésekből, amelyek a rendelkezésre álló módszerekkel megközelíthetőnek tűnnek. Megpróbáltam itt néhány ilyen kérdést jelezni, amelyek közül sok évek óta lappang, és több bizonyítékon keresztül tárták fel, mint amennyit meg lehetne vitatni. Mindazonáltal megérett az idő arra, hogy tökéletesített módszerekkel keressük a végleges válaszokat.A jövőbeli kutatásoknak ki kell terjedniük a molekuláris mechanizmusok szigorú demonstrálására, a fágok bioszférára gyakorolt ​​globális hatásának vizsgálatára, valamint a bakteriális gazdaszervezetek evolúciójának vizsgálatára.


Köszönetnyilvánítás

Kutatás a G.P.C.S. laboratóriumában. az Egyesült Királyság Biotechnológiai és Biológiai Tudományok Kutatási Tanácsa (BBSRC) és a Cambridge Trusts támogatásaiból, valamint az Általános Mikrobiológiai Társaság, az Alkalmazott Mikrobiológiai Társaság és a British Society for Plant Pathology pénzügyi támogatásából származik. Kutatás a P.C.F. laboratóriumában. támogatja a Marsden Fund, a Royal Society of New Zealand (RSNZ), a PCF Rutherford Discovery Fellowship (RSNZ), az Otago Egyetem Kutatási Ösztöndíja, az Otagoi Orvostudományi Iskola kutatási hagyatéki alapja és a Bio- Védelmi Kutatási Kiválósági Központ. A szerzők köszönetet mondanak R. Dy-nek, hogy segített néhány ábra elkészítésében, és R. Staalsnak a kézirathoz fűzött megjegyzéseket. A szerzők elnézést kérnek a sok fágkutatótól, akik jelentős hozzájárulását helyszűke miatt nem tudták idézni.


Genomszerkesztés: mi ez, és mit jelent a jövőnk számára

Ma reggel arra ébredve, hogy Emmanuelle Charpentier és Jennifer A. Doudna „genomszerkesztési módszer kifejlesztéséért” kapott Nobel-díjat, megerősíti munkájuk fontosságát, és felveti a genomszerkesztés jövőjét illetően. és talán minden élet a Földön. Hétköznapibb, de még mindig nagyon jelentős szinten, a Charpentier és Doudna díjának odaítélése – néhány tudományos riválisuk bevonása nélkül – hatással van a genomok példátlan pontossággal és hatékonysággal történő módosításának képességével kapcsolatos hosszú távú vitára. A díjat különösen az úgynevezett CRISPR/Cas9 genomszerkesztési mechanizmus felfedezéséért ítélték oda, amely ezt az úttörő tudományos fejlődést a valaha kifejlesztett legnagyobb biológiai módszertanok közé sorolja.

Mi valójában a CRISPR/Cas9?

Íme, az alapok: A CRISPR a „cluster rendszeresen interspaced short palindromikus ismétlődések” rövidítése, és a CRISPR-hez kapcsolódó fehérjével (CAS) és az úgynevezett „guide RNS-sel” együtt a genom szerkesztésére szolgál.

A genom a sejtben található teljes DNS, és általában ez a DNS olyan gének formájában van, amelyek olyan fehérjékként fejeződnek ki, amelyek valójában struktúrákat alkotnak, és elvégzik az élet munkáját. Az RNS egy intermedier a DNS és a fehérjék között. A génexpresszió normális folyamata az, amikor a génekben lévő DNS RNS-vé íródik át, amely aztán egy specifikus fehérjévé alakul. Ezt a „molekuláris biológia központi dogmájának” nevezik, és tömören leírja, hogyan fejeződnek ki a gének fehérjeként, és hogyan működik nagyjából az összes élet a Földön.

Ennek az átfogó folyamatnak vannak alternatívái és változatai, valamint olyan mechanizmusok, amelyek a molekuláris biológia különböző aspektusait alkalmazzák vagy kiaknázzák. A CRISPR a genom végleges megváltoztatásának atipikus módja, és bár a természetes folyamat, amely a CRISPR-t létrehozta, védekező mechanizmusként fejlődött ki, amellyel a baktériumok megakadályozhatják az úgynevezett bakteriofágok (baktériumokat megfertőző vírusok) általi fertőzést, a természetesen előforduló folyamat ma már felhasználva minden típusú genom megváltoztatására, beleértve a sajátunkat is. Ha a megfelelő CRISPR/Cas9 komponensekkel összefüggésben egy olyan gén egy részével azonos, megfelelően megtervezett irányító RNS-t vezetünk be, amelyet meg akarunk célozni a sejt megzavarása érdekében, a célgén eltávolítását eredményezi. Ilyen egyszerű lehet.

Charpentier és Doudna Nobel-díjának odaítélése megerősíti úttörő és alapító munkájuk alapvető fontosságát. Bár sok más kutató is hozzájárult a felfedezés és feltalálás eme folyamatban lévő történetének kritikus mérföldköveihez, Charpentier és Doudna szerepét elismerték a CRISPR által közvetített genomszerkesztés mögött meghúzódó, természetesen előforduló biológiai folyamatok mechanizmusának megértésében, valamint bizonyos esetekben. az első biotechnológiai fejlesztések ezen a területen. Számos különböző CRISPR-alapú technológia fejlesztése és forgalmazása folyik az élelmiszertudománytól az orvostudományig és azon túl is.

Már fejlesztenek olyan CRISPR-alapú génterápiákat, amelyek törölhetik a betegséget okozó mutáns géneket a fájdalmas és végzetes állapotokban szenvedő emberekből. Ezenkívül a CRISPR felhasználható más élőlények genomjának precíz módosítására – például a növények természetes védelmére a kártevőktől, a hozam javítására vagy más jellemzők javítására. Fontos, hogy a CRISPR bizonyos élelmiszernövényeken történő alkalmazásait megkímélték az egyes géntechnológiával módosított szervezetek (GMO-k) által kiváltott szabályozási kérdésektől, mivel az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma (USDA) kizárja azokat a genetikai változásokat, amelyek a hagyományos nemesítési folyamatok során következhettek be, bár sok esetben. lassabb és munkaigényesebb divat.

Más alkalmazások sokkal vitatottabbak voltak, mint például a CRISPR alkalmazása a születendő gyermekek genomjának végleges megváltoztatására Kínában, annak reményében, hogy immunissá teszik őket a HIV-fertőzéssel szemben, az AIDS-t okozó vírussal szemben. Ez börtönbüntetést eredményezett a felelős vezető tudós számára. Ezenkívül ez egy kritikus fontosságú, az emberi genom szerkesztésének etikájával kapcsolatos vita további fejlődéséhez is vezetett. Különösen úgy tűnik, hogy ezek az események megerősítették azt a konszenzust a tudósok között világszerte, hogy teljes mértékben el kell kerülni az emberi genom olyan változásait, amelyek átörökíthetők a következő generációkra.

A genomban a szaporodás során továbbvihető változtatások javasolt korlátozásának egyik oka a genom előre nem látható változásainak lehetősége, ha genomszerkesztést alkalmaznak. Egy legyengítő genetikai betegségben szenvedő személy esetében előfordulhat, hogy a genommódosítás megengedhető, míg ugyanezek a változtatások nem engedélyezhetők a következő generációkban.

Egyes közelmúltbeli munkák kérdéseket vetettek fel a CRISPR alkalmazásának lehetséges kockázataival kapcsolatban, beleértve ezeket az úgynevezett off-target hatásokat, ahol a genom más területei potenciálisan katasztrofális károkat szenvedhetnek. Ezen túlmenően, mivel egyes CRISPR-alkalmazásokban a Cas9 enzimek forrásaként használt baktériumok emberi kórokozók lehetnek, lehetséges, hogy egyes emberek immunrendszere fel van készülve a genomszerkesztési gépezet, a ráncok elleni küzdelemre. ami jelentősen akadályozhatja a javasolt orvosi alkalmazásokat. Természetesen más hagyományos terápiákhoz, például a szervátültetéshez hasonlóan az immunrendszer működését csökkentő gyógyszerek is alkalmazhatók a probléma enyhítésére.

A Nobel-díj Charpentiernek és Doudnának történő odaítélése demonstrálja az alapvető biológiai kutatások erejét és lehetőségeit, és megerősíti, hogy még a legerősebb alkalmazások is az alaptudományon nyugszanak. A szellemi tulajdonjogi viták, a szabadalmi harcok, valamint a gyógyszerészeti és biotechnológiai alkalmazásokból származó bevételek minden bizonnyal meggyőző és fontos aspektusai a kutatás-fejlesztési környezetnek, de tudományos és tudományos szempontból a Nobel-díj Charpentier és Doudna elismerését biztosítja, amelyet minden bizonnyal megérdemelnek.


Az intronokban található enhancerek bőségesek, és jelentős szerepet játszanak az emlősfajok génexpressziójának szabályozásában. Ezzel szemben a növényekben található intronfokozók funkciói nagyrészt még feltáratlanok, és csak néhány növényi intronfokozót jelentettek. Elvégeztük az intronikus erősítők genomszintű előrejelzését Arabidopsis thaliana DNáz I szekvenáláson alapuló nyílt kromatin aláírások használatával. A palántaszövetben 941 jelölt intronfokozót azonosítottunk, amelyek 806 génhez kapcsolódnak, és 1271 intron fokozót, amelyek 1069 génhez kapcsolódnak virágszövetben. Az előre jelzett intron-fokozók közül 15-nek (71%) validáltuk a transzgenikus vizsgálatokban riportergén segítségével. A CRISPR/Cas segítségével két különböző génhez kapcsolódó három intronikus enhanszer deléciós vonalait is létrehoztuk. Ezeknek az enhanszereknek a törlése, amelyek átívelnek a kulcsfontosságú transzkripciós faktor kötőhelyeket, nem szüntette meg a génexpressziót, de a rokon génjeik transzkripciós repressziójának különböző szintjét okozta. Figyelemre méltó, hogy a deléciós vonalak transzkripciós repressziója bizonyos fejlődési szakaszokban fordult elő, és eltérő fenotípusos hatásokat eredményezett a növények morfológiájában és fejlődésében. Nyilvánvaló, hogy ez a három intronikus fokozó fontos a rokon génjeik szövet- és fejlődésspecifikus expressziójának finomhangolásában.

Oxford Academic fiók

E-mail cím/felhasználónév

A legtöbb felhasználónak az e-mail címével kell bejelentkeznie. Ha eredetileg felhasználónévvel regisztrált, kérjük, használja azt a bejelentkezéshez.


Elsődleges szerkesztési technológia és jövőbeli alkalmazásai a növénybiológiai kutatásban

A növénybiológiában számos alkalmazás megköveteli a genomok pontos szerkesztését, beleértve a pontmutációk korrekcióját, az egynukleotidos polimorfizmusok (SNP-k) beépítését és a többnukleotidos inszerció/deléciók (indelek) bevezetését a genom egy előre meghatározott pozíciójába. Az ilyen típusú módosítások lehetségesek a meglévő genom-szerkesztő technológiák, például a CRISPR-Cas rendszerek használatával, amelyek megkövetelik a kettős szálú törések indukálását a cél-DNS-helyen, valamint a kívánt szerkesztési szekvenciát tartalmazó donor DNS-molekulát. Azonban a növényekben a homológ rekombináció alacsony gyakorisága és a donor DNS-molekulák szállításának nehézsége rendkívül hatástalanná teszi ezt a folyamatot. Az alapszerkesztésnek nevezett technológia egy másik fajtája is precíz szerkesztést végezhet, azonban csak bizonyos típusú módosítások érhetők el, például C/G-T/A és A/T-G/C. A közelmúltban egy új típusú genomszerkesztési technológiát fejlesztettek ki, amelyet „prime editing” néven emlegetnek, és amely különféle típusú szerkesztéseket képes megvalósítani, például bármilyen bázis-bázis konverziót, beleértve mindkét átmenetet (C→T, G→). A, A→G és T→C) és transzverziós mutációk (C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A és T→G), mint valamint kis indelek anélkül, hogy a DNS-ben kétszálú szakadást kellene előidézni. Mivel az elsődleges szerkesztés nagy rugalmassággal rendelkezik a genom különböző típusú szerkesztéseinek eléréséhez, nagy lehetőségeket rejt magában a kiváló termények kifejlesztésében különféle célokra, például a terméshozam növelésére, a különböző abiotikus és biotikus stresszekkel szembeni rezisztencia biztosítására, valamint a növényi termékek minőségének javítására. Ebben az áttekintésben leírjuk az elsődleges szerkesztési technológiát, és megvitatjuk korlátait és lehetséges alkalmazásait a növénybiológiai kutatásokban.

1. Bemutatkozás

A genomszerkesztés területén óriási előrelépés történt az elmúlt néhány évben. Nem létezik azonban olyan „mindent az egyben” tökéletes genom-szerkesztési technológia, amely bármilyen kívánt szerkesztést el tud érni a cél-DNS-ben, nemkívánatos hatások nélkül [1]. A meglévő genomszerkesztési technológiák egyik legnagyobb kihívása, hogy nem képesek egyidejűleg többféle szerkesztést bevinni, mint például kis inszerciók/deléciók (indelek) és egy nukleotid szubsztitúciók a cél DNS helyeken [2–8]. Az ilyen típusú módosításokat végrehajtó genom-szerkesztő technológia óriási lehetőségeket rejt magában a termésjavítás és a nemesítés felgyorsításában [5, 9–13]. A növények precíz genomszerkesztése CRISPR-technológiákkal érhető el homológ rekombinációval (HR), amelyet a kétszálú törés (DSB) indukálásával indítanak el a cél genomiális helyen, valamint a kívánt módosításokat tartalmazó donor DNS-templátot [14–18. ]. Azonban a HR gyakorisága növényekben rendkívül alacsony, és a donor DNS eljuttatása a célsejttípusokhoz kihívást jelent [19–21]. A HR alternatívája az alapszerkesztési technológia. A jelenlegi alapszerkesztési technológiák azonban csak szubsztitúciós mutációkat tudnak végrehajtani, csak négyféle módosítást tesznek lehetővé (C/G-T/A és A/T-to-G/C), és nem tudnak beillesztést, törlést, vagy transzverziós típusú szubsztitúció [22–24].

Anzalone et al. [25] nemrégiben kifejlesztett egy új genom-szerkesztési technikát, az úgynevezett elsődleges szerkesztést, amely képes leküzdeni a fent említett kihívásokat. Ez az új, úttörő genomszerkesztési technológia bevezetheti az indeleket és mind a 12 bázis-bázis konverziót, kevesebb nem szándékolt termékkel a megcélzott lókuszban, valamint kevesebb nem célpont eseményt [1, 3, 25]. A közelmúltban az elsődleges szerkesztést két növényfajra, a rizsre [2, 26–29] és a búzára [2] alkalmazták, jelezve, hogy ez a technológia óriási lehetőségeket rejt magában a növények genomszerkesztésében. Itt ismertetjük ezt a technológiát, megvitatjuk a szerkesztési hatékonyságot befolyásoló fontos paramétereket, perspektívákat adunk arra vonatkozóan, hogyan lehetne továbbfejleszteni ezt a technológiát egy „all-in-one” genom-szerkesztő technológia kifejlesztéséhez növények számára, és feltárjuk a növénybiológiai kutatások lehetséges alkalmazásait.

