Információ

Hol találhatom meg a hTERT (telomeráz alegység) szövetspecifikus fehérje expressziós szintjeit?

Hol találhatom meg a hTERT (telomeráz alegység) szövetspecifikus fehérje expressziós szintjeit?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Számos ellentmondásos forrást találok arra vonatkozóan, hogy a hTERT - a fehérje - milyen szövetekben expresszálódik. Tud valaki olyan forrást, amely hitelesen (amennyire csak lehetséges, vagy széles körben elfogadott) felsorolja a különböző szöveteket és a hTERT fehérje expressziós szintjeit?

Van valami hasonló forrás a hTERT génexpressziójához?


Azt tapasztaltam, hogy a biogps.org tartalmazza az összes szükséges kifejezési adatot:

https://biogps.org

https://biogps.org/#goto=genereport&id=7015


A humán telomeráz reverz transzkriptáz mechanizmusai (hTERT) szabályozás: klinikai hatások rákban

A korlátlan önmegújulás a rák egyik jellemzője, és a telomerek fenntartásával érhető el, alapvetően a telomerázon keresztül (hTERT) aktiválása. A h transzkripciós szabályozásaTERT úgy gondolják, hogy jelentős szerepet játszik a telomeráz aktiválásában emberi rákos megbetegedésekben.

Főtest

A telomeráz iránti domináns érdeklődés a rákban betöltött szerepéből adódik. A telomerek és a telomerfenntartó mechanizmusok szerepe jól megalapozott, mint a kromoszómális és genomiális instabilitás generálásának fő hajtóereje. A rákos sejtek a telomerhossz-fenntartó mechanizmusok révén, főként a telomeráz aktiválásával megszerezték azt a képességet, hogy legyőzzék öregedésük sorsát.

hTERT Az expressziót a tumorokban több genetikai és epigenetikai mechanizmus szabályozza, beleértve a hTERT erősítések, hTERT szerkezeti változatok, hTERT promóter mutációk és epigenetikai módosítások a hTERT promóter metiláció. Genetikai (hTERT promóter mutációk) és epigenetikai (hTERT promóter metiláció és miRNS) események klinikai vonatkozásai vannak a rákokban, amelyek a hTERT aktiválás. Tudva, hogy a telomerek kulcsfontosságúak a sejtek önmegújulásában, a telomerek fenntartásáért felelős mechanizmusok döntő szerepet játszanak a rákos betegségekben, és fontos onkológiai biomarkerek lehetnek. Így számszerűsítés helyett TERT expressziója és összefüggése a telomeráz aktivációval, a felelős mechanizmusok felfedezése és értékelése. TERT Az upregulation fontos információkat kínál, amelyek felhasználhatók a diagnózis, a prognózis és a kezelés monitorozására az onkológiában. Ezen túlmenően e mechanizmusok jobb megértése elősegítheti azok hatékony célzott rákterápiákká való átültetését.

Következtetés

Itt áttekintettük a h mögöttes mechanizmusokatTERT szabályozása, szerepük az onkogenezisben és a lehetséges klinikai alkalmazások telomeráz-dependens rákban.


Bevezetés

A telomerek olyan DNS-fehérje struktúrák, amelyek a lineáris kromoszómák végein találhatók. Segítenek fenntartani a genomi stabilitást egy speciális kupakszerkezet kialakításával, amely megvédi a kromoszómavégeket a degradációtól, a végpontok közötti fúzióktól és transzlokációktól (Bailey & Murnane, 2006). Az emlős telomerek telomer DNS-ből [egyszálú (ss) és kétszálú (ds) DNS-ből egyaránt] és különféle fehérjékből állnak, amelyek magját shelterin komplexnek nevezik (Palm & de Lange, 2008). Emberben a telomer DNS TTAGGG ismétlődések tandem elrendezéséből áll, amelyek születéskor 10-15 kb méretűek. Normál sejtekben a telomerek lerövidülnek minden sejtosztódási kör után, mivel a hagyományos DNS polimerázok nem képesek replikálni a lineáris DNS végeit (Olovnikov, 1973 Harley et al., 1990). A telomereket tekintik a sejtek proliferációs kapacitását korlátozó molekuláris órának, mivel a rövid telomerekről kimutatták, hogy replikatív öregedést indukálnak (Counter, 1996). Ezenkívül a telomerek rövidülését összefüggésbe hozták a szervezet öregedésével és számos, életkorral összefüggő emberi betegséggel (Garcia et al., 2007). Azok a mechanizmusok, amelyek képesek fenntartani a telomerek hosszát és a teljes telomer szerkezetet, elhúzódó sejtproliferációhoz és ezáltal az élettartam meghosszabbításához vezethetnek (Bodnar et al., 1998 Vaziri & Benchimol, 1998 Shay & Wright, 2007 Palm & de Lange, 2008).

A mechanizmus, amellyel a legtöbb eukarióta szintetizálja és fenntartja telomerjeit, a telomeráz enzim, egy ribonukleoprotein RT. A telomeráz minimálisan egy katalitikus fehérje alegységből, a telomeráz reverz transzkriptázból (TERT) és egy RNS molekulából, a telomeráz RNS-ből (TR) áll (Greider & Blackburn, 1985, 1989). Telomer ismétlődések szintetizálására de novo, a TERT egy RNS-templátot reverz átír a TR-en belül az ssDNS 3′-végeire (Autexier & Lue, 2006). A telomeráz egyik egyedülálló tulajdonsága, hogy képes a DNS-szubsztráttól való disszociáció nélkül katalizálni a telomer szintézis több körét, amely jellemző az ismételt addíciós folyamat (RAP) néven ismert (Greider, 1991).

Bármely telomeráz-komponens szabályozásának vagy expressziójának hibáit különféle humán patológiákkal hozták összefüggésbe. Például a telomeráz fokozódását számos emberi rákban azonosították (Kim et al., 1994), míg a csökkent telomeráz aktivitás és a rövid telomerek számos korai öregedési betegséggel járnak együtt (Garcia et al., 2007). A közelmúltban mutációk a hTERT és hTR géneket azonosítottak az idiopátiás tüdőfibrózisban (IPF) szenvedő betegek egy részében (Armanios et al., 2007 Tsakiri et al., 2007). Az IPF egy progresszív és végzetes tüdőbetegség, amelyet fibrózis és a tüdő parenchyma, és különösen az alveoláris epitélium károsodása jellemez (Dempsey, 2006). Míg a sérülés oka nem ismert, az aktív fibrózis helyei a sérült alveoláris hám nem megfelelő helyreállítását tükrözik, és a fibroblasztos gócok és az alveoláris apoptózis jelenléte az IPF jellemzőinek tekinthető (Dempsey, 2006). Az IPF egy korai öregedési betegség, amely jellemzően az élet ötödik évtizede után jelentkezik, és a prevalencia az életkorral növekszik. A betegség medián mortalitása körülbelül 3 év a kezdeti diagnózis után, és jelenleg nincs végleges kezelés. Az IPF terápiás stratégiáinak kidolgozásának egyik nehézsége a betegség etiológiájáért felelős mechanizmus tisztázatlansága, ezért az IPF megjelenése és kialakulása mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusok feltárása kulcsfontosságú a betegség megértéséhez.

Míg az IPF-es esetek többsége szórványosnak tekinthető, az IPF-ben szenvedő betegek körülbelül 15-20%-ának a családjában szerepel a betegség, amelyben az öröklődés mintázata konzisztens a változó penetranciájú autoszomális dominanciával (Marney et al., 2001). 2007-ben Tsakiri et al. több heterozigótát azonosított hTERT csíravonal mutációk a familiáris IPF-ben szenvedő betegek alcsoportjaiban. Azt is megállapították, hogy a fuvarozók a hTERT A mutációk rövidebb telomereket mutattak, mint az életkorban megegyező családtagok, akik nem hordozzák a mutációkat. Ez arra utal, hogy a telomeráz haploinsufficiencia a telomerek gyorsulásához vezethet, és így hozzájárulhat az IPF kialakulásához.

Mivel az IPF molekuláris mechanizmusai nagyrészt ismeretlenek, megvizsgáltuk, hogyan kapcsolódik az IPF hTERT A mutációk befolyásolják a telomeráz működését. Konkrétan három korábban azonosított hTERT mutáció hatásait jellemeztük, amelyek megfelelnek a V144M, R865C és R865H aminosav szubsztitúcióknak ( Tsakiri et al., 2007) a telomeráz funkcióról. Mivel a V144 aminosav az N-terminális TEN doménjében, az R865 pedig a rendkívül konzervált RT domén C motívumában található (1A. ábra), azt feltételeztük, hogy ezek az IPF-hez kapcsolódó hTERT mutációk megzavarják a telomeráz funkciót. Biokémiai és sejtes technikákat alkalmaztak annak meghatározására, hogy ezek a mutációk milyen hatást gyakorolnak a RAP-ra, a DNS-kötésre és a telomer DNS-szintézisre és a sejtnövekedésre. Ezek a vizsgálatok lehetővé tették számunkra, hogy azonosítsuk a hTERT V144-et és az R865-öt, mint két olyan maradékot, amelyek döntő szerepet játszanak a telomeráz működésében, a telomerek megnyúlásában és a sejthalhatatlanságban.

In vitro három IPF-hez kapcsolódó hTERT mutáns telomeráz aktivitása. (A) A telomeráz hTERT fehérje alegységének lineáris ábrázolása, amelyben mind a hTERT V144, mind az R865 jól konzervált a különböző fajok között. (B) Rekonstituált nyúl retikulocita lizátum (RRL) reakciók, amelyek hTERT vad típusú (WT), V144M, R865C vagy R865H voltak. in vitro telomeráz aktivitást a telomere repeat amplifikációs protokoll (TRAP) vizsgálattal RNS-áz A hiányában (-). Az RNS-A hozzáadásával (+) megszűnt a telomeráz aktivitás. A háromszögek az egyes reakciók ötszörös hígítását jelzik annak biztosítására, hogy az amplifikációs vizsgálatok a lineáris tartományban legyenek. Az üres pCI vektort tartalmazó RRL volt a negatív kontroll. Mivel a TRAP egy PCR-alapú vizsgálat, nem használható a teljes DNS-szintézis vagy az ismétlődő addíciós folyamatok számszerűsítésére, ezért egy specifikusabb hagyományos telomeráz assay-t (CTA) is elvégeztünk (C). A CTA kimutatta, hogy a hTERT V144M hasonló aktivitási szintekkel rendelkezik (DNS-szintézisként ábrázolva), mint a hTERT WT, azonban a hTERT R865C és R865H súlyos DNS-szintézis-hibát mutatott. (D) A hTERT WT és a hTERT V144M, R865C vagy R865H együttes expressziója hasonló aktivitást mutatott, mint a hTERT WT önmagában. IPF, idiopátiás tüdőfibrózis.


<p>Ez a rész minden hasznos információt tartalmaz a fehérjéről, főleg biológiai ismereteket.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Továbbiak. </a></p> Funkció i

A telomeráz egy ribonukleoprotein enzim, amely a legtöbb eukarióta kromoszómavégeinek replikációjához nélkülözhetetlen. Aktív a progenitor és a rákos sejtekben. Inaktív vagy nagyon alacsony aktivitású normál szomatikus sejtekben. A teleromeráz holoenzimkomplex katalitikus komponense, amelynek fő tevékenysége a telomerek meghosszabbítása reverz transzkriptázként működik, amely egyszerű szekvencia-ismétlődéseket ad a kromoszómavégekhez az enzim RNS-komponensén belüli templátszekvencia másolásával. Katalizálja a 3'-kromoszómavégek RNS-függő kiterjesztését a 6 nukleotidból álló telomer ismétlődő egységgel, az 5'-TTAGGG-3'-val. A katalitikus ciklus magában foglalja a primer megkötését, a primer kiterjesztését és a termék felszabadulását, amint a templát határát elérte, vagy a születőben lévő termék transzlokációját, majd további kiterjesztést. Aktívabb a 2 vagy 3 telomer ismétlődést tartalmazó szubsztrátumokon. A telomeráz aktivitást számos tényező szabályozza, köztük a telomeráz komplexhez kapcsolódó fehérjék, chaperonok és polipeptid módosítók. Modulálja a Wnt jelzést. Fontos szerepet játszik az öregedésben és az apoptózis elleni küzdelemben.