2. Az elsődleges szerkesztési technológia elve

Az elsődleges szerkesztőrendszer két összetevőből áll: egy tervezett elsődleges szerkesztési útmutató RNS-ből (pegRNS) és egy elsődleges szerkesztőből (PE) (1. ábra). A pegRNS-nek van egy spacer szekvenciája, amely komplementer a DNS egyik szálával, egy primer kötőhely (PBS) szekvenciával (

8-16 nt), és egy reverz transzkriptáz (RT) templát, amely tartalmazza a kívánt szerkesztési szekvenciát, amelyet reverz transzkripcióval a genomban a célhelyre kell másolni (1. ábra). A PE-nek van egy mutáns Cas9 fehérje, amely csak egy DNS-szálat képes elvágni, és Cas9 nikáz (Cas9n) néven ismert (1. ábra). A PE másik komponense egy RT enzim, amely elvégzi a szükséges szerkesztést (1. ábra). Egy stabilan vagy átmenetileg expresszált elsődleges szerkesztő konstrukció expressziójakor a PE és a pegRNS komplexet képez (1(a) ábra), amely azután a pegRNS által irányított cél DNS-helyre költözik (1(b) ábra). A célhelyen a Cas9n bevágja a DNS PAM-szekvenciáját tartalmazó egyik szálat, egy lebenyet generálva (1(c) ábra), majd a pegRNS PBS-je a bevágott szálhoz kötődik (1(d) ábra). Az RT-t, egy RNS-függő DNS-polimerázt ezután a pegRNS-ből származó szekvenciainformáció felhasználásával meghosszabbítják a bevágott DNS-szál meghosszabbítására, ami a kívánt szerkesztés beépülését eredményezi a DNS egyik szálába (1(e) és 1( ábra). f)). E reakció során a DNS bevágott szála kötődik a PBS-hez, és primerként működik a reverz transzkripció elindításához, ami a kívánt szerkesztés beépüléséhez vezet az RT templát régióból a PAM-tartalmú szálba. Miután a kívánt szerkesztés RT-mediált beépítése befejeződött a bevágott DNS-szálba, a szerkesztési terület két redundáns egyszálú DNS-lebenyet tartalmaz: egy szerkesztetlen 5-öt.

DNS lebenyek (1(g) ábra) és szerkesztett 3 DNS lebenyek (1(f) ábra) [3, 25]. Ezeket az egyszálú DNS-lebenyeket végül a sejtes DNS-javító rendszer dolgozza fel, és integrálja a genomba. A szerkesztés végén a bevágott DNS-szálat a szerkesztett szál helyettesíti a szekvenciainformáció pegRNS-ből történő másolásával, ami egy szerkesztett és egy szerkesztetlen szálat tartalmazó heteroduplex kialakulását eredményezi (1(g) ábra). Egy második bevágást végeznek a módosítatlan DNS-szálon egy szabványos vezető RNS használatával (1(h) ábra), amelyet végül a szerkesztett állomány információinak lemásolásával javítanak ki, ami a kívánt szerkesztés beépüléséhez vezet a DNS mindkét szálába (1. én)).

3. Az elsődleges szerkesztés hatékonyságát befolyásoló paraméterek

A növényi és emberi rendszerekben végzett előzetes vizsgálatok számos olyan tényezőt azonosítottak, amelyek befolyásolják az elsődleges szerkesztés hatékonyságát, beleértve az RT enzim forrását, az RT enzim hőstabilitását és kötőképességét a célhelyhez, az RT templát hosszát, a PBS szekvencia hosszát. , és a nicking sgRNS helyzete a módosítatlan szálban [2, 25–27]. Ezen tényezők közül a termostabilitás, az RT templát hossza és a célhelyhez való kötődési kapacitása szignifikáns hatást mutatott a szerkesztési hatékonyságra mind a növényi, mind az emberi sejtekben [2, 3, 25]. Egy humán és élesztősejteken végzett vizsgálat kimutatta, hogy a mutációk (D200N, L603W és T330P) az RT-ben, amelyek fokozzák annak aktivitását magas hőmérsékleten, akár 6,8-szorosára növelték az inszerciós és transzverziós típusú szerkesztések gyakoriságát a nem mutált RT-hez képest [25]. ]. Emellett az RT termostabilitását és a célhoz való kötődési kapacitását növelő mutációk a szerkesztési hatékonyságot is akár 3,0-szorosára javítják [25]. A különböző forrásokból származó különböző RT-k is eltérő szerkesztési hatékonyságot mutattak, amint azt [2] bizonyítja, hogy a karfiol mozaikvírusból (CaMV) kapott RT alacsonyabb szerkesztési hatékonysággal rendelkezik, mint a Moloney rágcsáló leukémia vírus (M-MLV). Nemrég beszámoltak arról, hogy az RT templát hossza erősen befolyásolta a szerkesztési hatékonyságot, különösen növényi sejtekben, míg a szerkesztési hatékonyságot nem javította jelentősen a PBS hosszának és a nicking sgRNS helyzetének megváltoztatása [2, 27]. A pegRNS másodlagos szerkezete és a PBS régió G/C tartalma szintén befolyásolhatja a szerkesztés hatékonyságát [25]. Így a különböző típusú pegRNS-ek és sgRNS-ek alapos tesztelésére lesz szükség a különböző szövetekben vagy sejtekben található célhelyek széles skálájával kombinálva, hogy optimalizálni lehessen a paraméterek elsődleges szerkesztéséhez növényekben.

A primer szerkesztésben kisebb gyakorisággal fordulnak elő célon kívüli hatások, mint a hagyományos CRISPR-Cas9 genomszerkesztő rendszerben [25, 26]. Ezt az alacsony célponton kívüli aktivitást a prime szerkesztésnek tulajdonították, amely magában foglalja a spacer szekvencia és a cél DNS közötti hibridizáció három lépését, beleértve a cél DNS és a pegRNS spacer régiója, a pegRNS PBS régiója és a szerkesztett DNS lebeny közötti hibridizációt. [3]. A hagyományos CRISPR-Cas génszerkesztő rendszerben csak a cél DNS és az sgRNS-ből származó protospacer közötti hibridizáció szükséges a szerkesztéshez, ami nagymértékben növeli a célon kívüli szerkesztés esélyét [30, 31].

A bázisszerkesztőkkel végzett korábbi tanulmányok azt találták, hogy a nick indukálása a módosítatlan DNS-szálban növeli a bázisszerkesztő rendszer szerkesztési hatékonyságát [22, 23, 32, 33]. Hasonló megközelítést teszteltek az elsődleges szerkesztésben is, a szerkesztési hatékonyság javulását csak az emberi és élesztősejtekben tapasztalták, a növényi sejtekben nem [2, 25, 27]. Nemrég beszámoltak arról, hogy a szerkesztési hatékonyságot befolyásolhatja a hőmérséklet, a szerkesztési hatékonyság (6,3%) 37 °C-on magasabb, mint az alacsonyabb hőmérsékleten (26 °C) (3,9%), ami arra utal, hogy az elsődleges szerkesztőrendszer teljesítménye javítható alternatív körülmények és hőmérsékletek tesztelésével [2]. Emellett a célhely szekvencia-kontextusa is nagymértékben befolyásolhatja a szerkesztés hatékonyságát [2, 25]. A rizs protoplasztban a szerkesztési hatékonyság nagyon változó a gén különböző célhelyein OsCDC48, nagyobb szerkesztési hatékonysággal a OsCDC48-T1 webhely (8,2%) a másik két oldalhoz képest OsCDC-T2 (2,0%) és OsCDC48-T3 (

0,1%) [2]. Egy másik közelmúltbeli tanulmány [27] hasonló eredményeket tárt fel, ahol azt találták, hogy a szerkesztési hatékonyság (1,55%) a rizs lókusznál OsDEP1 magasabb volt, mint a többi lókusznál (0,05-0,4%) (OsALS, OsKO2, OsPDS,OsEPSPS, OsGRF4, és OsSPL14). Más, a közelmúltban növényeken végzett tanulmányok [28, 29] szintén hasonló eredményekről számoltak be. Humán sejtekben csak a HEK293T vonal mutatott magas szerkesztési hatékonyságot (20-50%), míg a többi vizsgált vonal viszonylag alacsonyabb szerkesztési hatékonyságot (15-30%) [25]. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a szerkesztési hatékonyság változó a célhelyek és a különböző sejt- vagy szövettípusok között, például a csíravonal szerkesztése Arabidopsis.

Az elsődleges szerkesztőrendszer által generált mutációk típusai is változóak lehetnek, bizonyos típusú mutációk gyakorisága magasabb, mint a többinél, amint azt a legutóbbi jelentések mutatják [2, 26–29]. Nemrég jelentették, hogy a deléció (6 bp) gyakorisága akár 21,8% [27] és az inszerció (3 bp) akár 19,8% [29] is lehet, míg a pontmutációk gyakorisága 0,03% és 18,75% között volt rizsben. [2, 26–29]. A búzában a hasonló típusú mutációk gyakorisága alacsonyabb volt, mint a rizsben, különösen a pontmutáció gyakorisága, amely csak 1,4% volt, szemben a rizs 9,38%-ával [2]. Mind a 12 bázis-bázis helyettesítés esetében a szerkesztések gyakorisága 0,2 és 8,0% között mozgott [2].A növényekben kimutatták, hogy az indelek gyakorisága csökken a célzott inszerció vagy deléció hosszának növekedésével, a leghosszabb inszertált szekvencia és a leghosszabb deletált szekvencia 15 nt, illetve 40 nt hosszúságú [2]. Az 1. táblázatban foglaltuk össze a növényekben található különböző elsődleges szerkesztőrendszereket, azok jellemzőit és szerkesztési hatékonyságát.

4. A jelenlegi Prime szerkesztési technológia fő korlátai a növényekben

Annak ellenére, hogy az elsődleges szerkesztés jelentős áttörést jelent a növényi genomszerkesztésben, a technológia még gyerekcipőben jár, ezért további vizsgálatokra van szükség a benne rejlő lehetőségek teljes kihasználásához. A PE első fő korlátja az alacsony szerkesztési hatékonyság. Köztudott, hogy a PE szerkesztési hatékonysága (0,03-21,8%) a növényi sejtekben jóval alacsonyabb, mint az emberi sejtekben (20-50%) [2, 25-27]. Eddig az elsődleges szerkesztőrendszert csak korlátozott számú célgénen (huszonöt célgénen) tesztelték két egyszikű fajban (rizsben és búzában) növényekben [2]. Ezért szükség van a PE tesztelésére a növények szélesebb körén, beleértve a kétszikű fajokat is. Bár néhány céllókuszban jelentős szerkesztési hatékonyságot értek el (például 21,8% az OsCDC48-T1-ben), alacsonyabb szerkesztési hatékonyságról (0,05-0,4%) számoltak be más, növényekben vizsgált géncélpontokban [2, 26, 27]. Ezenkívül a búza, amely egy poliploid növény, alacsony szerkesztési hatékonyságot mutatott (1,4%), összehasonlítva a rizssel, amely egy diploid növény [2]. Az elsődleges szerkesztés második legfontosabb korlátja a rövid szerkesztőablak (azaz az RT-sablon hosszának mérete), amelynek szabványos mérete 12-16 nt [25]. Bár hosszabb szerkesztőablakokról (30-40 nt) számoltak be [2], a hosszú szerkesztőablakot használó elsődleges szerkesztés sikere a megcélzott genomiális régió szekvenciatartalmától függ, egyes célhelyek támogatják a hosszú szerkesztési ablakot, míg mások nem [2] ].

A jelenlegi elsődleges szerkesztési technológia fent említett két fő korlátjának leküzdése érdekében a jövőbeli tanulmányoknak az elsődleges szerkesztés tervezési elvének mélyreható megértésére, a szerkesztési hatékonyságot befolyásoló paraméterek optimalizálására és a szerkesztőablak kiterjesztésére kell összpontosítaniuk. Bár létezik néhány irányelv a növényi és állati sejtek elsődleges szerkesztési rendszereinek tervezésére [2, 25], az elsődleges szerkesztés tervezési elvét nem vizsgálták átfogóan. A jelenlegi ajánlások nagyon korlátozott számú genomiális lókusz (huszonöt endogén lókusz növényekben és 12 endogén lókusz emberi sejtekben) szerkesztéséből származó kísérleti adatokon alapulnak, beleértve az emberi sejtvonalakat, élesztősejteket, valamint a rizs és a búza protoplasztjait. [2, 25–27]. Az elsődleges szerkesztés tervezési elvének mélyreható megértéséhez és a szerkesztési hatékonyságot befolyásoló paraméterek optimalizálásához néhány fontos kérdést meg kell vizsgálni, beleértve a következőket: [1] Mennyire stabilak a pegRNS-ek? [2] Befolyásolja-e a célpont kromoszómális helyzete és a célhelyek szekvencia variabilitása a szerkesztés hatékonyságát? És [3] hogyan működik a PE rendszer? Az ezekre a kérdésekre adott válaszok kétségtelenül segítik az elsődleges szerkesztő jobb verzióinak megtervezését a szerkesztési hatékonyság növelése és a nagyobb genomiális régiók szerkesztési képességének bővítése érdekében.

Az üzemekben jelentett jelenlegi elsődleges szerkesztőrendszer egyszerre csak egy célhely módosítására használható. A növényekben azonban számos tulajdonságot több gén vagy QTL szabályoz [34–38]. Ezenkívül egy bioszintetikus vagy metabolikus útvonal aktiválása gyakran több gén egyidejű szerkesztését igényli. Ezért a jelenlegi elsődleges szerkesztőrendszer nem használható több gén egyidejű módosítására. Az elsődleges szerkesztés másik technikai korlátja az elsődleges szerkesztési konstrukció mérete (

20 kb), ami meglehetősen nagy, így nem hatékony a növényké alakítása. A kisebb méretű Cas9 ortológok, például a CasX [39] használata csökkentené az elsődleges szerkesztő méretét és megkönnyítené a PE bejuttatását a növényi sejtbe.

5. Az elsődleges szerkesztés lehetséges alkalmazásai a növénybiológiai kutatásokban

Az elsődleges szerkesztés rendkívüli képessége arra, hogy célzott szekvenciamódosításokat generáljon a genomban, számos lehetséges alkalmazási lehetőséget rejt magában a növénybiológiában (2. ábra). Ez magában foglalja, de nem korlátozódik az alapkutatásokra, mint például a génfunkciók nagy áteresztőképességű elemzése az annotáció javítására és a mesterséges genetikai diverzitás irányított evolúció általi generálása, valamint a gyakorlati alkalmazások, mint például a növények tervezése a hozam, a betegségekkel szembeni rezisztencia, az abiotikus stressz javítására. tolerancia, valamint a hasznos vegyszerek mennyiségének és minőségének növelése a növényekben. Az alábbiakban röviden ismertetünk néhány ilyen alkalmazást.

5.1. A génfunkció elemzése és szerkesztése a Prime Editing segítségével

A növények sejtfolyamatai gyakran genetikai hálózatokat foglalnak magukban. Számos növény teljes genom szekvenciája nyilvánosan hozzáférhető, de a genomszekvencia adatokban azonosított gének többségének funkciója továbbra is ismeretlen vagy hipotetikus, így szükség van génszerkesztési technológiák alkalmazására a génannotáció javítására. A hasznos agronómiai tulajdonságok genetikai manipulálásához pontos annotációra és összetett biokémiai vagy metabolikus utak pontos tervezésére van szükség. Ezért a posztgenomikus korszak egyik fő célja az összes gén funkciójának szisztematikus tisztázása az alany szervezetekben. A növényekben lévő gének funkcióinak kísérleti jellemzése megkönnyíti azok alkalmazását különféle alkalmazásokhoz, például a termésjavításhoz és a környezeti fenntarthatósághoz.

A jelenlegi genomszerkesztési technológiák, mint például a CRISPR/Cas9, hatékonyan képesek funkcióvesztéses mutánsokat generálni növényekben [40, 41], azonban a CRISPR/Cas9 korlátozott sikerrel járt a funkciónövekedési vizsgálatokban (2. táblázat). A CRISPR-aktiváció (CRISPRa) fokozhatja egyes gének transzkripciós sebességét, de ez a megközelítés nem hasznos, ha egy gén korai stopkodonok vagy missense mutációk jelenléte miatt nem működik. Az alapszerkesztés felhasználható a korai stopkodonok vagy missense mutációk korrigálására, azonban ez a megközelítés korlátozott rugalmassággal rendelkezik, azaz többnyire átmeneteket foglal magában. Mivel lehetővé teszi mind a 12 bázis-bázis szubsztitúciót, a prime szerkesztés bármilyen bázis szubsztitúciót létrehozhat, és így segít visszanyerni bármely mutált gén természetes funkcióját. A rizsmodell növényről beszámoltak arról, hogy az SNP-k közel 65%-a a kódoló szekvenciákon belül van [9]. A genomszintű asszociációs vizsgálatok (GWAS) folyamatosan új SNP-ket azonosítanak, amelyek a terméshozamhoz, a betegségekkel szembeni rezisztenciához, a sótartalom toleranciához, a szárazságtűréshez és sok más fontos agronómiai tulajdonsághoz kapcsolódnak a növényfajok széles körében [34–38]. A primer szerkesztés nagy lehetőséget kínál a GWAS által előre jelzett SNP-k vagy indelek működésének ellenőrzésére.