<p>Manuálisan válogatott információk, amelyekre publikált kísérleti bizonyítékok állnak rendelkezésre.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Továbbiak. </a></p> Kézi állítás az i


ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Sejttenyésztés

A méhnyakrákból származó C33A, SiHa, ME180 és HeLa sejtvonalakat, valamint a prosztatarákból származó TSU-PR1, PC3 és DU145 sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től szereztük be. A K562 leukémia sejtvonalat a Human Science Research Rescue Banktól szereztük be. Az előbbi sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajban, az utóbbit RPMI 1640 táptalajban növesztettük, mindkettőt 10% magzati borjúszérummal egészítettük ki 5% CO jelenlétében.2. A sejtdifferenciáció indukálására a K562 sejteket forbol-12-mirisztát-13-acetáttal (PMA) inkubáltuk 80 nM végső koncentrációban 48-72 órán keresztül.

Plazmid felépítés

A hTERT promoter-luciferáz konstrukciók szerkezetét egy korábbi tanulmányban leírták (21). Ezeket a riporter plazmidokat az enhanszer/promoter nélküli pGL3-bázisú luciferáz riporter plazmiddal (Promega, Madison, WI) hoztuk létre. Az MZF-2 expressziós vektor (pEF-BOS/MYC-MZF2), amelyet Dr. S. Nagata (Oszakai Egyetem, Oszaka, Japán) biztosított, tartalmazta az MZF-2 cDNS-t, amelyet az elongációs faktor promoter és a c-myc epitóp peptid vezérelt. szekvenciák a humán MZF-2 cDNS N-terminális végén (26). PCR-alapú helyspecifikus mutagenezist végeztünk a pGL3-776-MZF2MT mutáns riporter plazmid (27) megalkotására, amelyben a hTERT promoter potenciális hangtompítójában az MZF-2 négy konszenzus kötő motívuma szubsztitúciós mutációval megváltozott.

Luciferáz vizsgálat

A luciferáz riporter plazmidok tranziens transzfekcióját adherens C33A, SiHa, HeLa és ME100 sejtvonalakba, valamint nem tapadó K562 sejtekbe LipofectAMINE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) és Tfx-20 (Promega) segítségével végeztük az ajánlott protokollok szerint. a gyártók által. A luciferáz vizsgálatokat a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) segítségével végeztük, amelyben Renilla luciferáz plazmidokat kotranszfektáltunk kontroll plazmidként a transzkripció hatékonyságának standardizálása érdekében. Minden kísérletet legalább háromszor végeztünk minden plazmiddal, és az eredmények a relatív luciferáz aktivitás átlagos értékei.

Stretch PCR vizsgálat

A telomeráz aktivitás kvantitatív elemzéséhez nyújtási PCR vizsgálatokat végeztünk a Telochaser rendszerrel a gyártó protokollja szerint (Toyobo, Tokió, Japán). A PCR-termékeket 7%-os poliakrilamid gélen elektroforetizáltuk, és SYBR Green I nukleinsav gélfestékkel (FMC BioProducts, Rockland, ME) tettük láthatóvá. A PCR-amplifikáció hatékonyságának ellenőrzésére reakciónként 10 ng belső kontrollt λ fág DNS szekvenciákból (Toyobo) és 50 pmol specifikus primert (Toyobo) adtunk a PCR keverékhez. A relatív telomeráz aktivitást a telomeráz létrák sávintenzitásának mérésével és a belső kontrollokéval való összehasonlításával határoztuk meg. A sáv intenzitását NIH Image elemző szoftverrel mértük.

RT-PCR vizsgálat

A sejtvonalak teljes RNS-ének előállítása a korábban leírt AGPC módszerrel történt (28). Az első szál cDNS-eket AMV reverz transzkriptázzal (Pharmacia) szintetizáltuk 1 µg teljes RNS-sel a sejtvonalakból. Az egyes RNS mintákból szintetizált cDNS-eket 50 µl, 2 mM Tris-HCl-t (pH 8,0), 10 mM KCl-t, 0,01 mM EDTA-t, 0,1 mM DTT-t, 5% glicerint, 1 mM MgCl-t tartalmazó reakcióelegyben vizsgáltuk.2, 0,05% Tween-20, 0,05% Nonidet P-40, 5 U Taq DNS polimeráz, egyenként 200 µM dATP, dCTP, dTTP és dGTP, 5 µCi [32P]dCTP és 0,4 µM szensz és antiszensz primerek. A reakcióelegyet 90 °C-on 1 percig melegítettük, majd 26 PCR-ciklust hajtottunk végre, beleértve a 94 °C-on 1 percig tartó denaturálást, 1 percig 65 °C-on végzett annealizálást és 1,5 percig 72 °C-on történő meghosszabbítást. A PCR-termékeket 8%-os poliakrilamid gélen elektroforetizáltuk, és a szárított géleket autoradiográfiával analizáltuk. A PCR-reakciókhoz szensz és antiszensz oligonukleotid primereket használtunk az MZF-2-hez (5'-CCGGAGATGGGT-CACAGTCC-3' és 5'-TTGCTGAACACCTTGCCAC-3'). Az egyes mintákból származó cDNS-szintézis hatékonyságát PCR-rel becsültük meg GAPDH-specifikus primerekkel a korábban leírtak szerint (27).

Géleltolódási vizsgálat

A Cos7 és C33A sejtekből származó magkivonatokat a korábban leírtak szerint állítottuk elő (26). Az MZF-2 Cos7 sejtekben történő túlzott expressziójához 10 µg MZF-2 expressziós vektort transzfektáltunk 10 5 Cos7 sejtbe DEAE-dextrán módszerrel (28) 60 mm-es tenyésztőedényekben. 48 órás transzfekció után a sejteket összegyűjtöttük, és magkivonatokat készítettünk. Negatív kontrollként vak vektorokat transzfektáltunk hasonló módon. Géleltolódásos vizsgálatokban 5-10 µg sejtmag-kivonatokat inkubáltunk 0,5 µg poli(dI·dC)-vel jelöletlen kompetíciós anyagok jelenlétében vagy távollétében 20 percig jégen 25 µl-es reakciótérfogatban, amely 10% glicerint, 25 mM HEPES-t, pH-t tartalmazott. 7,9, 50 mM KCl, 0,5 mM PMSF, 1 mM ditiotreitol és 4 mg/ml szarvasmarha szérum albumin. Az inkubációt követően 10 000 c.p.m. 32 P-véggel jelölt oligonukleotid próbából, amelyek MZF-2 konszenzus motívumokat tartalmaztak -687-nél (5'-GTTTGCTCATGGTGGGGACCCCTCGCCG-3') vagy mutáns oligonukleotidokat (5'-GTTTGCTCATGGTAAAGACC) adtuk a reakciót a 4°-on. C további 20 percig. 4%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézist követően a gélt megszárítottuk és autoradiográfiának vetették alá. A szuperszitálási vizsgálatokhoz az anti-c-Myc epitóptag antitestet (9E10 SantaCruz) előinkubáltuk nukleáris kivonatokkal 1 órán át 4 °C-on, majd kötési reakciót követett.