Alkalmazási területekElsődleges szerkesztésAlap szerkesztésCRISPR-Cas9TALEN-ekZFNs
Egypontos mutáció generálása✓ (HDR-en keresztül

” a „rendkívül nehéz vagy nem hatékony”, a „✓” a „képes”, a „×” pedig a „nem képes”.

5.2. Mesterséges genetikai sokféleség generálása irányított evolúció révén, a Prime Editing által közvetítve

Az irányított evolúció (DE), amely véletlenszerű mutáció(k) létrehozásának folyamata egy célgénben a genetikai diverzitás mesterséges létrehozása érdekében [42], egy másik olyan terület, ahol a főszerkesztő kulcsszerepet játszhat. Ez egy hatékony megközelítés egy meglévő gén teljesítményének javítására vagy új génfunkciók létrehozására, és széles körben alkalmazzák új enzimek, fehérjék és kívánt tulajdonságokkal rendelkező antitestek tervezésére [43]. A DE-t általában prokarióta rendszerekben, például baktériumokban vagy élesztőben valósítják meg [44]. Előfordulhat azonban, hogy egy bakteriális vagy élesztőrendszerben fejlődő fehérje más szervezetekben, például növényekben és állatokban nem ugyanazt a funkciót vagy viselkedést mutatja. Azt javasolták, hogy fehérjeevolúciós kísérletet kell végezni a célgazdaszervezetben [44]. A DE technológiái azonban még nem ismertek jól magasabb rendű eukarióta gazdaszervezetekben, például növényekben és állatokban. A CRISPR/Cas9 rendszer jelenleg az elsődleges genom-szerkesztő technológia, amelyet eukarióta szervezetekben használnak a DE-hez. A CRISPR/Cas9 által közvetített DE egy sgRNS-könyvtárat használ, hogy több véletlenszerű mutációt vigyen be a célgénekbe, amit a Cas9-indukált DSB-indukció segít elő, hogy mutáns populációt hozzon létre, amelyet azután szelektív nyomás alá helyeznek az evolúciót hordozó mutánsok fenotípusának értékelésére. génváltozatok [44]. Sajnos a CRISPR/Cas9 által közvetített genomszerkesztés által generált mutációk többsége valószínűleg a kereteltolódásos mutációknak köszönhető, nem pedig a keretben, mivel a sejtes DSB-javítás gyakran kis indelek keletkezését eredményezi a törési helyeken. Ez különösen akkor jelent problémát, ha a knockout mutánsok életképtelenek vagy nem örökölhetőek, ami a mutagenezis erejét elveszíti a szelekció során. Másrészt az SNP-k a leggyakoribb változatok egyetlen faj különböző egyedeiben, ami arra utal, hogy a szubsztitúciós mutációk generálása, különösen a funkciót növelő mutánsok előállításához, fontosabb, mint az irányított evolúcióhoz szükséges indelek létrehozása [44]. . A primer szerkesztés tehát nagyon hatékony megközelítés lehet erre a célra [45].

5.3. Kultúrnövények genetikai fejlesztése Prime Editing segítségével

A különféle biotikus és abiotikus stresszek, mint például a betegségek, a sótartalom, a szárazság és a hőség komoly kihívást jelentenek a növénytermesztés számára. Világszerte minden évben terméskiesést okoznak. A stressztűrő fajták fejlesztése jelenti a legfenntarthatóbb és legkörnyezetbarátabb módszert ezen stresszek enyhítésére. Az elsődleges szerkesztés nagy szerepet játszhat a stressztűrő képességet kifejező új termények kifejlesztésében. A technológia nagy pontossága miatt az elsődleges szerkesztés felhasználható mind a kódoló, mind a nem kódoló DNS-ek szerkesztésére, új lehetőségeket biztosítva a precíziós növénynemesítéshez az abiotikus és biotikus stresszekkel szembeni tolerancia növelése érdekében.

Az elsődleges szerkesztés egyik ígéretes alkalmazása a betegségekkel szemben ellenálló növények fejlesztése lehet. A növényi betegségekkel szembeni rezisztencia gének általában allél jellegűek, és csak egy vagy néhány nukleotidban változnak. Ismeretes, hogy az SNP-k miatti missense mutációk létezése miatt bizonyos allélek pszeudogéneket eredményeznek [46], ami a funkcióvesztés miatti fogékonysághoz vezet. Ha ezeknek a pszeudogéneknek a funkciója az elsődleges szerkesztéssel helyreállítható, ezek a gének képesek lehetnek betegségekkel szembeni rezisztenciát adni a haszonnövényekben. Alternatív megoldásként számos, nem vírusos kórokozókkal szemben rezisztens növényt jelenleg genomszerkesztéssel alakítanak ki az úgynevezett S gének célzott mutagenezisével, ami negatívan szabályozza a védekezést [47]. A primer szerkesztés hatékony megközelítést jelenthet az S gének inaktiválására azáltal, hogy korai stopkodonokat vagy nonszensz mutációkat vezet be a kódoló szekvenciába. Az S gének különböző növényfajok közötti funkcionális megőrzésének kihasználásával az elsődleges szerkesztéssel a legtöbb haszonnövényben tenyésztési értékű kívánt S-gén mutánsok hozhatók létre [46].

Az elsődleges szerkesztési technológia a betegségekkel szembeni rezisztenciát biztosító immunreceptorok repertoárjának gazdagítására is használható. Az immunreceptorok olyan növényi fehérjék, amelyek szabályozzák a kórokozók fertőzését és aktiválják a sejtes védekező válaszokat [48]. Az elsődleges szerkesztés felhasználható az új immunreceptorok megtalálásának és validálásának folyamatának felgyorsítására a növényi csíraplazmákban. Ezen túlmenően az elsődleges szerkesztés felhasználható az ismert immunreceptorok új változatainak kifejlesztésére irányított evolúció révén in planta. Ez kibővíti az ismert immunreceptor-gének arzenálját, amelyek a területen alkalmazhatók. Például a nukleotid-kötő leucinban gazdag (NLR) család fehérjék intracelluláris immunreceptorok nagy közösségét alkotják, amelyek a növény- és állatvilágban megtalálhatók [49–52]. Az NLR-ek gyakran úgy mutatják ki a kórokozó jelenlétét, hogy kötődnek a kórokozóból származó virulenciafaktorokhoz, majd közvetítik a gazdaszervezet célfehérjék módosítását [53]. Ezen gazdacélfehérjék némelyike ​​virulencia-célzott csaliként fejlődött [54]. Elsődleges szerkesztés alkalmazható a betegségészlelési és jelátviteli útvonal minden szakaszára a rezisztencia válasz hangolására. Például be Arabidopsis, a PSEUDOMONAS SYRINGAE 5-vel szembeni rezisztencia (RPS5) NLR fehérje aktiválja a védekezési választ [48]. Ez a védekezési válasz azonban a PBS1 csali kináz fehérje aktivitásától függ a növényben, amely az RPS5-höz való kötődéskor hasad, ami AvrPphB szekrécióját eredményezi a növényben. Pseudomonas syringae a növényi sejtbe [55]. Kimutatták, hogy a patogén proteázok, például az AvrRpt2 proteáz hasítási helyeinek megváltoztatásával Pseudomonas syringae és a fehérrépa mozaikvírusból származó Nla proteáz PBS1-ben az RPS5 rezisztencia spektruma más kórokozókra is kiterjeszthető [56]. Az immunreceptorok hasonló megváltozott specifitása és aktivitása PE-mediált DE megközelítésekkel is előállítható in planta. Mivel az elsődleges szerkesztés a mutációk széles skáláját képes végrehajtani, ez a technika felhasználható hasznos immunreceptor gének többféle változatának előállítására. A szintetikus biológiai kontextusban végzett funkcionális szűrés ezután alkalmazható a rezisztencia fenotípusokat biztosító génváltozatok azonosítására. Ez kiterjesztené az irányított molekuláris evolúció alkalmazását a növények betegségekkel szembeni rezisztenciájának fokozására.

A növények kórokozókkal szembeni rezisztenciájának javítása mellett az elsődleges szerkesztést a hasznos és/vagy szimbiotikus szervezetek közötti növény-mikroba kölcsönhatások területén is alkalmazni lehetne, összpontosítva a hasznos növény-mikroba kölcsönhatások alapjainak megértésére a fenntartható gazdálkodás kontextusában a jövőbeni élelmiszerigények kielégítése érdekében. [57]. A jótékony növény-mikroba kölcsönhatásokkal foglalkozó korábbi munkák jellemzően csak néhány modellfajra összpontosítottak [58]. Az elmúlt években kiterjedt molekuláris tanulmányokat végeztek a mikrobák által közvetített növényi előnyökről, hogy kiterjesszék a mikrobiom-mérnöki alkalmazások mezőgazdasági alkalmazását [59–63]. Az elsődleges szerkesztés kulcsfontosságú technológia lehet a növény-mikroba kölcsönhatások alapjainak megértésében, valamint a mezőgazdasági növények és mikrobák hasznos felhasználásának javításában. A jótékony tulajdonságokat szabályozó egyedi növényi vagy mikrobiális jelöltgének azonosítása elősegíthető elsődleges szerkesztő alkalmazásokkal. Azonban alapvető kérdések, amelyekkel foglalkozni kell, például, hogy a rizoszféra mikrobiota milyen molekuláris mechanizmusokat használ a növények válaszainak befolyásolására? Mely növényekben lévő gének segítenek a rizoszféra mikrobiótájának kialakításában? És hogyan kommunikálnak egymással a mikrobák és a növények? Ha ezeket a kérdéseket és más kérdéseket elsődleges szerkesztéssel megválaszolunk, az közvetlen kapcsolatot teremtene az agronómiai tulajdonságok és a növényi vagy mikrobiális gének között, felgyorsítva a mesterséges mikrobiális közösségek kialakítását a terméshozam javítása érdekében [57]. Az elsődleges szerkesztés egyik ígéretes alkalmazása például az effektormolekulák szerepének dekódolása a növényekben és a szimbiózisban részt vevő mikrobákban. Az egész genomra kiterjedő elemzés számos effektormolekulát azonosított, mint például a kis szekretált fehérjéket (SSP), amelyek döntő szerepet játszhatnak az egymás közötti szimbiózisban. Laccaria bicolor és Populus trichocarpa [64, 65]. Míg ezen SSP-k többségét a L. bicolor, közülük néhányat [15] kifejezetten erre találtak P. trichocarpa [64]. Bár a funkciója néhány SSP által kiválasztott L. bicolor dekódolása megtörtént [66–69], a legtöbb SSP szimbiózisban betöltött szerepét még nem határozták meg. Különösen a növények által kiválasztott SSP-k szerepe a szimbiózis közvetítésében a L. bicolor és P. trichocarpa jelenleg ismeretlen. A primer szerkesztés használható funkcióvesztési fenotípus generálására a nyárfa szerepének vizsgálatára (Populus spp.) szekretált SSP-k szimbiózisa során L. bicolor. Ha valamelyik növényi SSP hatással van a nyárfa szabályozására,Laccaria szimbiózis, az elsődleges szerkesztés felhasználható az SSP-k új verziójának megtervezésére a bioenergia-nyárfa és a kölcsönös gombák közötti kölcsönhatás javítására. L. bicolor [70–72].

A biotikus stressztűrőképességen túl az elsődleges szerkesztés is használható az abiotikus stresszekkel, például a sótartalommal, a szárazsággal és a hőstresszsel szembeni toleranciára alkalmas haszonnövények előállítására. Mivel az elsődleges szerkesztés precízen generálhat minden típusú alapkonverziót és vezérelheti a kis indeleket, ez a technológia ideális a cisz-szabályozó elemek (CRE) szerkesztéséhez, új tulajdonságváltozatok létrehozásához. A CRE-k nem kódoló DNS-régiók, úgynevezett promoterek és fokozók [73], amelyek szabályozzák a gének transzkripcióját [74], és kötőhelyeket tartalmaznak különböző transzkripciós faktorokhoz (TF) vagy más szabályozó fehérjékhez, amelyek befolyásolhatják a transzkripciót [75]. [76, 77] kimutatták, hogy a CRE-k mutációi megváltoztathatják a génexpressziós szintet, és felgyorsíthatják a növények háziasításának evolúciós folyamatát a transzkriptom tájképének átalakításával. Ezenkívül [78] azt találta, hogy a növények háziasításáért felelős mutációk csaknem fele a CRE-ben található. Végül egy közelmúltbeli tanulmány [79] feltárta, hogy a termény háziasításával összefüggő CRE-mutációk száma még annál is nagyobb, mint amennyit korábban [78] becsült. A CRE-k többnyire a gének promoterrégiójában találhatók, és jelenlétük, hiányuk vagy pozíciójuk változása a promoterrégióban szabályozza a génexpressziót, és indukálhatja, csökkentheti vagy kikapcsolhatja a génexpressziót [80]. Például feltételezett TF-ek OsERF922 és GhWRKY17 kötődnek a CRE szekvenciához GCC box (AGCCGCC) és W-box (TTGACC), ami érzékenységet eredményez az abiotikus stressz toleranciára, például a szárazságra és a sótartalomra [81, 82]. Ha ezeknek a feltételezett TF-eknek a kötőhelye a GCC-boxban és a W-boxban megváltoztatható, lehetséges lenne új szárazság- és sótűrő növények létrehozása. A W-boxon vagy a GCC-boxon belüli precíz egybázisú mutációk vagy indelek megszüntethetik a feltételezett TF-ek kötőhelyét, és javíthatják a szárazsággal és a sótartalommal szembeni toleranciát. Ban ben Arabidopsis thaliana, több gén (GST, P5CS, és POD SOD), amelyek részt vesznek a stresszreakcióban, egy TF negatívan szabályozza ANA069, amely kölcsönhatásba lép ezeknek a géneknek a CRE-jeivel, és specifikusan kötődik a C[A/G]CG[T/G] szekvenciához, és amikor a CRE magkötő szekvenciája mutálódott, a növények fokozott abiotikus stressztűrést mutattak [83]. A promóterrégiók véletlenszerű variációinak elsődleges szerkesztésével lehetségessé válhat új fenotípus és új QTL-ek generálása különféle tulajdonságokhoz, például hő- vagy szárazságtűréshez.Valójában egy tanulmány [84] kimutatta, hogy a promóterrégióban lévő mutációk fenotípusos variációk spektrumát hozhatják létre, és egyedi QTL-eket generálhatnak a paradicsom gyümölcsméretének és hozamának javítása érdekében. Korábban beszámoltak arról, hogy a génfunkció teljes elvesztése vagy növekedése gyakran mutatott káros pleiotróp hatásokat [78]. Másrészt, a CRE-k célzott mutációjának indukálásával egy pleiotróp hatások nélküli finomhangolt génexpresszió érhető el. Ezért a cisz-szabályozó elemek precíziós tervezése elsődleges szerkesztéssel új eszközt jelent a növénynemesítésben.