A csökkent hTERT fehérjeszint DNS aneuploidiával jár a vastagbél nyálkahártyájában olyan betegeknél, akik régóta fekélyes vastagbélgyulladásban szenvednek.

Copyright: © Friis-Ottesen et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution License [CC BY_NC 3.0] feltételei szerint terjesztenek.

Ezt a cikket említik:

Absztrakt

Bevezetés

A colitis ulcerosa (UC) egy gyulladásos bélbetegség, amely a vastag- és végbélrák kialakulásának fokozott kockázatával jár, és a becslések szerint a 10 évnél hosszabb ideig tartó UC-ban szenvedő betegek 10%-ánál alakul ki vastagbélrák (1,2). A mögöttes patogenezis nem teljesen ismert, de a krónikus gyulladás torzítja a nyálkahártya morfológiáját, és diszpláziát, majd rákot indukál. A karcinómák főként hosszan tartó, 8-10 éves betegség után fordulnak elő (3), és alacsony és magas fokú diszplázia révén alakulnak ki. Beszámoltak arról, hogy azok a betegek, akiknél csak egy alacsony fokú diszpláziás elváltozás jelentkezik, karcinómákat is hordozhatnak (4). Az UC-s betegek vastagbélnyálkahártyája súlyos molekuláris rendellenességeket, például kromoszóma-instabilitást (5) és DNS-aneuploidiát is rejthet. A DNS aneuploidia jelen lehet az UC-s betegek diszpláziás és nem diszpláziás nyálkahártyájában, és a jelentések szerint összefügg a betegség időtartamával (6–9). Független rizikófaktorként jellemezhető az adenokarcinóma kialakulásában UC-ben (10,11). Azokat az UC-betegeket, akiknél diszplázia vagy adenokarcinóma alakul ki, általában progressziósnak tekintik, míg azokat a betegeket, akiknél ezek a fenotípusok nem alakulnak ki az UC élete során, nem progressziós betegeknek tekintik. Mivel a DNS-aneuploidia független kockázati tényezőnek tekinthető a rosszindulatú daganatok kialakulásában az UC-colon nyálkahártyájában, ezt is figyelembe vettük az UC-progresszor esetek meghatározó jellemzőjeként. Nem teljesen ismertek azok a mechanizmusok, amelyek mögött az UC-colon progresszív vagy nem-progresszív állapota áll, ezért érdemes megvizsgálni a nyálkahártya molekuláris jellemzőinek különbségeit az UC-vel érintett két vastagbéltípus között. A diszpláziás és nem diszpláziás elváltozások molekuláris jellemzői a progresszióban, amelyek nem találhatók meg a nem-progresszorokban, hozzájárulhatnak a karcinogenezis mögötti mechanizmusok megértéséhez az UC vastagbélben, ami markerként szolgálhat a veszélyeztetett egyének számára.

A telomeráz egy ribonukleoprotein, amely képes meghosszabbítani a telomer szekvenciát, és általában ismert, hogy csíravonal sejtekben aktív, és a legtöbb szomatikus sejtben inaktív. A telomeráz két fő alegysége a katalitikus alegység, a TERT-telomeráz reverz transzkriptáz (hTERT emberben) és a TR (TER), az RNS komponens (emberben a hTR vagy hTER). A hTERT és a hTR mellett számos járulékos fehérje is szorosan kapcsolódik a komplexhez (12). Általában feltételezik, hogy a hTERT szintje korlátozza a telomeráz komplex összeállítását, és a jelentések szerint a hTERT szerepet játszhat a sejtproliferációban is, függetlenül a telomerek megnyúlásában betöltött szerepétől (13). A telomeráz aktivitásról gyakran számolnak be rákos sejtekben, és

Az összes szolid daganat 80–90%-a, beleértve a vastag- és végbélrákot is, telomeráz aktivitásról számolt be (14–16). A telomeráz lehetővé teszi a rákos sejteket, hogy replikatív halhatatlanságot érjenek el, ami a rák egyik jellemzője (17). A telomeráz aktivitás ezért megnövelheti a sejt élettartamát, ami genetikai változások felhalmozódását eredményezheti a sejtben, ami ismét hozzájárulhat a rák kialakulásához (18). Az UC nyálkahártyájában azonban a telomeráz aktivitásról szóló jelentések a csökkent szintektől (19), a nem UC vastagbélektől eltérő szintektől (20–22) a megnövekedett aktivitásról szóló jelentésekig (23, 24) változnak. Mindezek a vizsgálatok a Telomer Repeat Amplification Protocol (TRAP)-assay vagy PCR-ELISA verzióit használták, amelyek érvényes módszerek a mintában lévő telomeráz aktivitás mérésére szöveti kivonatok felhasználásával. Az UC vastagbélben gyakran előforduló magas gyulladás miatt a makrofágok és a neutrofilek megnövekedett szintje van jelen, ezért az UC-s betegek vastagbélnyálkahártyájából származó szöveti kivonatok tartalmazhatják ezeket a sejttípusokat. A vastagbél nyálkahártya sejtjeinek TRAP-vizsgálata ezért nem feltétlenül tesz különbséget a telomeráz aktivitása között a makrofágokban és a szövetben lévő leukocitákban a hámsejtekétől, ami megnehezíti az eredmények értelmezését. Nevezetesen, az UC vastagbél nyálkahártyájában a telomeráz aktivitásról szóló tanulmányban, ahol a nyálkahártya sejteket elválasztották a stromasejtektől, az eredmények eltérő aktivitási szintet mutattak a két készletben. A telomeráz aktivitás szintje alacsony volt a diszpláziás nyálkahártyában, és összefüggést mutattak ki a telomeráz aktivitás és a gyulladás között. Ebben a jelentésben a DNS-státusz nem szerepelt (22). Azt is feltételezték, hogy az UC nyálkahártyájában a telomeráz-aktivitás megnövekedett szintje az aktívan gyulladt vastagbélszövet fokozott sejtproliferációjának közvetlen következménye (24).

Jelen tanulmányban immunhisztokémiát (IHC) használtunk a hTERT-szintek meghatározására az UC-anyagban, mivel ez azt az előnyt nyújtja, hogy a vizsgált szövetben meghatározott sejttípusokban a fehérje expresszióját értékeljük, így lehetővé válik a hTERT-t elhomályosító makrofágok és neutrofilek kizárása. szintű adatok. A hTERT fehérjeszinteket IHC-vel mértük a vastagbél nyálkahártya-sejtjeiben, hosszan tartó UC-ban szenvedő betegek progresszív és nem-progresszor vastagbéleinek csoportjában, hogy megvizsgáljuk, hogy a hTERT expressziójában mutatkozó különbségek összefüggésben állnak-e a progressor állapottal, a nyálkahártya diszpláziás fejlődésével vagy a DNS-sel. ploidy állapot.

Anyagok és metódusok

Betegek

Harminc, hosszan tartó UC-ben szenvedő beteg szerepelt ebben a jelentésben. Valamennyi beteg UC-ban szenvedett a colectomia előtt >10 évig, néhány beteg pedig 30 évig is szenvedett. A betegek életkora is nagy eltéréseket mutatott a tünetek első megjelenésekor (10 és 60 év között). A 10 nem progresszív beteg között 5 férfi és 5 nő volt. A haladók között 17 férfi és 3 nő volt. Ennek az anyagnak a kutatási célú felhasználását a Regionális Etikai Bizottság etikai jóváhagyásával engedélyezte, REK S-06062.

UC colectomiák: Progresszorok és nem haladók

A kolektómiás mintákat korábban már leírták Burum-Auensen és munkatársai (25). A kolektómiákat (n=30) progresszív és nem-progressziós csoportba soroltuk, így 10 nem progressziót szenvedőt tártak fel, amelyek nem mutattak diszpláziás elváltozást, és 20 progressort, amelyek mindegyike legalább egy diszplázia/rák területet mutatott. Az esetek többsége DNS-aneuploidiát is mutatott.

Minden colectómiából legalább nyolc helyet megvizsgáltak, és a progressorokon belül 83 nem diszpláziás területet azonosítottak, 31 területet meghatározatlan dysplasia, 29 diszpláziás területet és 8 adenocarcinomát. Mivel elemzéseink a rákmegelőző morfológiai változásokra összpontosítottak, az adenokarcinómákat kizártuk. Összesen 18 nem diszpláziás és 7 diszpláziás terület mutatott ki DNS aneuploidiát. A progresszív léziók az I. táblázatban láthatók. Definíció szerint a nem progresszív léziók diploidok és nem diszpláziások voltak.

I. táblázat

A progressor colectomiák elváltozásainak összefoglalása (n=20) morfológia és DNS-ploiditás szerint.

I. táblázat

A progressor colectomiák elváltozásainak összefoglalása (n=20) morfológia és DNS-ploiditás szerint.

Vastagbélminta #
30 70 71 99 132 159 164 169 174 176 177 191 192 199 205 225 1514 1701 1729 1789
Diploid Nem diszplázia 5 5 2 1 1 3 1 2 7 2 3 5 4 3 6 5 6 3 0 1
Határozatlan idejű diszplázia 0 0 0 0 2 1 2 1 0 2 1 0 1 5 2 1 1 2 2 0
Diszplázia 0 2 0 3 1 1 2 0 1 0 0 0 1 0 1 2 0 2 6 0
Adenocarcinoma 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0
Aneuploid Nem diszplázia 1 0 0 0 0 3 1 1 1 4 2 2 0 0 0 0 1 1 0 1
Határozatlan idejű diszplázia 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 3
Diszplázia 0 0 0 1 1 1 2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Adenocarcinoma 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

a Az adenokarcinómákat eltávolítottuk az elemzésekből.

HTERT IHC

Minden vastagbélben nyolc helyről szöveti mikrotömböket (TMA-kat) készítettek Beecher szöveti mikrotömb segítségével, a korábban leírtak szerint (25). A mag mérete 0,6 mm volt. Az összes magot korábban tapasztalt patológus (OPFC) értékelte. Minden nyálkahártya régióból legalább két szövetmagból vettünk mintát. Pozitív kontrollként két mandulametszetet használtunk. A metszeteket (4 μm) 10 percig 0,5%-os H 2 O 2 oldattal kezeltük, majd citrát pufferben, 6,0 pH-n antigént kinyertünk. A TMA-kat a telomeráz elleni primer antitesttel [egér monoklonális ab5181, hígítás (1:500) Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság] 1 órán át szobahőmérsékleten végeztük. A festést Ventana Nexes géppel végeztük Ventana Iview DAB detektáló készlettel (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) a gyártó utasításai szerint. Az elsődleges antitest helyett Tris-puffered sóoldattal (TBS) megfestett metszetek negatív festési kontrollként szolgáltak. A hTERT fehérje expresszióját minden mintára a pozitív sejtek százalékos arányaként határoztuk meg az 1200 véletlenszerűen kiválasztott nyálkahártya epiteliális sejtből. Csak a nukleáris festéssel rendelkező sejtek számítottak hTERT-expresszióra pozitívnak. A nem UC kontrollminta hTERT-festését és a magas és alacsony hTERT-szintű progresszív léziókat az 1. ábra mutatja be. Az antitest specifitását több humán rákos sejtvonal használatával teszteltük, és egyetlen 127 kDa-os sávot detektáltunk (1. ábra). 2).

1.ábra

Immunhisztokémia (IHC) a hTERT-hez. (A) Nem UC kontroll minta (a teljes metszetből), (B) ulcerosa colitis (UC)-lézió alacsony hTERT-szinttel és (C) UC-lézió magas hTERT-szinttel. Az UC vastagbél képei szöveti microarray (TMA) magokból származnak. Nyilak jelölik a vastagbél nyálkahártya sejtjeit, amelyek hTERT-re pozitívak alacsony expressziós szinten, a nyílhegyek pedig a hTERT-vel festett leukocitákat. A képek × 400-as nagyításúak.

2. ábra

Western blot analízis, amely megerősíti az ab5181, a hTERT expressziójára szolgáló monoklonális antitest specificitását. Az antitest specifikus volt, egyetlen sávot mutatott 127 kDa-nál, amikor több rákos sejtvonallal tesztelték.