Végül az elsődleges szerkesztés alkalmazható a feltörekvő termények és növényi alapú alapanyagok fejlesztésére és felgyorsítására a kezdődő biogazdaságon belül. Például az elsődleges szerkesztés felhasználható a cellulóz és a hemicellulóz bioszintézisében részt vevő gének módosítására vagy mérnöki tervezésére, és ezáltal növelve a sejtfal poliszacharid tartalmát. Annak ellenére, hogy a cellulóz bioszintézisét növényekben régóta tanulmányozzák, a sejtfal bioszintézisének teljes molekuláris alapja még mindig kevéssé ismert [85–97]. Például még a modell üzemekben is, mint pl A. thaliana, a cellulóz bioszintézisében részt vevő enzimek többségét hipotetikus modellezés alapján azonosították, és a cellulóz szintézisben betöltött tényleges szerepük továbbra is ismeretlen [98–103]. Jelenlegi ismereteink a hemicellulóz bioszintéziséről még kevésbé átfogóak [104–106]. Az elsődleges szerkesztést használó jövőbeli tanulmányok a növényi sejtfal poliszacharidok bioszintézisének és genetikai manipulációjának megértésére összpontosíthatnak, hogy növeljék a poliszacharid alapanyagok számát a cellulóz alapú bioüzemanyagok és biotermékek fejlesztésében. Egy közelmúltbeli tanulmányban [86] megállapították, hogy a cellulóz bioszintézise a Arabidopsis negatívan érintette a FLAVINKÖTŐ KELCH ISMÉTLÉS, F-BOX 1 (FKF1) gén, ami azt sugallja, hogy a cellulóztermelés a funkció inaktiválásával javítható FKF1 gén. Egy gén funkciójának kiiktatása vagy inaktiválása növényekben a hagyományos genom-szerkesztő technológiákkal, például a CRISPR/Cas9 rendszerrel, DSB létrehozását követeli meg a genomban, ami káros hatással lehet a növények túlélésére, és így nem alkalmas precíz mérnöki üzemre. genom. Alternatív megoldásként az elsődleges szerkesztés nagyobb pontosságot és pontosságot kínál a CRISPR/Cas9 rendszerhez képest. Egy másik klasszikus példa arra, amikor egy hagyományos CRISPR/Cas9 rendszer nem képes a kívánt szerkesztéseket előállítani, a Populus tomentosa CELLULÓZSZINTÁZGÉN (PtoCesA4) gén, amely közvetlenül kapcsolódik a cellulóz bioszintéziséhez, és két SNP-t (azaz SNP-18 (T/A) és SNP-49 (C/A)) tartalmaz, megszüntetve a funkcióját [107]. A T/A vagy C/A mutáció korrigálása nem lehetséges CRISPR/Cas9 által közvetített genom-szerkesztő vagy bázisszerkesztő rendszerrel, míg az elsődleges szerkesztés ígéretet tesz az ilyen mutációk hatékony bevezetésére, amint azt a [2].

6. Következtetések és jövőképek

Különféle szerkesztőalkalmazások megvalósítása egyetlen technológiával, élő rendszerben a legmagasabb felbontási szinten komoly kihívást jelentett egészen az elsődleges szerkesztés megjelenéséig. A precíz genomszerkesztésben rejlő elsődleges szerkesztésben rejlő óriási lehetőségekkel valószínűleg gyors fejlődésnek lehetünk tanúi ennek az új technológiának a növénybiológiai kutatásban való kreatív felhasználásában a következő néhány évben. Azonban számos kihívást, például az alacsony hatékonyságot, a korlátozott szerkesztési ablakot, az ismeretlen sejt-, szövet- és fajspecifikusságot le kell küzdeni ahhoz, hogy kiaknázzuk az elsődleges szerkesztésben rejlő teljes potenciált a növénybiológiai alkalmazásokban.

A növényekben végzett elsődleges szerkesztés alacsony hatékonyságú az emberi sejtekhez képest. Az elsődleges szerkesztés alacsony hatékonysága összefügghet a pegRNS expressziós szintjével a növényekben. Az összes eddigi tanulmány, amely a növényi elsődleges szerkesztésről számolt be, RNS Pol III promotert, például U6 promotert használt a pegRNS expresszálására. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az RNS Pol II promoter, például a Cestrum sárga levél curling vírus (CmYLcv) promoter akár kétszeresére is javíthatja a CRISPR/Cas9 rendszer szerkesztési hatékonyságát növényekben. Ezért a szerkesztési hatékonyság javításának egyik módja lehet alternatív RNS polimeráz promoter, például CmYLcv vagy U3 alkalmazása a pegRNS expresszálására. Az elsődleges szerkesztés egyik fő korlátja a rövid szerkesztőablak (12-16 nt), amely korlátozza a nagy DNS-szegmensek beillesztését vagy törlését a megcélzott genomból. Így az elsődleges szerkesztési technológia jövőbeni fejlesztésének egyik fő fókusza a szerkesztőablak javításának vizsgálata lenne. Különösen azt kell megvizsgálni, hogy egyes célok miért támogatják a hosszú szerkesztési ablakokat, mások miért nem.

A fent említett két fő korlát (azaz az alacsony szerkesztési hatékonyság és a rövid szerkesztési időtartam) kezelése mellett a jövőbeli kutatásoknak azt is meg kell vizsgálniuk, hogy mikor nem működik a rendszer a várt módon. A célon kívüli szerkesztés, beleértve a genomra gyakorolt ​​nem kívánt hatásokat is, komoly kihívást jelent a korábbi genomszerkesztő technológiákban, például a CRISPR/Cas9 rendszerben. Bár az elsődleges szerkesztésnek kisebb a célon kívüli tevékenysége, mint a többi genom-szerkesztő technológiának [25], a jövőbeni munkára még szükség van annak érdekében, hogy az elsődleges szerkesztési technológia mellékhatásait tovább minimalizálják a növényekben a genomban történő szerkesztés nemkívánatos hatásainak aprólékos elemzésével. ideértve a célon kívüli szerkesztés genomléptékű vizsgálatát, valamint a sejtes hatás erős megértését.

Noha az elsődleges szerkesztés óriási rugalmassággal rendelkezik a különböző típusú mutációk eléréséhez, még mindig megköveteli a specifikus PAM szekvencia jelenlétét a célhelyen, ami nehézséget okoz a genom bármely kiválasztott helyének megcélzásában. A Cas9 fehérje új osztályának felfedezése, amely nagyobb plaszticitással rendelkezik a PAM követelményeihez képest, kiszélesítené a genom célzóhelyének hatókörét. Egy közelmúltban végzett tanulmány [108] egy olyan módosított Cas9 fehérjéről számolt be, amely a genom szinte bármely pontját megcélozza specifikus PAM-követelmény nélkül. Hasonló módosított Cas9 fehérjék tesztelhetők elsődleges szerkesztésben, hogy kiszélesítsék a genomban lévő célzórégiót. Ezenkívül egy korábbi génszerkesztő rendszer, például a CRISPR/Cas9 multiplexelhető több lókusz egyidejű szerkesztésére a növényben. Nem ismert azonban, hogy egy hasonló megközelítés működne-e az elsődleges szerkesztési üzemekben. Az egyik jövőbeli fejlesztésnek ezért a multiplex elsődleges szerkesztőrendszer fejlesztésére kell összpontosítania a növények számára, amely lehetővé teszi több lókusz egyidejű szerkesztését. Annak érdekében, hogy egyszerre több célpont lókuszban is szerkeszthető legyen, több pegRNS kombinálható egyetlen policisztronos transzkriptumban az endogén tRNS-feldolgozó rendszer segítségével, amint az az alábbi ábrán látható. Arabidopsis CRISPR/Cas9 rendszerhez [109].

Az elsődleges szerkesztési technológia fejlesztésének korai szakasza. Vannak bizonyos technikai korlátai, és további kutatásra van szükség a rendszer optimalizálásához az üzem számára. Itt kiemeltük a rendszer néhány fő korlátját, és adunk néhány javaslatot annak további javítására. Bizonyos technikai korlátok és kihívások ellenére nyilvánvaló, hogy a prime szerkesztés vezető szerepet fog játszani a számos genom-szerkesztési technológia között az alapvető növénybiológiai kutatások és a termésfejlesztés terén a közeljövőben.

Adatok elérhetősége

Kézirat benyújtása a BioDesign kutatás azt jelenti, hogy az adatok kérésre szabadon hozzáférhetők, vagy egy nyílt adatbázisban, például az NCBI-ban vannak letétbe helyezve. Ha az adatok archívumban vannak, adja meg a hozzáférési számot vagy egy helyőrzőt. Tartalmazzon minden olyan anyagot is, amelyet MTA-n keresztül kell beszerezni.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy jelen cikk közzétételével kapcsolatban nem áll fenn összeférhetetlenségük.

A szerzők közreműködései

MMH és XY fogant meg az ötlet. Az MMH vezette a kézirat megírását és lektorálását. GY, JGC, GAT és XY közreműködött a kézirat átdolgozásában. Minden szerző elfogadta a kézirat végleges változatát.

Köszönetnyilvánítás

A kézirat megírását a Center for Bioenergy Innovation (CBI), az Egyesült Államok Energiaügyi Minisztériumának (DOE) Kutatóközpontja támogatja a Tudományos Hivatal, a Biológiai és Környezetkutatási Hivatal (OBER), a Laboratórium által irányított kutatás és fejlesztés. (LDRD) programja, az Oak Ridge National Laboratory és a Genomic Science Program, az Egyesült Államok Energiaügyi Minisztériumának Tudományos, Biológiai és Környezetkutatási Hivatala a Növény-Mikroba Interfészek Tudományos Fókuszterület részeként (http://pmi.ornl.gov). ). Ezt a kéziratot az UT-Battelle, LLC írta az Egyesült Államok Energiaügyi Minisztériumával kötött DE-AC05-00OR22725 számú szerződés alapján. Az Oak Ridge Nemzeti Laboratóriumot az UT-Battelle, LLC kezeli az Egyesült Államok Energiaügyi Minisztériuma számára a DE-AC05-00OR22725 szerződésszám alatt. Az Egyesült Államok kormánya megtartja, a kiadó pedig a cikk közzétételre való elfogadásával tudomásul veszi, hogy az Egyesült Államok kormánya fenntart egy nem kizárólagos, kifizetett, visszavonhatatlan, világméretű engedélyt e kézirat közzétett formájának közzétételére vagy reprodukálására, vagy mások számára lehetővé teszi, hogy ezt megtegyék. , az Egyesült Államok kormányának céljaira. Az Energiaügyi Minisztérium a DOE nyilvános hozzáférési tervével (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) összhangban nyilvános hozzáférést biztosít a szövetségileg támogatott kutatások ezen eredményeihez.