Korábban bemutattuk ennek az anyagnak a Ki67 immunfestését, amely szignifikánsan megemelkedett Ki67 szintet mutatott UC vastagbélben a nem UC kontrollokhoz képest (25).

Statisztikai analízis

Mivel a vizsgálatba bevont betegek egynél több biopsziával járultak hozzá, értékeltük a fehérjeexpresszió szintjét a morfológiai paraméterekhez viszonyítva, valamint a hTERT és Ki67 fehérjeszintjének asszociációs elemzését egy többszintű modell segítségével, amely kompenzálja a betegek különbségei. A lineáris vegyes modellt (LMM), korlátozott maximális valószínűség (REML) becslésekkel és Bonferroni post-hoc teszttel végeztük. A teszteket a PASW® statisztikákban 18 (Chicago, IL, USA) végeztük. Minden teszt kétoldalas volt, és a 0,05-ös p-szintet jelölték szignifikanciaként.

Eredmények

TMA értékelés

A TMA-k nem mutatnak következetesen teljes vastagbél-kriptákat, amint azt a teljes metszetekben megfigyeltük, de mivel azt találtuk, hogy a hTERT expressziója a vizsgálatunkban egyenletesen oszlik el a vastagbél nyálkahártyájában, arra a következtetésre jutottunk, hogy a hTERT fehérje szintje megbízhatóan becsülhető (az adatok nem láthatók).

Mivel a Ki67 fehérje expressziója az UC-colon nyálkahártyájának növekedési frakciójához kapcsolódik, a TMA-kat nem tartottuk megbízhatónak a diszpláziás fejlődéshez kapcsolódó Ki67 expresszió értékelésében.

A Ki67 fehérje expressziójának értékelését ugyanazon szöveti magokon belül végeztük, mint a hTERT fehérje értékelésénél, így a hTERT és a Ki67 közötti összefüggés értékelését megbízhatónak tekintettük.

A hTERT szintje a vastagbél nyálkahártyájában progresszív és nem progresszív betegek esetében

A hTERT szintje szignifikánsan megemelkedett (p<0,001) a progresszív és nem progressziós betegek vastagbélnyálkahártyájában a nem UC kontrollokhoz képest (3. ábra). Nem tapasztaltunk különbséget a progresszív és a nem progresszív colectómiák összehasonlításában. Korábban bemutatták a Ki67 statisztikailag emelkedett szintjét a teljes UC vastagbélben a nem UC kontrollokhoz képest (25).

3. ábra

hTERT colitis ulcerosa (UC) progressziójában, nem progressziójában és nem UC kontrollokban. A hTERT immunhisztokémiával (IHC) kimutatott fehérjeszintjei progresszív, nem progresszív és nem UC kontrollokban.

A hTERT szintje a vastagbél nyálkahártyájában progressor colectomiák esetén

A progressziókat a kezdeti életkor szerint osztották fel, mivel a közelmúltban kimutatták, hogy az UC késői kezdetével (>50 éves korig) progresszívek a telomerbiológiában különböztek az UC korai kezdetű progresszióitól (<50 évesek) (26). Az eredmények nem mutattak statisztikai különbséget a hTERT fehérjeszintjében a késői és korai UC összehasonlítása során (p=0,2).

A hTERT expresszió szintjében nem volt kimutatható statisztikailag szignifikáns különbség a diploid léziók és az aneuploiditást mutató léziók között, a nyálkahártya morfológiájában mutatkozó különbségek korrekciója nélkül (p=0,12). Nem találtunk szignifikáns különbséget a hTERT-szintben a nem diszpláziás elváltozások, a diszplázia miatt határozatlan elváltozások és a dysplasiás elváltozások között a DNS-ploiditás korrekciója nélkül (p=0,14). Azonban amikor a nyálkahártya morfológiájára rétegeztük, és összehasonlítottuk a diploid elváltozásokon belüli hTERT fehérjeszinteket az aneuploid populációkat hordozó léziókkal, azt találtuk, hogy az aneuploid léziók általában kisebb hTERT-expressziót mutattak, mint a diploid társaiké (4. ábra).

4. ábra

hTERT progressorok diploid és aneuploid lézióiban. A hTERT expressziója nem-progresszorokban és különböző morfológiájú területeken, amelyek diploid vagy aneuploid populációkat tartalmaznak a progresszorokban.

A progresszív vastagbél nem diszpláziás aneuploid és diploid lézióin belül a hTERT szintek statisztikailag szignifikáns mértékben (p=0,037) különböztek az LMM alkalmazásával, figyelembe véve a betegek közötti különbségeket. Az egyes morfológiai csoportokon belüli DNS-ploiditási állapotra LMM alkalmazásával kimutatott p-értékeket a II. táblázat tartalmazza. A betegek közötti különbségek figyelmen kívül hagyásával és a t-teszt használatával statisztikailag szignifikáns különbséget találtunk a DNS-ploiditásra rétegzett hTERT-szintek között a diszplázia szempontjából határozatlannak minősített léziókon belül. A diploid léziókban magasabb volt a hTERT szint, mint az aneuploid léziókban.

Táblázat II

A hTERT fehérjeszintek LMM teszt p-értékei a DNS-ploiditás státuszra rétegezve a progresszióktól eltérő morfológiai stádiumokon belül.

Táblázat II

A hTERT fehérjeszintek LMM teszt p-értékei a DNS-ploiditás státuszra rétegezve a progresszióktól eltérő morfológiai stádiumokon belül.

Morfológia p-érték
Nem diszplázia 0.037
Határozatlan idejű diszplázia esetén 0.374
Diszplázia 0.565

A hTERT és a Ki67 fehérjeszintjei közötti összefüggések progresszív és nem progresszív betegek vastagbél nyálkahártyájában

A hTERT és a Ki67 közötti asszociációs analízis statisztikailag szignifikáns eredményeket mutatott ki a nem progresszív csoportokon belül (p=0,047) az LMM alkalmazásakor, kompenzálva a betegek eltéréseit. Nem volt kimutatható összefüggés a progresszorok különböző léziói között (III. táblázat). Nem találtunk összefüggést a hTERT és a Ki67 fehérjeszintje között a progresszorokon belül, amikor a DNS-ploiditás státuszát rétegeztük.

Táblázat III

LMM-analízisekből generált P-értékek a hTERT és a Ki67 fehérje expressziója közötti összefüggésre az UC-morfológiában.