Hivatkozások

  1. J. Yan, A. Cirincione és B. Adamson, „Prime editing: precision genome editing by reverse transcription”, Molekuláris sejt, vol. 77. sz. 2, 210–212. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  2. Q. Lin, Y. Zong, C. Xue és munkatársai, „Prime genome editing in rice and wheat”, Természet biotechnológia, vol. 38, sz. 5, 582–585, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  3. M. Marzec, A. Brąszewska-Zalewska és G. Hensel, „Prime editing: a new way for genome editing”, Trendek a sejtbiológiában, vol. 30, sz. 4, 257–259. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  4. H. Li, Y. Yang, W. Hong, M. Huang, M. Wu és X. Zhao: „Applications of genom editing technology in the targeted therapy of human betegségek: mechanizmusok, előrelépések és kilátások”, Jelátvitel és célzott terápia, vol. 5, sz. 1. o. 1, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  5. S. S. Bharat, S. Li, J. Li, L. Yan és L. Xia, „Alapszerkesztés a növényekben: jelenlegi állapot és kihívások”, The Crop Journal, vol. 8, sz. 3, 384–395. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  6. L. You, R. Tong, M. Li, Y. Liu, J. Xue és Y. Lu, „Advancements and akadályai CRISPR-Cas9 technológia a transzlációs kutatásban”, Molekuláris terápia – Módszerek és klinikai fejlesztés, vol. 13, 359–370., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  7. B. Roy, J. Zhao, C. Yang és munkatársai, „CRISPR/Cascade 9-mediált genomszerkesztés – kihívások és lehetőségek”, Határok a genetikában, vol. 9. o. 240, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  8. D. B. T. Cox, R. J. Platt és F. Zhang, „Therapeutic genome editing: prospects and challenges”, Természetgyógyászat, vol. 21. sz. 2, 121–131. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  9. W. Wang, R. Mauleon, Z. Hu és munkatársai, „Genomikus variáció az ázsiai termesztett rizs 3010 változatában” Természet, vol. 557. sz. 7703, 43–49. o., 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  10. D. F. Voytas és C. Gao, „Precíziós genomtervezés és mezőgazdaság: lehetőségek és szabályozási kihívások”, PLoS biológia, vol. 12, sz. 6, cikk e1001877, 2014. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  11. H. A. Rees és D. R. Liu: „Alapszerkesztés: precíziós kémia élő sejtek genomján és transzkriptumán”, Nature Reviews Genetics, vol. 19, sz. 12., 770–788. o., 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  12. R. Mishra, R. K. Joshi és K. Zhao: „Alapszerkesztés a termésekben: jelenlegi fejlesztések, korlátozások és jövőbeli következmények”, Plant Biotechnology Journal, vol. 18, sz. 1, 20–31., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  13. K. A. Molla és Y. Yang, „CRISPR/Cas-közvetített alapszerkesztés: technikai szempontok és gyakorlati alkalmazások”, Trendek a biotechnológiában, vol. 37. sz. 10, 1121–1142, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  14. H. Saika, A. Oikawa, F. Matsuda, H. Onodera, K. Saito és S. Toki: „A géncélzás alkalmazása magas triptofántartalmú rizs tervezett mutációs nemesítésére” Növényélettan, vol. 156. sz. 3, 1269–1277, 2011. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  15. D. A. Wright, J. A. Townsend, R. J. Winfrey Jr. és munkatársai, „High-frekvenciás homológ rekombináció növényekben cink-ujj nukleázok által közvetítve”, A Plant Journal, vol. 44, sz. 4, 693–705, 2005. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  16. R. Terada, Y. Johzuka-Hisatomi, M. Saitoh, H. Asao és S. Iida: „Gene targeting by homologous recombination as a biotechnological tool for ricefunctional genomics” Növényélettan, vol. 144. sz. 2, 846–856, 2007. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  17. K. D'Halluin, C. Vanderstraeten, E. Stals, M. Cornelissen és R. Ruiter: „Homológ rekombináció: a célzott genomoptimalizálás alapja olyan növényfajokban, mint a kukorica”, Plant Biotechnology Journal, vol. 6, sz. 1, 93–102. o., 2007. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  18. T. Van Vu, V. Sivankalyani, E.‐. J. Kim és munkatársai: „Nagyon hatékony homológia-irányított javítás CRISPR/Cpf1-geminivirális replikon használatával paradicsomban”, Plant Biotechnology Journal, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  19. J. Gil-Humanes, Y. Wang, Z. Liang és munkatársai, „High-efficiency gene targeting in hexaploid wheat using DNA replikons and CRISPR/Cas9”, A Plant Journal, vol. 89. sz. 6, 1251–1262, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  20. Y. Ran, Z. Liang és C. Gao, „Jelenlegi és jövőbeli szerkesztő reagens bejuttató rendszerek növényi genom szerkesztéséhez”, Tudomány Kína. Élettudományok, vol. 60, sz. 5, pp. 490–505, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  21. H. Puchta és F. Fauser: „Géncélzás növényekben: 25 évvel később”, The International Journal of Developmental Biology, vol. 57. sz. 6-7-8, 629-637, 2013. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  22. N. M. Gaudelli, A. C. Komor, H. A. Rees és munkatársai, „Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage”, Természet, vol. 551. sz. 7681, 464–471, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  23. A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer, J. A. Zuris és D. R. Liu: „Célbázis programozható szerkesztése genomiális DNS-ben kétszálú DNS hasítás nélkül”, Természet, vol. 533. sz. 7603, 420–424, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  24. K. Nishida, T. Arazoe, N. Yachie és munkatársai, „Célzott nukleotid szerkesztés hibrid prokarióta és gerinces adaptív immunrendszerrel”, Tudomány, vol. 353. sz. 6305, cikk aaf8729, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  25. A. V. Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis és munkatársai: „Search-and-replace genom editing without double-strand breaks or donor DNA” Természet, vol. 576. sz. 7785, 149–157. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  26. H. Li, J. Li, J. Chen, L. Yan és L. Xia, „Precise modifiations of mind exogén és endogén gének rizsben elsődleges szerkesztéssel”, Molekuláris növény, vol. 13. sz. 5, 671–674, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  27. X. Tang, S. Sretenovic, Q. Ren és munkatársai: „A növényi elsődleges szerkesztők pontos génszerkesztést tesznek lehetővé rizssejtekben” Molekuláris növény, vol. 13. sz. 5, 667–670, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  28. K. Hua, Y. Jiang, X. Tao és J.-K. Zhu: „Precíziós genomfejlesztés rizsben elsődleges szerkesztőrendszer segítségével”, Plant Biotechnology Journal, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  29. R. Xu, J. Li, X. Liu, T. Shan, R. Qin és P. Wei: „Development of plant prime-editing systems for precise genom editing”, Üzemi kommunikáció, vol. 1, sz. 3, cikk 100043, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  30. S. Chen, Y. Yao, Y. Zhang és G. Fan: „CRISPR rendszer: felfedezés, fejlesztés és célon kívüli észlelés”, Cellular Signaling, vol. 70, cikk 109577, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  31. F. Jiang és J. A. Doudna, „CRISPR-Cas9 struktúrák és mechanizmusok”, Biofizika Éves Szemle, vol. 46, sz. 1, 505–529. o., 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  32. Y. Zong, Y. Wang, C. Li és munkatársai, „Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-citidin deaminase fusion” Természet biotechnológia, vol. 35, sz. 5, 438–440, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  33. Y. Lu és J.-K. Zhu: „Célbázis pontos szerkesztése a rizs genomjában módosított CRISPR/cas9 rendszerrel” Molekuláris növény, vol. 10, sz. 3, 523–525, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  34. H. B. Chhetri, D. Macaya-Sanz, D. Kainer és munkatársai: „A Populus trichocarpa többtényezős genom-szintű asszociációs elemzése azonosítja a kulcsfontosságú polimorfizmusokat, amelyek szabályozzák a morfológiai és fiziológiai tulajdonságokat” Az új fitológus, vol. 223. sz. 1, 293–309. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  35. J. Zhang, Y. Yang, K. Zheng és munkatársai: „A genomra kiterjedő asszociációs vizsgálatok és az expresszión alapuló kvantitatív tulajdonságlókusz-elemzések feltárják a HCT2 szerepét a koffeoilkinsav bioszintézisében és a védekezésre reagáló transzkripciós faktorok általi szabályozásában Populusban” Az új fitológus, vol. 220, sz. 2, 502–516. o., 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  36. W. Muchero, K. L. Sondreli, J. G. Chen és munkatársai: „Az asszociációs térképezés, a transzkriptomika és a tranziens expresszió azonosítja azokat a jelölt géneket, amelyek növény-patogén kölcsönhatásokat közvetítenek egy fában” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 115. sz. 45, 11573–11578, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  37. B. R. Induri, D. R. Ellis, G. T. Slavov és munkatársai, „Identification of quantitative trait loci and jelölt gének kadmiumtolerancia in Populus” Faélettan, vol. 32. sz. 5, 626–638, 2012. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  38. K. L. McNally, K. L. Childs, R.Bohnert és munkatársai: „A genomszintű SNP-variáció a tájfajták és a modern rizsfajták közötti kapcsolatokat tárja fel” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 106. sz. 30, 12273–12278, 2009. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  39. J.-J. Liu, N. Orlova, B. L. Oakes és munkatársai: „A CasX enzimek az RNS-vezérelt genomszerkesztők külön családját alkotják” Természet, vol. 566. sz. 7743, 218–223. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  40. D. Liu, M. Chen, B. Mendoza és mtsai, „CRISPR/Cas9-mediált célzott mutagenezis a crassulacean acid metabolizmus növények funkcionális genomikai kutatásához” Journal of Experimental Botany, vol. 70, sz. 22, 6621–6629, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  41. D. Liu, R. Hu, K. J. Palla, G. A. Tuskan és X. Yang, „Advances and perspektívák a CRISPR/Cas9 rendszerek használatáról a növénygenomikai kutatásban”, A növénybiológia jelenlegi véleménye, vol. 30, 70–77. o., 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  42. H. Butt, S. S.-E.-A. Zaidi, N. Hassan és M. Mahfouz: „CRISPR-alapú irányított evolúció a termésjavítás érdekében” Trendek a biotechnológiában, vol. 38, sz. 3, 236–240. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  43. D. Bojar és M. Fussenegger: „A fehérjefejlesztés szerepe az emlősök szintetikus biológiájának orvosbiológiai alkalmazásaiban”, Kicsi, nem. cikk 1903093, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  44. Y. Zhang és Y. Qi: „A CRISPR lehetővé teszi az irányított evolúciót a növényekben” Genombiológia, vol. 20, sz. 1. o. 83, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  45. N. Capdeville, P. Schindele és H. Puchta, „Application of CRISPR/Cas-mediated base editing for directed protein evolution in növények”, Tudomány Kína Élettudományok, vol. 63. sz. 4, 613–616. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  46. K. Yin és J.-L. Qiu, „Genomszerkesztés a növénybetegségekkel szembeni rezisztencia érdekében: alkalmazások és perspektívák”, Philos Trans R Soc Lond B, Biol Sci, vol. 374. sz. 1767, cikk 20180322, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  47. C. C. N. van Schie és F. L. W. Takken, „Susceptibility genes 101: how to be a good host” A fitopatológia éves áttekintése, vol. 52. sz. 1, 551–581, 2014. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  48. O. X. Dong és P. C. Ronald: „Genetic engineering for betegségrezisztencia növényekben: közelmúltbeli haladás és jövőbeli perspektívák” Növényélettan, vol. 180, sz. 1, 26–38. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  49. X. Zhang, P. N. Dodds és M. Bernoux: „Mit tudunk a NOD-szerű receptorokról a növényi immunitásban?” A fitopatológia éves áttekintése, vol. 55, sz. 1, 205–229. o., 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  50. A. Bentham, H. Burdett, P. A. Anderson, S. J. Williams és B. Kobe: „Az állati NLR-ek szerkezeti betekintést nyújtanak a növényi NLR működésébe” A botanika évkönyvei, vol. 119. sz. 5, 698–702, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  51. X. Li, P. Kapos és Y. Zhang, „NLRs in növények”, Jelenlegi vélemény az immunológiában, vol. 32., 114–121. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  52. T. Maekawa, T. A. Kufer és P. Schulze-Lefert: „NLR funkciók a növényi és állati immunrendszerben: eddig és mégis olyan közel” Természet Immunológia, vol. 12, sz. 9, 817–826, 2011. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  53. J. D. G. Jones és J. L. Dangl: A növényi immunrendszer, Természet, vol. 444. sz. 7117, 323–329. o., 2006. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  54. R. A. L. van der Hoorn és S. Kamoun: „Az őrtől a csaliig: új modell a növényi kórokozók effektorainak észleléséhez” A növényi sejt, vol. 20, sz. 8, pp. 2009–2017, 2008. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  55. J. Ade, B. J. DeYoung, C. Golstein és R. W. Innes: „Növényi nukleotid kötőhely-leucinban gazdag ismétlődő fehérje közvetett aktiválása bakteriális proteáz által” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 104. sz. 7, 2531–2536, 2007. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  56. S. H. Kim, D. Qi, T. Ashfield, M. Helm és R. W. Innes: „Csalik használata a növényi betegségekkel szembeni rezisztencia fehérje felismerési specifitásának bővítésére” Tudomány, vol. 351. sz. 6274, 684–687. o., 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  57. R. M. Shelake, D. Pramanik és J.-Y. Kim, „Növény-mikroba kölcsönhatások feltárása a fenntartható mezőgazdaságért a CRISPR-korszakban” Mikroorganizmusok, vol. 7, sz. 8. o. 269, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  58. J. A. Vorholt, C. Vogel, C. I. Carlström és D. B. Müller, „Ok-okozati összefüggés megállapítása: szintetikus közösségek lehetőségei a növényi mikrobiomkutatáshoz” Sejtgazda és mikroba, vol. 22, sz. 2, 142–155, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  59. J. Labbé, W. Muchero, O. Czarnecki és munkatársai: „Növényi-mikorrhiza kölcsönhatás közvetítése lektinreceptor-szerű kináz által”, Természet Növények, vol. 5, sz. 7, 676–680. o., 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  60. A. A. Carrell, M. Kolton, J. B. Glass és munkatársai: „A kísérleti felmelegedés megváltoztatja a közösség összetételét, sokszínűségét és N2 tőzegmoha rögzítő aktivitása (Sphagnum fallax) mikrobiomák” Globális változásbiológia, vol. 25, sz. 9, 2993–3004, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  61. K. G. Cabugao, C. M. Timm, A. A. Carrell és munkatársai: „A gyökér- és rizoszféra bakteriális foszfatáz aktivitása a fafajoktól és a talaj foszforának elérhetőségétől függően változik Puerto Rico trópusi erdőjében” A növénytudomány határai, vol. 8. cikk, 1834, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  62. J. A. Henning, D. J. Weston, D. A. Pelletier, C. M. Timm, S. S. Jawdy és A. T. Classen: „A gyökérbakteriális endofiták megváltoztatják a növény fenotípusát, de nem a fiziológiát” PeerJ, vol. 4, cikk e2606, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  63. C. M. Timm, D. A. Pelletier, S. S. Jawdy és munkatársai: „Két nyárfa-asszociált baktériumizolátum additív kedvező válaszokat indukál egy megépített növény-mikrobióma rendszerben” A növénytudomány határai, vol. 7. o. 497, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  64. J. M. Plett, H. Yin, R. Mewalal és munkatársai: „A Populus trichocarpa kisméretű, effektorszerű szekretált fehérjéket kódol, amelyek nagymértékben indukálódnak a kölcsönös szimbiózis során” Tudományos Jelentések, vol. 7, sz. 1. o. 382, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  65. F. Martin, A. Aerts, D. Ahrén és munkatársai: „A Laccaria bicolor genomja betekintést nyújt a mikorrhiza szimbiózisba” Természet, vol. 452. sz. 7183, 88–92. o., 2008. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  66. H. Kang, X. Chen, M. Kemppainen és munkatársai: „A Laccaria bicolor kisméretű, szekretált effektor fehérjéje, a MiSSP7.6 szükséges az ektomikorrhizális szimbiózis kialakulásához” Környezeti mikrobiológia, vol. 22, sz. 4, 1435–1446, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  67. C. Pellegrin, Y. Daguerre, J. Ruytinx és munkatársai: „A Laccaria bicolorMiSSP8 egy kis szekréciójú fehérje, amely meghatározó az ektomikorrhiza szimbiózisának kialakításában” Környezeti mikrobiológia, vol. 21. sz. 10, 3765–3779, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  68. J. M. Plett, Y. Daguerre, S. Wittulsky és munkatársai: „A Laccaria bicolor kölcsönös gomba MiSSP7 effektora stabilizálja a Populus JAZ6 fehérjét és elnyomja a jázmonsavra (JA) érzékeny géneket” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 111. sz. 22, 8299–8304, 2014. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  69. J. M. Plett, M. Kemppainen, S. D. Kale és munkatársai: „A Laccaria bicolor szekretált effektor fehérjéje szükséges a szimbiózis kialakulásához” Aktuális biológia, vol. 21. sz. 14, 1197–1203, 2011. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  70. M.-M. Pérez-Alonso, C. Guerrero-Galán, S. S. Scholz és munkatársai: „Szimbiotikus növény-gomba kölcsönhatások kihasználása a szélsőséges növényi ökoszisztémák rejtett erőinek felszabadítására” Journal of Experimental Botany, 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  71. J. C. De la Concepcion, M. Franceschetti, R. Terauchi, S. Kamoun és M. J. Banfield: „A fehérjefejlesztés kiterjeszti a rizs NLR immunreceptorának effektor felismerési profilját” Elife, 8:e47713, 2019. Megtekintés itt: Google Scholar
  72. K. E. French: "Mikorrhiza szimbiózisok tervezése a növények anyagcseréjének megváltoztatására és a termés egészségének javítására" A mikrobiológia határai, vol. 8, 1403. cikk, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  73. F. Wolter és H. Puchta: „A CRISPR/Cas alkalmazása a növények cis- és transzregulációs elemeinek megértésére” Molekuláris biológiai módszerek, vol. 1830, 23–40. o., 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  74. R. Biłas, K. Szafran, K. Hnatuszko-Konka és A. K. Kononowicz: „Cis-regulatory elements used to control geneexpression in plants” Növényi sejt-, szövet- és szervkultúra (PCTOC), vol. 127. sz. 2, 269–287, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  75. P. J. Wittkopp és G. Kalay: „Cisz-szabályozó elemek: molekuláris mechanizmusok és evolúciós folyamatok az eltérések hátterében” Nature Reviews Genetics, vol. 13. sz. 1, 59–69., 2011. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  76. D. Koenig, J. M. Jimenez-Gomez, S. Kimura és munkatársai: „Az összehasonlító transzkriptomika szelekciós mintákat tár fel háziasított és vadon élő paradicsomban” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 110, sz. 28, pp. E2655–E2662, 2013. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  77. M. B. Hufford, X. Xu, J. van Heerwaarden és munkatársai, „Comparative population genomics of kukorica domesztikációja és javítása”, Természetgenetika, vol. 44, sz. 7, 808–811. o., 2012. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  78. R. S. Meyer és M. D. Purugganan, „A terményfajok evolúciója: a háziasítás és diverzifikáció genetikája”, Nature Reviews. Genetika, vol. 14. sz. 12, 840–852, 2013. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  79. G. Swinnen, A. Goossens és L. Pauwels, „Lessons from domestation: targeting cis-regulatory elements for crop quality” Trendek a növénytudományban, vol. 21. sz. 6, 506–515. o., 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  80. S. A. Zafar, S. S.-E.-A. Zaidi, Y. Gaba és mtsai, „Engineering abiotic stress tolerance via CRISPR/Cas-mediált genomszerkesztés” Journal of Experimental Botany, vol. 71. sz. 2, 470–479. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  81. H. Yan, H. Jia, X. Chen, L. Hao, H. An és X. Guo: „A GhWRKY17 gyapot WRKY transzkripciós faktor szárazságban és sóstresszben működik transzgenikus Nicotiana benthamianában az ABA jelátvitel és a reaktív moduláció révén oxigénfajok termelése” Növény- és sejtélettan, vol. 55, sz. 12, pp. 2060–2076, 2014. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  82. D. Liu, X. Chen, J. Liu, J. Ye és Z. Guo: „A rizs ERF transzkripciós faktora, az OsERF922 negatívan szabályozza a Magnaporthe oryzae elleni rezisztenciát és a sótoleranciát” Journal of Experimental Botany, vol. 63. sz. 10, 3899–3911, 2012. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  83. L. He, X. Shi, Y. Wang, Y. Guo, K. Yang és Y. Wang: „Az Arabidopsis ANAC069 kötődik C[A/G]CG[T/G] szekvenciákhoz, hogy negatívan szabályozza a sót és az ozmotikus stresszt megértés," Növényi molekuláris biológia, vol. 93. sz. 4-5, pp. 369–387, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  84. D. Rodríguez-Leal, Z. H. Lemmon, J. Man, M. E. Bartlett és Z. B. Lippman, „Engineering quantitative trait variation for crop development by genome editing”, Sejt, vol. 171. sz. 2, pp. 470–480.e8, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  85. R. Zhong, D. Cui és Z.-H. Igen, „Másodlagos sejtfal bioszintézis”, Az új fitológus, vol. 221. sz. 4, 1703–1723, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  86. N. Yuan, V. K. Balasubramanian, R. Chopra és V. Mendu: „Az FKF1 fotoperiodikus virágzási idő szabályozó negatívan szabályozza a cellulóz bioszintézisét” Növényélettan, vol. 180, sz. 4, 2240–2253, 2019. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  87. L. Kasirajan, N. V. Hoang, A. Furtado, F. C. Botha és R. J. Henry: „A transzkriptomelemzés kiemeli a különböző rosttartalmú cukornád genotípusok cellulóz és lignin bioszintézisében részt vevő kulcsfontosságú, differenciálisan expresszált géneket.” Tudományos Jelentések, vol. 8, sz. 1, cikk 11612, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  88. G. Bali, R. Khunsupat, H. Akinosho és munkatársai, „Characterization of cellulose structure of Populus planted modified in jelölt cellulose biosynthesis gének”, Biomassza és bioenergia, vol. 94, 146–154. o., 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  89. S. S. Maleki, K. Mohammadi és K.-S. Ji: „Cellulóz szintézis jellemzése növényi sejtekben”, ScientificWorldJournal, vol. 2016, cikk 8641373, 8 oldal, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  90. T. Wang, H. E. McFarlane és S. Persson: Az abiotikus tényezők hatása a cellulózszintézisre, Journal of Experimental Botany, vol. 67. sz. 2, 543–552, 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  91. M. Kumar, L. Campbell és S. Turner: „Másodlagos sejtfalak: bioszintézis és manipuláció”, Journal of Experimental Botany, vol. 67. sz. 2, 515–531. o., 2016. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  92. M. Kumar és S. Turner: „Növényi cellulóz szintézis: CESA fehérjék keresztezik királyságokat”, Fitokémia, vol. 112., 91–99. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  93. K. Houston, R. A. Burton, B. Sznajder és munkatársai: „Az árpa cellulóztartalmának genomra kiterjedő asszociációs vizsgálata olyan jelölt géneket tár fel, amelyek a CELLULÓZSZINTÁZIS géncsalád tagjaival együtt expresszálódnak” PLoS One, vol. 10, sz. 7, cikk e0130890, 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  94. Q. Du, J. Tian, ​​X. Yang és munkatársai: „A kulcsgének által biztosított additív, domináns és episztatikus variációk azonosítása a cellulóz bioszintézis folyamatában Populus tomentosa,” DNS-kutatás, vol. 22, sz. 1, 53–67. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  95. J. T. McNamara, J. L. W. Morgan és J. Zimmer, „A cellulose biosynthesis molekuláris leírása”, Biokémia éves áttekintése, vol. 84, sz. 1, 895–921. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  96. S. M. Wilson, Y. Y. Ho, E. R. Lampugnani és mtsai, „Determining the subcelluláris location of synthesis and assemblies of the sejtfal poliszacharid (1,3 1,4)-β-D-glükán fűben, A növényi sejt, vol. 27. sz. 3, 754–771, 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  97. I. M. Saxena és R. M. Brown Jr., „Cellulóz bioszintézis: jelenlegi nézetek és fejlődő koncepciók”, A botanika évkönyvei, vol. 96, sz. 1, 9–21, 2005. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  98. M. B. Sticklen: „Növényi géntechnológia a bioüzemanyag-termeléshez: a megfizethető cellulóz-etanol felé” Nature Reviews Genetics, vol. 9, sz. 6, pp. 433–443, 2008. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  99. Q. Sun, J. Huang, Y. Guo és munkatársai: „A gyapot NAC domén transzkripciós faktora, a GhFSN5 negatívan szabályozza a másodlagos sejtfal bioszintézist és a portok fejlődését transzgenikus Arabidopsisban” Növényélettan és biokémia, vol. 146., 303–314. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  100. J. L. Hill, C. Josephs, W. J. Barnes, C. T. Anderson és M. Tien: „Primer sejtfal cellulóz szintázok élettartama in vivo”, Növényi molekuláris biológia, vol. 96, sz. 3, 279–289. o., 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  101. J. L. Hill, A. N. Hill, A. W. Roberts, C. H. Haigler és M. Tie: „Domain swaps of Arabidopsis szekunder fali cellulóz szintázok osztályspecifikusságuk tisztázására” Plant Direct, vol. 2, sz. 7, cikk e00061, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  102. C. Voiniciuc, M. H.-W. Schmidt, A. Berger és munkatársai: „A MUCILAGE-RELATED10 galaktoglukomannánt termel, amely fenntartja a pektin és a cellulóz szerkezetét az Arabidopsis mag nyálkahártyájában” Növényélettan, vol. 169. sz. 1, 403–420. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  103. M. Taylor-Teeples, L. Lin, M. de Lucas és munkatársai, „An Arabidopsis génszabályozó hálózat másodlagos sejtfalszintézishez” Természet, vol. 517. sz. 7536, 571–575. o., 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  104. J. K. Jensen, M. Busse-Wicher, C. P. Poulsen és munkatársai: „Az alga-xilán-szintáz azonosítása azt jelzi, hogy funkcionális ortológia van az alga és a növényi sejtfal bioszintézise között” Az új fitológus, vol.218. sz. 3, 1049–1060, 2018. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  105. B. R. Urbanowicz, V. S. Bharadwaj, M. Alahuhta és munkatársai: „A xiloglükán-fukoziláció szerkezeti, mutagén és in silico vizsgálatai Arabidopsis thaliana-ban víz által közvetített mechanizmusra utalnak” A Plant Journal, vol. 91. sz. 6, pp. 931–949, 2017. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  106. S. Andersson-Gunnerås, E. J. Mellerowicz, J. Love et al., "Biosynthesis of cellulose-enriched tension wood in Populus: A transzkriptumok és metabolitok globális elemzése azonosítja a biokémiai és fejlődési szabályozókat a másodlagos fal bioszintézisében", A Plant Journal, vol. 45, sz. 2, 144–165, 2006. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  107. Q. Du, B. Xu, W. Pan és munkatársai: „A cellulóz-szintáz gén (PtoCesA4) allélvariációja a növekedéssel és a fa tulajdonságaival összefüggésben Populus tomentosa,” G3 (Bethesda), vol. 3, sz. 11, 2069–2084, 2013. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  108. R. T. Walton, K. A. Christie, M. N. Whittaker és B. P. Kleinstiver, „Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variánsok” Tudomány, vol. 368. sz. 6488, 290–296. o., 2020. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  109. K. Xie, B. Minkenberg és Y. Yang: „A CRISPR/Cas9 multiplex szerkesztési képesség fokozása az endogén tRNS-feldolgozó rendszerrel” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 112. sz. 11, 3570–3575, 2015. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas

Szerzői jog

Copyright © 2020 Md. Mahmudul Hassan et al. Kizárólagos Nanjing Mezőgazdasági Egyetem engedélyes. Creative Commons Nevezési Licenc (CC BY 4.0) alatt terjesztve.


Vita

Tanulmányunk az első szisztematikus számszerűsítést nyújtja arra vonatkozóan, hogy a távoli rokon fágok közötti genetikai transzfert hogyan alakítják a genetikai távolság, a genetikai csere mechanizmusai és az életmódbeli különbségek. Megközelítésünknek van néhány kifogása. Először is, az életmód helytelen besorolása az életstílusok közötti géntranszfer események hamis következtetéséhez vezet. Ezt három különböző életmódbesorolási eljárással ellenőriztük, amelyek hasonló minőségi mintákat tártak fel, megmutatva, hogy eredményeink robusztusak az életstílusok helytelen hozzárendelésére (lásd az S1 kiegészítő táblázatot, Kiegészítő anyag online). Másodszor, módszerünk nem képes azonosítani bizonyos típusú genetikai transzfereket: az ősieket, azokat, amelyek a fággenom nagy részét fedik le, és azokat, amelyek szorosan rokon fágok között vannak. Fontos megjegyezni, hogy ez kizárja a mérsékelt égövi fágok és közelmúltbeli virulens változataik közötti transzferek azonosítását (például egy integráz közelmúltbeli elvesztése), és ez arra utal, hogy alábecsültük a különböző életmódú fágok közötti géntranszferek számát. Harmadszor, a genetikai transzferek és a származás közötti különbségtétel különösen nagy kihívást jelent a mérsékelt övi fágok elemzése során, mert átható mozaikosságuk. Ez a mérsékelt égövi fágok közötti közelmúltbeli géntranszferek specifikus eseményeinek kevésbé magabiztos azonosításához vezet.

Ezektől a figyelmeztetésektől függetlenül a legtöbb fágban a közelmúltban távoli fágokkal történt genetikai transzferek egyértelmű nyomait tudtuk azonosítani. A mérsékelt égövi fágok közötti átvitel előfordulhat a profágok vagy profágok és a fertőző fágok között. De mikor történik a többi csere? Három fő forgatókönyvet képzelünk el a virulens vagy a virulens és a mérsékelt övi fágok közötti genetikai átvitelre. Először is, két virulens fág egyidejűleg megfertőzhet egy baktériumot, vagy találkozhat egy sejtben, ha van egy rezidens virulens fág a pszeudolizogenezisben (Cenens et al. 2013). Másodszor, a különböző életmódú fágok közötti átvitel akkor történhet meg, amikor a virulens és a mérsékelt égövi fágok együtt fertőznek egy baktériumot, vagy amikor a virulens fágok megfertőznek egy lizogént. Ezek az átvitelek mindkét irányban megtörténhetnek. A virulens fágok DNS-t nyerhetnek a prófágoktól, amikor lebontják a bakteriális kromoszómát, és számos rekombinogén lineáris kétszálú DNS-molekulát termelnek. A mérsékelt égövi fágok vagy profágok DNS-t nyerhetnek a virulens fágokból, amikor az utóbbiakat a gazdaszervezet védekező rendszere, például restrikciós-módosító rendszerek vagy CRISPR-Cas hasítja, ami szintén lineáris kétszálú DNS-t eredményez (Arber 2000 Marraffini 2015). . Tekintettel az aktív vagy hibás profágokkal rendelkező baktériumok elterjedtségére, az ilyen események valószínűbbek lehetnek, mint a koinfekciók. Megközelítésünk nem teszi lehetővé a géntranszferek irányának azonosítását (mérsékelt égöviből virulensbe vagy fordítva), és ez kulcsfontosságú a fenti forgatókönyvek relevanciájának megismeréséhez. Mindazonáltal, és függetlenül azoktól a körülményektől, amelyek elősegítik a genetikai átvitelt a távoli rokon fágok között, ez a genetikai fluxus várhatóan növekedni fog, ha a fertőzött gazdaszervezetek sok profággal rendelkeznek.

Milyen molekuláris mechanizmusok közvetítik a génfluxust a távoli rokon fágok között? Két irányzat azt javasolta, hogy a nagyon eltérő mérsékelt égövi lambdoid fágok közötti genetikai transzferek vagy relaxált homológ rekombinációból vagy illegitim rekombinációból származhatnak (Hatfull és Hendrix 2011, De Paepe et al. 2014). Ezek a mechanizmusok nem zárják ki egymást, és mindkettő a virulens fágok és profágok közötti megfigyelt rekombinációra hat Lactococcus (Labrie és Moineau 2007). Itt bizonyítékot találunk mindkét mechanizmus fágokon keresztüli géntranszferhez való hozzájárulására, mivel a legújabb mozaikfágokban több rekombináz, NHEJ-ben részt vevő fehérjéket kódoló gén és transzpozázok találhatók. Ezeknek a mechanizmusoknak a relatív hozzájárulása azonban a fág életmódjától függ. A virulens fágokban a génáramlás leginkább az UvsX-hez kapcsolódik, de a mérsékelt égövi fágokban az összes elemzett mechanizmussal. Érdekes módon a rekombinázok a nem rokon fágok között átvitt funkciók közé tartoznak, ami arra utal, hogy a további genetikai transzferek lehetőségeit magát a múltbeli cserék vezethetik. Ezért a genetikai cserék, amelyeket végül a bennük kódolt rekombinázok közvetítenek cis vagy más mechanizmusok révén elősegítik a rekombinázok megszerzését, amelyek tovább növelik a fág genomi plaszticitását.

Általánosságban elmondható, hogy elemzésünk azt mutatja, hogy a funkciók széles skáláját cserélték ki a közelmúltban történt géntranszferek révén, ami megkönnyítheti a fágok alkalmazkodását az új kihívásokhoz. Valójában azt találtuk, hogy a virionok termelésében részt vevő fehérjék, de a bakteriocinek vagy az RNS polimerázok is átvihetők a távoli fágok között. Egy közelmúltban végzett munka bizonyítékot talált az anti-CRISPR fehérjéket kódoló gének cseréjére a mérsékelt és virulens fágok között (Hynes és mtsai. 2018), tovább hangsúlyozva a nem rokon fágok közötti genetikai cserékben rejlő lehetőségeket az adaptív tulajdonságok terjesztésében. Az ilyen transzferekben részt vevő gének feltűnő funkcionális sokfélesége ellenére a preferenciálisan kicserélt funkcionális kategóriák a fágok életmódjától függenek. Például a mérsékelt égövi fágok közötti transzferek felülreprezentálják a genetikai szabályozókat, ami megfelel annak az elvárásnak, hogy ezek az elemek bonyolultabb szabályozást igényelnek, mint a virulens fágok. Az életstílusok közötti funkcióbeli különbségek összefüggésbe hozhatók a virulens fágokra következtetett szélesebb gazdakörrel is, mivel a virulens fágokba preferáltan átvitt funkciók hatékonyabbak lehetnek a gazdaszervezet hátterétől függetlenül. A bakteriális funkciójú gének a legtöbb esetben átmenetiek lehetnek a virulens fágok genomjában, mivel nem nyújtanak előnyt, és a virulens fágok nem tudják lizogenizálni gazdáikat. Vannak azonban példák a kisegítő metabolikus génekre, amelyeket ezek a fágok szereztek be és hasznosítottak újra (Thompson et al. 2011). Ennek megfelelően a fotoszintézis az a bakteriális funkció, amelyről azt találjuk, hogy a virulens fágokat érintő transzferekben (akár más virulens fágokkal, akár mérsékelt övi fágokkal) a leggazdagabb. Kimutatták, hogy az erre a funkcióra szolgáló gének növelik a virulens fágok vírusutódai számát (Mann és mtsai. 2003, Lindell és mtsai. 2004), és korábban azt is kimutatták, hogy kicserélődnek Prochlorococcus és Synechococcus vírus intermediereken keresztül (Zeidner et al. 2005). Ez arra utal, hogy a génáramlás a fágokkal és a fágok között aktív szerepet játszik a cianobaktériumok fotoszintézisének evolúciójában. Ezek és más adaptív bakteriális tulajdonságok tovább terjedhetnek virulens fágok vagy eltérő életmódot folytató fágok közötti transzferek révén.

Eredményeink azt sugallják, hogy a genetikai transzferek fágok funkcionális és morfológiai diverzifikációjára gyakorolt ​​hatását fokozhatják a mérsékelt és virulens fágok gazdakörének különbségei. Mind a mérsékelt, mind a virulens fágoknak funkciókra van szükségük litikus ciklusuk szabályozásához, de az előbbieknek további genetikai kölcsönhatásokat kell létrehozniuk gazdáikkal a lizogén folyamat során, beleértve a lízis-lizogén kapcsolókat és a profág indukció szabályozását. Ez szorosabb gazda-parazita koevolúcióhoz vezet, és potenciálisan csökkenti a mérsékelt égövi fágok gazdakörét. Ez hozzájárulhat a virulens fágokban azonosított gazdaszervezet viszonylag szélesebb köréhez, és egybevág azzal a kísérleti megfigyeléssel, hogy a kisgyermekek ürülékéből izolált virulens colifágok a béltörzsek szélesebb körét fertőzik meg, mint a mérsékelt övi törzsek (Mathieu et al. 2020). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szexuálisan izolált mérsékelt égövi fágok csoportjai (mivel megfertőzik a filogenetikailag távoli gazdákat) képesek géneket kicserélni közvetetten, szélesebb gazdakörű virulens fágokkal való cserén keresztül. Ezzel szemben a virulens-virulens genetikai átvitel ritka a korlátozott vírusrendszertani csoportokon kívül (Chopin et al. 2001 Lima-Mendez et al. 2008), és a mérsékelt égövi fágok vagy azok prófétai szintén közvetíthetik az ilyen csoportok közötti cserét. Mivel az utóbbiak rendszeresen a bakteriális genom részévé válnak, a távoli fágok közötti rekombináció a bakteriális génrepertoárokat is kiterjeszti, és a baktériumok evolúcióját is előmozdítja.


Eredmények

A DNS promoter metilációs mintázatainak jellemzői

A metilációs profilok egyedek közötti változásának tanulmányozására a HapMap Yoruba (YRI) gyűjteményből származó, nem rokon egyedekből származó 77 limfoblasztoid sejtvonalban (LCL) mértük a metilációs szintet a genomban. Ezekhez a mintákhoz rendelkeztünk nyilvánosan elérhető genotípusokkal [21], valamint a 77 minta közül 69-ben az RNS-szekvenálásból származó génexpressziós szintekre vonatkozó becsléseinkkel [24]. A metilezési profilalkotást két párhuzamosban végeztük el az Illumina HumanMethylation27 DNA Analysis BeadChip vizsgálati eljárással, amely a hidrogén-szulfittal átalakított genomiális DNS genotipizálásán alapul az egyes CpG-helyeken a DNS-metiláció kvantitatív mérése érdekében. Az Illumina tömb 27 578 CpG-helyet célzó szondákat tartalmaz. Az elemzéseket azonban azokra a próbákra korlátoztuk, amelyek egyedileg térképezték fel a genomot, és nem tartalmaztak ismert szekvencia-variációt, így 22 290 CpG-helyet tartalmazó adatkészletünk maradt 13 236 gén promóterrégiójában (lásd Módszerek). A hibridizációt követően a metilációs szinteket a metilált allélból nyert intenzitásjel arányaként becsültük meg a metilált és nem metilált allél intenzitási jelek összegéhez viszonyítva. A metilezési szintet kvantilisan normalizáltuk [28] két ismétlésben. Teszteltük a korrelációkat potenciálisan zavaró változókkal, amelyek befolyásolhatják az LCL-ek metilációs szintjét [29], mint például az LCL-sejtek növekedési sebessége, az Epstein-Barr vírus kópiaszáma és a biológiai variáció egyéb mérései (lásd az 1. további fájlt), amelyek elérhetőek voltak A vizsgálatunkban részt vevő személyek közül 60 [30] nem magyarázta szignifikánsan a mintánk metilációs szintjének változását (S1 ábra az 1. kiegészítő fájlban). Megfigyeltük azonban a HapMap fázis hatását (az 1/2 és 3 fázisból származó minták) az első főkomponens-terhelések eloszlására az autoszomális adatokban, ami arra utal, hogy az első metilációs főkomponens részben rögzítheti az LCL-hez potenciálisan kapcsolódó technikai eltéréseket. kultúra. A downstream asszociációs feltérképezési elemzésekben főkomponens-analízissel korrekciót alkalmaztunk, amely az első három főkomponenst regresszi, hogy figyelembe vegyük a nem mért zavaró tényezőket, és növeljük a kvantitatív tulajdonságlókuszok kimutatásának képességét.

A metiláció globális mintái

Különös metilációs mintázatokat figyeltek meg az autoszómákon, az X-kromoszómán és a benyomott gének közelében elhelyezkedő CpG-helyek esetében (1a. ábra). Az autoszomális CpG-helyek többsége (71,4%) elsősorban nem metilált (a metiláció megfigyelt hányada <0,3), 15,6%-a hemi-metilált (a metiláció aránya 0,3 és 0,7 között volt), és 13%-a metilált. Amint az várható volt, ezek a mintázatok összhangban voltak a promóterek közelében korábban megfigyelt alacsonyabb metilációs szintekkel, mint a genomszintű szintekkel [4, 31]. Nem találtunk bizonyítékot nem-specifikus autoszomális metilációs mintázatokra, összhangban egy korábbi jelentéssel [4]. Ezzel szemben az X-kromoszómán lévő CpG-helyek igen jelentős nem-specifikus különbségeket mutattak (S2. ábra) a nőknél a hemimetilált mintázatokkal, amelyek összhangban voltak az X-kromoszóma inaktivációjával. Hasonló hemi-metilációs csúcsot figyeltek meg a teljes mintában az ismert autoszomális imprinted gének transzkripciós starthelyei (TSS) közelében elhelyezkedő CpG-helyek esetében.

A metilációs minták megoszlása ​​a genomban. (a) A CpG-helyek metilezési mintái az autoszómákon, az X-kromoszómán és a benyomott gének közelében. A metilációs értékeket 77 egyednél 21 289 autoszomális CpG-helynél (balra), 43 nőnél 997 CpG-helynél az X-kromoszómán (középen), és 77 egyednél 153 CpG-helynél ábrázoltuk, 33 benyomott génben (jobbra) . b) Metilezési szintek a TSS-hez képest (a negatív távolságok a TSS-től felfelé vannak), ahol a vonal a futó medián szinteket jelöli 300 bp-os csúszó ablakokban. c) Összefüggések a metilációs szintek között minden páronkénti CpG-helyen (fekete), és azon CpG-helyeken, ahol mindkét próba ugyanabban a CGI-ben van (piros), vagy ahol legalább egy szonda a CGI-n kívül van (kék). A vonalak a CpG-helyek közötti átlagos rangpáronkénti korreláció simított spline illeszkedését jelzik 100 bp-os ablakokban, a próbapárok számával súlyozva. d) Metilációs szintek az annotációs kategóriákon belül és kívül, beleértve a CpG-szigeteket (CGI-ket) a TSS-től 100 bp-n belüli próbák esetében, valamint a hisztonmódosításokat és a transzkripciós faktor (TF) kötőhelyeit az összes szondánál (lásd az 1. további fájlt).

A TSS-ektől 1 kb-on belül elhelyezkedő CpG-helyek metilációs szintjében korábban bejelentett [4] csökkenést figyeltünk meg (1b. ábra). Beszámoltak arról, hogy a promóter metilációs szintje a CpG-szigetekhez képest változik [32]. Azt találtuk, hogy bár a CpG-sziget (CGI) határától való távolság [33] (beleértve a CpG-partokat is [34]) nem befolyásolta szignifikánsan a metilációs szintet, a CGI-ben található CpG-helyek alulmetiláltak és kevésbé változékonyak (Wilcoxon rang-összeg teszt). P < 2,2 × 10 -16 ) a CGI-ken kívüli oldalakhoz képest (1. ábra, S3 ábra az 1. kiegészítő fájlban).

A metiláció gyakran 1-2 kb nagyságrendű korrelációt mutat a genomi régiók között [4, 35]. Megvizsgáltuk, hogy az autoszomális metilációs szintek (kometiláció) közötti korreláció függ-e a CpG-helyek közötti távolságtól. Megfigyeltük, hogy a közelben (legfeljebb 2 kb távolságra) elhelyezkedő próbák metilációs szintjei erősen korreláltak (1c. ábra), ami azt jelzi, hogy az egyének közötti metilációs szintek eltérése sejttípuson belül korrelál. Az 1c. ábra azt is mutatja, hogy a CpG-helyek párjai, amelyek mindketten egy CGI-n belül voltak, nagyobb bizonyítékot mutattak a kometilációra, mint azok a CpG-helyek párjai, amelyeknél legalább az egyik a CGI-n kívül volt, és ez szabályozza a távolságot, ami a CpG-k DNS-metilációjának eltérő szabályozását jelenti. a CGI-ken belül és kívül [32].

A DNS metilációja korrelál a transzkripcióval és a hiszton módosulásokkal

A metiláció régóta szerepet játszik a génexpresszió szabályozásában. A metiláció génexpressziós variációban betöltött szerepének vizsgálatához a metilációs szinteket összehasonlítottuk a génexpresszió RNS-szekvenáláson alapuló becsléseivel (2a. ábra). Az egyéneken belül szignifikáns negatív korrelációt találtunk a metiláció és a génexpressziós szintek között (S4 ábra az 1. kiegészítő fájlban) 11 657 gén között (átlagos rangkorreláció r = -0,454). A géneket kvartilisekre osztottuk a magastól az alacsonyig, és megfigyeltük, hogy a metilációs szintek csökkenése a TSS közelében (1b. ábra) csak az erősen expresszált génekben volt megfigyelhető (2b. ábra). Azt is megkérdeztük, hogy az egyének közötti metilációs szintek változása korrelál-e a génexpressziós szintek változásával. A 69 egyed génszintű összehasonlítása a negatívan korrelált gének szerény, de jelentős feleslegét jelezte (permutáció P < 0,0001).

A DNS-metiláció negatívan korrelál a génexpresszióval. (a) A metilációs szint alacsony az erősen expresszált gének felső kvartilisében (balra), és magas a gyengén expresszált gének alsó kvartilisében (jobbra), 12 670 autoszomális gént tekintve. b) A TSS-hez viszonyított metilezési szintek a génexpressziós szintek szerint kategorizált génkészletekben, a legmagasabbtól (pirostól) a legalacsonyabbig (kékig), a génexpresszió kvartiliseit használva a génexpressziós átlagokhoz képest, ahol az illesztett vonalak futó medián szinteket mutatnak (lásd 1b. ábra).

Úgy gondolják, hogy a DNS-metiláció kölcsönhatásba lép a hiszton módosulásokkal a génexpresszió szabályozása során [36, 37]. Összehasonlítottuk a mintánkban lévő metilációs szinteket az ENCODE projekt egyik hisztonmódosítási ChIP-seq adataival az egyik CEPH HapMap LCL-ben (GM12878). Erős negatív korrelációt találtunk a DNS metilációs szintjei és az aktív géneket célzó hisztonjelek jelenléte között (1d ábra, S3 és S5 ábra az 1. kiegészítő fájlban). Például a DNS metilációja alacsony volt a H3K27ac csúcsokban, amelyek az enhanszerekre utalnak [38], korábban pozitívan korreláltak a transzkripciós szintekkel [39] és negatívan korreláltak a DNS-metilációs szintekkel [31]. Hasonlóképpen, a H3K4me3 és a H3K9ac transzkripciós jelek egyaránt negatívan korreláltak a DNS-metilációs szintekkel. A CENTIPEDE algoritmus által megjósolt transzkripciós faktor kötőhelyeken alacsonyabb metilációs szintet is megfigyeltünk sejttípus-specifikus adatok, köztük a DNáz1 szekvenálási leolvasások [40] segítségével, összhangban azzal az elvárással, hogy a metiláció hiánya fontos a transzkripciós faktor kötődése szempontjából.

A DNS-metiláció genomszintű asszociációja az SNP genotípusokkal

Ezt követően felmértük, hogy a genetikai variáció hozzájárul-e a DNS-metilációs szintek egyedek közötti változásaihoz. Először azt teszteltük, hogy az SNP-k összefüggésben állnak-e a DNS-metiláció általános mintázatával, a főkomponens-analízissel mérve (lásd a Módszereket). A legérdekesebb jelet az SNP rs10876043 esetében kaptuk, amely genom-szerte szignifikáns összefüggést mutatott a metiláció első fő komponensének változásával (P = 4,5 × 10 -9 ), és amely szerény összefüggést mutatott az átlagos genomszintű metilációs szintekkel (P = 4,0 × 10 -5 ) (S1 táblázat az 1. kiegészítő fájlban). Ez az SNP a gén intronjában található DIP2B, amely egy DMAP1-kötő domént tartalmaz, és korábban feltételezték, hogy szerepet játszik a DNS-metilációban [41].

Társulások transz

Miután felmértük annak lehetőségét, hogy az SNP-k az egész genomra kiterjedő hatást gyakorolhatnak az általános metilációs mintázatokra, ezután a metilációs adatokat úgy alakítottuk át, hogy az első három fő komponenst visszafejtjük (lásd Módszerek), mivel korábban azt tapasztaltuk, hogy ez az eljárás nagymértékben csökkentheti a zajt adatok és javítja a kvantitatív vonási lokusz (QTL) feltérképezését [24] (lásd még [42, 43]). 10%-os genomszintű hamis felfedezési aránynál (FDR)P = 2,1 × 10-10 ) metilációs szintek 37 CpG-helyen az SNP genotípusokkal való kapcsolatra utaltak (S2 táblázat az 1. kiegészítő fájlban). Ezen CpG-helyek többsége (37-ből 27) feltételezett volt cis asszociációs jelek, vagyis a legjelentősebb SNP a mért CpG hely 50 kb-on belül volt (S6 ábra az 1. kiegészítő fájlban). A disztális asszociációk szerény gazdagodását figyeltük meg (feltételezett ford asszociációk), ami elsősorban a 10 CpG-hely jeleinek volt köszönhető (S7 ábra az 1. kiegészítő fájlban). Ezután megvizsgáltuk az SNP-k disztális asszociációját, amelyek korábban részt vettek a metilációban (S3 táblázat az 1. további fájlban), és szignifikáns proximális asszociációt találtunk az rs8075575 SNP között, amely 150 kb távolságra van a géntől. ZBTB4 amely megköti a metilált DNS-t, és a gén cg24181591 szondájánál metilál EIF5A amely egy fordításkezdeményezési tényezőt kódol. Három korábban közölt [5] szignifikáns disztális asszociációt is megfigyeltek az SNP rs7225527 esetében (38 kb a génből RHBDL3) és metiláció a cg17704839 próbánál a génben UBL5 amely ubiquitin-szerű fehérjét kódol, az SNP-k esetében pedig az rs2638971 (106 kb a génből DDX11) és rs17804971 (49 kb a génből). DDX12) és metiláció a cg18906795 próbánál a génben RANBP6, amely a nukleáris fehérjeimportban nukleáris transzportreceptorként működhet. A metil-kötő fehérjét kódoló géntől 165 kb-ra elhelyezkedő SNP-knél is találtak asszociációkat. MBD222 kb a metiltranszferáz géntől DNMT1, 192 kb a metiltranszferáz géntől DNMT3B, és három SNP-n, amelyek korábbi bizonyítékokkal rendelkeznek az asszociációra, de különböző régiókra [16] (S8 ábra az 1. kiegészítő fájlban). Összességében azonban viszonylag gyenge bizonyítékot kaptunk az egyesületekre vonatkozóan ford és gyenge vagy közepes dúsítása ford Az asszociáció lazább szignifikancia-küszöbök mellett jelez az érdeklődésre számot tartó régiókban.

Társulások a cisz-ben

Mivel a genomszintű asszociációs jelek többsége a megfelelő CpG-helyek közelében volt, ezután az SNP-k asszociációs tesztelésére összpontosítottunk az egyes CpG-helyektől 50 kb-on belül (3. ábra). 10%-os genomszintű FDR-nél (P = 2,0 × 10-5) 180 CpG-hely volt cis metiláció kvantitatív jellemző lókuszok (meQTL-ek). A legerősebb asszociációs jel (P = 8,0 × 10 -18) az rs2187102 SNP-n kaptuk a cg27519424 próbával a génben HLCS, amelyről úgy gondolják, hogy a hiszton biotinilációja révén részt vesz a génszabályozásban [44]. A meQTL-ekkel magyarázott variancia aránya a normalizált metilációs adatok esetében 22% és 63% között mozgott. Ha a DNS-metilációt befolyásoló mechanizmusok általában körülbelül 2 kb távolságig hatnak (1c. ábra), akkor a metilációt befolyásoló SNP-ket meQTL-ként kell kimutatni több közeli CpG-helyen. Megfigyeltük, hogy a metilációval kapcsolatos SNP-k további CpG-helyekkel is feldúsultak a legjobban asszociált CpG-helytől számított 2 kb-on belül, a legjelentősebb P-érték (3b. ábra), ami arra utal, hogy egyetlen genetikai variáns gyakran befolyásolja a metilációt számos közeli CpG-helyen.

Cis metilációs QTL-ek. (a) Kvantilis-kvantilis (QQ) diagram, amely leírja az asszociációs jel feldúsulását cis a permutált adatokhoz képest (90%-os megbízhatósági sáv árnyékolva). b) Az cisA -meQTL SNP-ket a CpG-helyhez közeli további CpG-helyeken dúsították asszociációs jelek, amelyek számára ezek meQTL-ek. A 180 legjobban asszociált SNP-t teszteltük, hogy az eredeti legjobban asszociált CpG-helyhez képest 2 kb-on belülre (piros), 2 kb-tól 10 kb-ig (lila), valamint 10-50 kb-ig (kék) essen. . A 2 kb-on belüli (piros) próbák többsége (96%) ugyanabban a CGI-ben volt, mint a legjobban társított próba. c) Térbeli eloszlása cis-meQTLs a CpG-helyhez képest, a hierarchikus modell szerint becsülve.

A genetikai variációt korábban összefüggésbe hozták a metilációval bizonyos benyomott régiókban [1]. Az adatainkban szereplő 180 meQTL-t tartalmazó CpG-hely volt a legközelebb 173 gén TSS-jéhez, amelyek közül kettőMEST és CPA4, amelyekről ismert volt, hogy benyomott gének. Korábbi megfigyelések szerint az eQTL és az imprinting hatások nem-specifikusak lehetnek [45], ami felveti annak lehetőségét, hogy egyes meQTL-ek nemtől függő módon hatnak. Nem találtunk azonban meggyőző, az egész genomra kiterjedő szignifikáns nem-specifikusat cis meQTL effektusok (lásd 1. további fájl). A CpG-helyek és a proximális meQTL-ek 180 asszociációja közül 27-et korábban emberi agymintákban jelentettek [5].