Táblázat III

LMM-analízisekből generált P-értékek a hTERT és a Ki67 fehérje expressziója közötti összefüggésre az UC-morfológiában.

Morfológia p-érték
Nem haladó 0.047
Nem diszplázia 0.097
Határozatlan idejű diszplázia esetén 0.102
Diszplázia 0.731

[i] LMM, lineáris vegyes modell UC, colitis ulcerosa.

Minden elemzést elvégeztünk, kizárva az összes adenokarcinómát tartalmazó esetet. Ez nem változtatta meg statisztikailag szignifikáns mértékben az eredményeket.

Vita

Jelen vizsgálatunkban szignifikánsan megemelkedett hTERT fehérjeszintet találtunk mind a progressor, mind a non-progressor UC colectómiák nyálkahártyájában a non-UC kontroll mintákhoz képest (p<0,001), de nem észleltünk szignifikáns különbséget a progressor hTERT szintjei között. és nem haladó kollektómiák. Az UC a jelentések szerint a vastagbél nyálkahártyájának felgyorsult öregedésével járó betegség (27), amely megnövekedett sejtosztódási rátával jár, amint azt Greco és munkatársai dokumentálták (28). Az a tény, hogy hasonló hTERT-szinteket észleltünk progresszív és nem progresszív colectómiákban, összhangban van ezekkel a tanulmányokkal, mivel a betegek >10 évig szenvedtek UC-ban. Emelkedett hTERT-szintet találtak enyhén aktív UC-ban az UC-ban szenvedő betegek nyálkahártyájában átlagosan 6 évig (29).

For examination of possible differences in the levels of hTERT within the progressors we stratified the areas of the 20 progressor colectomies by morphological characteristics, and compared diploid areas with areas containing aneuploid clones, using LMM. This comparison showed a pattern of lower hTERT expression in aneuploid lesions within areas of similar morphology. Within the non-dysplastic lesions this difference was statistically significant (p=0.037). If each lesion was included in the analysis as independent data entries (Student’s t-test), we found a significant difference between hTERT levels in diploid and aneuploid lesions indefinite for dysplasia. However, the protein levels of hTERT vary between patients, a fact that potentially affects our statistical findings, creating false positives. Several of the aneuploid lesions of indefinite dysplastic morphology were found within the same colon (Table I), and this could skew our results. We therefore found the p-values yielded by the LMM analysis controlling for patient variations to be valid. The hTERT-protein expression in diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the levels found in the non-progressors, which are all non-dysplastic and diploid. This shows that when the confounding factor of differences in mucosal morphology is accounted for, reduced levels of hTERT are linked to DNA aneuploidy and possibly also associated with its development. Increased levels of hTERT may enhance the proliferative activity of the inflamed tissue harbouring increased levels of reactive oxygen species (ROS), and possibly contribute to the development of dysplasia and cancer. It has been demonstrated that UC colons have enhanced cell proliferation (24) and elevated levels of ROS (30). Both these agents are reported to facilitate telomere shortening. Too short or even missing telomeres can induce breakage-fusion-bridge (BFB) cycles, which again can lead to chromosomal instability (5) and DNA aneuploidy (31,32). Elevated levels of BFB were shown in UC-progressor colons, but DNA-ploidy status of the lesions examined was not investigated (31). Activation of telomerase can prevent BFB-cycles by adding telomeric sequences to short telomeres or broken chromosome ends (33). Our results showing less hTERT present in lesions that contain aneuploid cell populations are consistent with these results.

UC progressors have been shown to differ in mean telomere length depending on the patients’ age at disease onset, where early onset (<50 years of age when diagnosed) harboured shorter telomeres than those observed in UC progressors with later UC onset (26). All our patients had suffered from active colitis for >10 years at the time of colectomy and all had presented extensive colitis. Only two progressors were diagnosed with UC after the age of 50, and these did not differ in hTERT expression from the patients diagnosed at an earlier age.

It is possible that any differences in hTERT levels of the colonic mucosa between the progressors and non-progressors were levelled out by continuous impairment of the colonic mucosa due to inflammation and regeneration. Telomeres in UC colonic mucosa are reported to shorten more rapidly than in non-UC mucosa (27,31), and activation of telomerase might be a response to this attrition. This could indicate that hTERT expression is not a biomarker for differentiating a progressor colon from a non-progressor colon prior to colectomy.

A study of four colectomies from patients suffering from UC for >20 years revealed a regional correlation between dysplasia and telomerase activity measured by a version of the ELISA. One patient did not present dysplasia or telomerase activity (23). However, the ELISA method used in the study detected assembled telomerase enzyme complexes, and it was suggested that lack of detected telomerase activity in some of the samples could be due to degradation of the RNA component of the holoenzyme prior to sampling (23). IHC of hTERT may omit tissue-based problems such as partial degradation, as it is based on visual examination of stained formalin or alcohol-fixed, paraffin-embedded tissue.

IHC facilitates the investigation of protein expression in specific cell types within a tissue. This feature can prove valuable when examining UC colons, where a high percentage of leucocytes are generally present in the mucosa. Examining hTERT protein expression by IHC allowed us to assess the differences in the extent of hTERT expression in the colonic mucosal cells, without the confounding contributions from mucosal leukocytes. In a report examining coronary plaques, neutrophils were found to have elevated levels of telomerase activity (34). This is confirmed in our study by the presence of hTERT-positive leucocytes in the lamina propria (Fig. 1).

However, immunohistochemical detection of hTERT has proven to be a difficult task, as some antibodies can also bind to other proteins not associated with telomerase activity (35), antibodies that are not commercially available, or those that are commercially available but have not been proven to be specific (i.e., non-specific cytoplasmic rather than specific nuclear staining). As new antibodies binding to hTERT have become available and tested for binding specificity, reports of hTERT-expression have emerged. Elevated levels of hTERT in precancerous lesions have been identified in gastric tissue (36), and colonic adenocarcinomas (37). The hTERT protein levels of colonic mucosa may provide insight into the transition from normal-looking mucosal morphology towards a possible colorectal cancer, as normal colonic mucosa has low hTERT levels, whereas colorectal cancers have high levels of hTERT (38). In our study the nuclear hTERT staining was very distinct. The monoclonal hTERT antibody used was specific, as confirmed by western blotting of several human cancer cell lines that showed a single band at 127 kDa as expected (Fig. 2). We have previously shown, that progressors harboured significantly more ultra-short telomeres compared to non-progressor colons, and that the difference remained statistically significant when we compared the diploid, non-dysplastic progressor lesions to the non-progressors. In terms of mean telomere length, no difference was found between progressors and non-progressors (39). Thus, an association between mean telomere length and hTERT protein levels seems to exist, whereas no association was observed between the amount of ultra-short telomeres and levels of hTERT in longstanding UC.