Keveset tudunk azokról a biológiai mechanizmusokról, amelyek a meQTL hatások hátterében állnak. Ennek érdekében Bayes-féle hierarchikus modellt [22] alkalmaztunk a meQTL-ek feldúsulásának tesztelésére a transzkripciós faktor kötőhelyein, a hiszton módosítási kategóriákban és a kapcsolódó próbák közelében. Azt találtuk, hogy a szondához legközelebbi SNP-k, különösen a szondát közvetlenül körülvevő 5 kb-ban, szignifikánsan feldúsultak a meQTL-ek tekintetében (3c. ábra). A transzkripciós faktor kötőhelyek, beleértve a CTCF-kötő helyeket is, szerény, de nem szignifikáns dúsulást mutattak a meQTL-ek esetében (S9 ábra az 1. további fájlban).

A metilációs QTL-ek a QTL-ek expressziójához dúsítottak

Végül RNS-szekvenálási adatok segítségével megvizsgáltuk a szabályozási variációk átfedéseit, amelyek mind a metilációt, mind a génexpressziós szintet befolyásolják [24]. Feltételeztük, hogy mivel a DNS-metiláció szabályozhatja a génexpressziót, ezért a metilációt befolyásoló variánsoknak gyakran következményekkel kell rendelkezniük a génexpresszióra. Az első módszer, amellyel ezt megvizsgáltuk, az volt, hogy 180 SNP-ből álló halmazt vettünk, amelyek meQTL-ek FDR-nél <10% (minden meQTL-hez csak a legjelentősebb SNP-t vesszük figyelembe). Ezután mindegyik SNP-t teszteltük a közeli gének expressziós szintjeivel való kapcsolatra (4a. ábra, piros pontok). Az expressziós szintekkel való asszociáció egyértelmű gazdagodása a nullhipotézishez (fekete vonal) és a kontroll SNP-khez képest, amelyek az allélgyakoriság és a szonda közötti távolság eloszlása ​​(fekete pontok) szerint illeszkednek.

A meQTL-ek és az eQTL-ek közötti átfedés. (a) Az eQTL asszociációt leíró QQ-plot P-értékek 180-ban cis-meQTL SNP-k (piros) és nyolc olyan SNP mintában, amelyek megfelelnek a cis-meQTL SNP-k a kisebb allélfrekvencia és a próba közötti távolság eloszlásához (fekete). b) Asszociációs jelek 508 FDR 10%-os eQTL-ben a génspecifikus metiláció visszafejlődése előtt és után. Feketén 439 eQTL van, amelyek átfedik a két fenotípust, pirossal 45 eQTL van jelen a metilációs regresszió előtt, kék színnel pedig 24 eQTL van jelen a metiláció visszafejlődése után. A lapos vonalak (zöld) megfelelnek az FDR 10%-os eQTL küszöbértékének.

Egy példa az SNP-re, az rs8133082, amely egyben meQTL és eQTL is a gén számára C21orf56 Az 5. ábra szemlélteti. Ha visszafejljük a metilációt, ez teljesen megszünteti ennek az SNP-nek a génexpresszióval való asszociációját (5a, b, c, d ábra). A metilációs vizsgálat eredményeit a következő időpontban validáltuk C21orf56 a metilációs próbarégió biszulfitos szekvenálásával vizsgálatunkban nyolc mintában, az SNP minden homozigóta genotípus osztályából négyben (5f ábra). A két metilációs szonda at C21orf56 mindkettőben cisz-meQTL-ek voltak, és átfedték a valószínű promoter régiót, amint azt a hisztonmódosítási adatok jelzik (5e. ábra), ami arra utal, hogy a genetikai variáció befolyásolhatja a kromatin szerkezetét ebben a régióban. C21orf56 úgy tűnik, hogy módosítja a humán LCL-ek reakcióját az alkilező ágensekre, és genomikus előrejelzője lehet a DNS-károsító ágensekre adott válaszok egyedek közötti különbségeinek [46].

C21orf56 génrégió. (a), b), c) Az rs8133082 genotípusa a metilációhoz (cg07747299) és a génexpresszióhoz kapcsolódik C21orf56, az rs8133082 genotípus szerint színezett egyedenként ábrázolva (GG = fekete, GT = zöld, TT = piros) közvetlenül genotipizált (körök) és imputált (háromszögek) adatokhoz. d) A génexpressziós szintek a C21orf56 a metiláció visszafejlődése után. (e) Génexpresszió at C21orf56 (+/-2 kb) genomiális régió a 21. kromoszómán. A távolságot a fordított szálon mérjük C21orf56 TSS 46 428 697 bp. Az oszlopdiagramok átlagos génexpressziós értékeket mutatnak milliónként a három rs8133082 genotípus-osztályba tartozó egyedek alcsoportjaiban. A középső panel a hisztonmódosítás csúcsait mutatja az LCL GM12878 kódolású régióban. Az alsó panelen a génszerkezet látható C21orf56, ahol az exonok félkövéren vannak szedve, és a gén a fordított szálból expresszálódik. A zöld pontok négy HapMap SNP (rs8133205, rs6518275, rs8133082 és rs8134519) elhelyezkedését jelzik, amelyek 10%-os FDR-nél kapcsolódnak mind a metilációhoz, mind a génexpresszióhoz, az S11 ábra pedig az 1. kiegészítő fájlban az 1,000 SNP-kkel e régió asszociációs eredményeit mutatja. Genom projekt. f) Nyolc rs8133082-homozigóta egyed (4 GG fekete, 4 TT vörös) biszulfit-szekvenálási eredményei a cg07747299-es genomszintű metilációs tesztet validálják, és megmutatják a metiláció mértékét a környező 411 bp-os régióban.

Az eQTL-ek és a meQTL-ek közötti átfedés további vizsgálata érdekében újra elemeztük az eQTL-adatokat a metiláció mint génspecifikus kovariáns beépítésével. Ha a metiláció változása áll a génexpresszió változásának hátterében, várhatóan az eQTL-ek számának csökkenését figyeljük meg a metilációs maradék génexpressziós adatokban. 10%-os FDR esetén (P = 2,5 × 10 -5 ) 484 eredeti eQTL és 463 metilációs maradék eQTL volt, ahol 439 eQTL volt átfedésben, 45 eQTL csak az eredeti adatokban, és 24 új eQTL csak a metilációs maradékokban volt jelen4b . Érdekes módon azok az SNP-k, amelyek a 45 gén eQTL-ei voltak, a metilációs maradékokban csökkent jelekkel, jelentős metilációs asszociációkkal gazdagodtak (S10 ábra az 1. további fájlban), ami arra utal, hogy ezek valódi mögöttes meQTL-ek, ahol a genetikai variáció befolyásolja a metilációt, ami viszont szabályozza a génexpressziót [5, 18]. Összefoglalva, eredményeink az SNP-k jelentős feldúsulását jelzik, amelyek mind a metilációt, mind a génexpressziót befolyásolják, ami közös mechanizmusra utal (például, hogy a megnövekedett DNS-metiláció alacsonyabb génexpressziót eredményezhet). Az ilyen jelet mutató gének száma azonban szerény töredéke a meQTL-ek teljes számának.


Vita

Ebben a tanulmányban beszámoltunk az inoviridae bakteriofágokból származó anti-CRISPR peptidek felfedezéséről. A felfedezéshez vezető nyom azon a megfigyelésen alapult, hogy az érintetlen M13 fág in vitro reakciókban gátolta az SpCas9 DNS hasítási aktivitását. Bár jelen tanulmányban a fő köpenyfehérjére, a G8P-re összpontosítottunk, valószínű, hogy más felszíni expozíciós kisebb burokfehérjék is sértetlen fág által közvetített SpCas9 gátlásnak tulajdoníthatók.

A korábban leírt Acr-ekkel ellentétben, amelyek a DNS-kötés megzavarásával [36, 45, 59] vagy a DNS hasításával [36] gátolják a CRISPR-Cas-t, a G8P egy külön mechanizmuson keresztül inaktiválja a CRISPR-Cas9-et azáltal, hogy megakadályozza a Cas9 sgRNS-kötődését. Ezenkívül a hatékony in vitro és in vivo gátlás elérése érdekében a G8PPD hozzá kell férnie az SpCas9-hez, mielőtt megkötné az sgRNS-t, ami azt jelzi, hogy a G8PPD kötődik az apo-Cas9-hez, de nem kötődik az sgRNS-hez kötött Cas9-hez. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a G8PPD és az sgRNS kölcsönösen kizárják a Cas9 nukleázhoz való kötődést. Az egyik egyértelmű magyarázat az, hogy a G8PPD és az sgRNS ugyanazért a kötőzsebért versengenek. Az MS és a mutációs vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy az f1 G8P kötőhelyePD a Cas9 PI doménjén helyezkedik el, távolabb az sgRNS- vagy DNS-kötő zsebektől, így a G8P közötti közvetlen versengés ellen utalPD és sgRNS-t ugyanarra a kötőzsebre. Ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy a G8PPD az SpCas9 alloszterikus inhibitoraiként működnek.

Alloszterikus inhibitorokként a G8PPD megakadályozhatja a Cas9-sgRNS kötődését sztérikus gátlás vagy konformációs változások bevezetésével. Ismeretes, hogy a vezető RNS kötődése a Cas9 konformációs átrendeződését idézheti elő [60], így lehetséges, hogy a G8PPD vagy az sgRNS-kötés képes az SpCas9-et rugalmas konformációból zárt konformációvá alakítani, ami megakadályozza, hogy az SpCas9 kötődjön a másik megfelelőjéhez. További kísérletekre van szükség ahhoz, hogy jobban bemutassuk a G8P által okozott SpCas9 gátlás mechanizmusát. Összességében a Cas9 és az sgRNS kötődés G8P által közvetített alloszterikus gátlása egyedülálló CRISPR-inaktiváló mechanizmust képvisel, amely fontos következményekkel járhat a következő generációs anti-CRISPR szerek kifejlesztésében.

A meglévő Acr fehérjék nanomoláris kötődési affinitást mutathatnak a Cas9-hez [36]. Ezzel szemben az inoviridae G8P fágPD A peptidek gyenge affinitást mutatnak, amint azt a mikromoláris IC bizonyítja50 az in vitro hasítási reakcióban (1. ábra), és mivel nem képes teljesen blokkolni a Cas9 és az sgRNS összeállítását (2. ábra). Érdekes módon az érintetlen M13 fág IC-vel gátolja a Cas9-et50 körülbelül 5 nM, 1000-szer alacsonyabb, mint a G8P esetébenPD. Az ép fágok megnövekedett hatékonysága a 2700 G8P kópiát hordozó fágkapszid multimer összeállítása által biztosított fokozott kooperativitás és aviditás eredménye lehet.

Bár kimutattuk, hogy az inoviridae fág G8PPD anti-CRISPR peptidekként működhetnek, felfedezésünk biológiai jelentőségét még fel kell tárni. Natív környezetben a fő köpenyfehérje, a G8P nem lép be a bakteriális citoplazmába a fágfertőzés során. Ezért nem valószínű, hogy a G8P anti-CRISPR funkciót fejt ki a fágfertőzés korai szakaszában. Ehelyett a G8P kölcsönhatásba léphet a CRISPR-Cas-szal a bakteriális citoplazmában a fággenom transzlációja után. Ez a poszttranszlációs gátló aktivitás G8P-kódoló DNS-t igényel, hogy elkerülje a CRISPR-támadást a fágfertőzés során. Ezenkívül az SpCas9-inaktiváló G8PPD a jelen tanulmányban felfedezett fágok kódolják, amelyek fertőznek Escherichia coli és Pseudomonas aeruginosa, amelyek nem tartalmaznak II-es típusú CRISPR-Cas rendszert. A vízszintes géntranszfer magyarázatot adhat a fajok közötti CRISPR inaktiválására [26, 32], azonban szisztémás filogenetikai elemzésre van szükség ahhoz, hogy feltárjuk a G8P-k anti-CRISPR aktivitásának evolúciós következményeit.

Annak ellenére, hogy a G8P anti-CRISPR aktivitása megfoghatatlan biológiai jelentőségű, mindazonáltal kimutattuk, hogy az SpCas9 genom-szerkesztő aktivitása humán sejtekben módosítható a G8P-vel.PD. Legjobb tudomásunk szerint felfedezésünk az első olyan peptid, amelyről ismert, hogy Cas9-gátló aktivitást mutatnak, és kibővíti a CRISPR elleni szer eszköztárát, amely jelenleg anti-CRISPR fehérjékből [21], kis molekulákból [20] és szintetikus oligonukleotidokból áll. [61]. A tipikusan 10-20 kD méretű Acr fehérjékhez képest a G8PPD A peptidek kis méretűek, és kémiailag nagy mennyiségben szintetizálhatók. Az egyszerű gyártási folyamat kritikus fontosságú a szerkezet-aktivitás kapcsolat gyors értékeléséhez, hogy azonosítani lehessen a fokozott anti-CRISPR peptideket. Különböző Cas9-gátló aktivitások figyelhetők meg a különböző inoviridae G8P fágokbanPD támogatja az SpCas9-gátló peptidek szekvenciaoptimalizálással történő javításának elképzelését. Ezenkívül a G8P-k eltérő hatásai az SpCas9-re, NmCas9-re és SaCas9-re azt jelzik, hogy megvalósítható lehet specifikus peptid inhibitorok tervezése a különböző Cas9 homológokhoz.

G8PPD nem változtatja meg az SpCas9 által kiváltott mutációk mintázatát, ami arra utal, hogy a G8PPDA -mediált Cas9 inaktiváció nem zavarja a downstream DNS-javító útvonalat. Ez a funkció megkönnyíti a G8P terápiás alkalmazásaitPD mivel a CRISPR-Cas kikapcsol azáltal, hogy korlátozza a genomszerkesztés eredményének változásait. Kimutatták, hogy a Cas9 intracelluláris koncentrációjának növelése fokozott off-target aktivitást eredményezhet anélkül, hogy tovább növelné a telített on-target hasítást, ezáltal csökken a genomcélzás specificitása [12]. Feltételezték, hogy a gyenge CRISPR-Cas inhibitorokkal történő részleges gátlás növelheti az SpCas9 specifitását humán sejtekben [20]. A jelenlegi tanulmányban azt találtuk, hogy az erős CRISPR-Cas-inhibitor AcrII4A transzfekciója majdnem teljesen gátolta az SpCas9 aktivitást humán sejtekben, ha az sgRNS-t és SpCas9-et kódoló plazmidokat megelőzően (5b. ábra) vagy egyidejűleg (6a. ábra) transzfektáltuk (6a. ábra). Ezzel szemben a G8P és a CRISPR-Cas9 együttes transzfekciója csekély mértékben gátolta a célzott aktivitást, de csökkentette a célon kívüli eseményeket az endogén genomiális helyeken (6. ábra és 1. további fájl: S7. ábra).

Ezért kétmódusú hatásmechanizmust javasolunk a G8P számára az SpCas9 aktivitások elnyomására élő sejtekben: a G8P előzetes inkubációja telítheti a G8P intracelluláris koncentrációit, és hatékonyan gátolja a később transzfektált Cas9 aktivitását az sgRNS-sel versengve az apo-hoz való kötődésért. -Cas9, míg a G8P Cas9-cel és sgRNS-sel történő együttes transzfekciója nem befolyásolja a Cas9-sgRNS összeállítását a hasításhoz a célhelyen, de csak megakadályozza a felesleges Cas9-et a célon kívüli szerkesztéstől (7. ábra). Érdekes módon megfigyelték, hogy az AcrIIC3, az SpCas9 gyenge inhibitora (5b. ábra), nem növelte az SpCas9 specifitását humán sejtekben (6b., c. ábra). Ez az eredmény a G8P eredményeivel együttPD arra utal, hogy az inhibitorok hatásmechanizmusa is fontos lehet a CRISPR-Cas9 specifitására gyakorolt ​​hatásuk szempontjából. Ezen túlmenően azonban meg kell jegyezni, hogy a G8P-k szerekként való alkalmazhatósága a CRISPR-Cas9 specifitásának javítására további sejttípusok, genomiális lókuszok és genomszintű mutációs profilok további vizsgálatát, valamint a fertőzés mechanizmusának jobb megértését igényli. a G8P akciója.

A G8P javasolt hatásmechanizmusa élő sejtekben, ha a Cas9 és sgRNS-t kódoló gének előtt vagy azokkal egyidejűleg szállítják


Nézd meg a videót: Reszkessetek, bacilusok! (Augusztus 2022).