In a previous study, our group showed that the proliferation marker Ki67 was significantly elevated in UC colons compared to non-UC control samples, thus confirming that proliferation is enhanced in UC colonic mucosa (25). Also, protein expression of Ki67 has been shown to increase with advancing degree of growth fraction due to the developing stage of dysplasia in the colonic mucosa of the UC colon (40). We found that hTERT expression was significantly associated with the expression of Ki67 within the non-progressor lesions. Within the progressors this association was lost, even when diploid, non-dysplastic lesions were examined separately. Together with our findings of a borderline significant p-value for association between hTERT and Ki67 within progressor non-dysplasia, and no significance detected within the increasing levels of distorted morphology (Table III), it seems the association between proliferation and hTERT protein expression is lost during the development of dysplasia. The lack of difference in hTERT protein levels between progressors and non-progressors, together with elevated amounts of ultra-short telomeres identified in the progressor lesions and the hTERT/Ki67association found only within non-progressors leads to the hypothesis that the positive association between hTERT and Ki67 in the non-progressors may be a protective agent against shortening of the cells telomeres.

In conclusion, we have shown that the protein levels of hTERT were significantly elevated in the mucosa of progressors and non-progressor UC colons compared to non-UC control samples. In the progressor colons, aneuploid non-dysplastic lesions had a significantly lower expression of hTERT than the diploid non-dysplastic lesions, and diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the non-progressors with regard to expression of hTERT protein in the colonic mucosal cells, thus low levels of hTERT associated with aneuploidy. We also found that within the non-progressors there was an association of hTERT expression and expression of the proliferation marker Ki67. No association of hTERT/Ki67 protein expression was detected in the progressors, even when only diploid non-dysplastic lesions were examined, indicating that the association of the two proteins may act as a protective mechanism against the development of progressor characteristics within a UC colon.

Köszönetnyilvánítás

The authors would like to thank Thu Hong Thy Nguyen for helping with western blotting. This study was made possible by the generous funding from South-Eastern Norway Regional Health Authority and by Stiftelsen UNI. These organisations had no role in collecting, analysing or interpreting the data or in writing the report.

Hivatkozások

Macdougall IP: The Cancer risk in ulcerative colitis. Gerely. 2:655–658. 1964. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI


Bevezetés

Telomeres are nucleoprotein structures, which protect the ends of linear chromosomes from being recognized as DNA double-strand breaks [1]. Telomeres shorten with each round of cell division due to the end-replication problem. Normal human somatic cells replicate until their telomeres diminish to a critical threshold, at which point they enter permanent cell cycle arrest and are constrained to a senescent state [2]. Bypass of senescence due to loss of function of the p53 and pRB tumor suppressor pathways results in further telomere shortening which eventually becomes catastrophic, causing end-to-end fusions, genetic instability, and the potential for tumorigenesis.

Telomere shortening may be counteracted by telomerase, a ribonucleoprotein enzyme complex that synthesizes the repetitive telomeric DNA sequence (5'-TTAGGG-3') [3]. The subunits of telomerase include a reverse transcriptase protein, TERT, and an RNA molecule, hTR, which contains a template region. Telomerase activity is detectable during human development from the blastocyst stage to 16–18 weeks gestation in specific tissue types, but is undetectable in most tissues by two months post-natal [4]. In healthy adults, telomerase activity is restricted to germline cells (in the testes and ovaries) [4], peripheral blood mononuclear cells [5,6] and stem cells [7], presumably to support the proliferative requirements of these cell types. In germline cells, there is sufficient telomerase activity to prevent telomere shortening, but in somatic cells the level of telomerase activity is limited, and is only sufficient to slow down the telomere attrition that accompanies normal DNA replication. In contrast, in the great majority of cancers and immortalized cell lines telomere length is maintained in 85% of cancers this is due to upregulated levels of telomerase and in the remainder this is due to a non-telomerase mechanism [8,9].

One of the ways in which telomerase activity levels appear to be regulated is via alternative splicing of the TERT pre-mRNA [10]. The TERT gene contains 16 exons, and the TERT pre-mRNA can be spliced to yield more than 20 variant mRNAs [11–13]. During human development, loss of telomerase activity in somatic cells is associated with a change in the TERT splicing pattern such that the transcriptional output of the TERT gene consists entirely of splice variants that do not encode active TERT protein [14,15]. Control of alternative splicing is incompletely understood, but there is evidence that this may involve RNA:RNA pairing within the TERT pre-mRNA [16], and that it may be regulated by the cellular microenvironment [17]. Some of the splice variants encode proteins which can act as dominant negative inhibitors of telomerase activity [18,19]. This may be due in part to their ability to become incorporated into the telomerase enzyme complex, because biochemical studies have demonstrated that telomerase exists as a dimer and that its activity is dependent on both of the hTERT active sites being functional [20].

Mutations in hTERT, and in other genes that are required for normal telomere function, can cause short telomere syndromes, which are characterized by proliferative failure in various tissues, especially the bone marrow, lungs, and liver [21,22]. Patients suffering from these syndromes have a substantially increased risk of cancer [22,23], presumably due to excessive telomere shortening and an increased risk of genetic instability. In contrast to the high risk associated with these relatively rare mutations, genome-wide association studies (GWAS) have uncovered numerous single nucleotide polymorphisms (SNPs) in, or close to the hTERT gene which are relatively common in the population and are associated with a small, but highly significant increase in cancer susceptibility ([13,24–27] reviewed in [28]). Associations have also been found between hTERT SNPs and telomere length [13,24,29].

Despite the statistical robustness of GWAS, the associations remain observational. This is partly because most GWAS have only reported associations with the tagging SNPs in the TERT-CLPTM1L region on the commercial genotyping chips, but fine mapping is required to identify the putative causal SNPs. Mechanistic analysis is required to identify causal rather than correlated variants, and to accurately determine cancer risk. A functional understanding of causative variants may ultimately influence clinical decision-making.

Through our involvement with the Collaborative Oncologic Gene-Environment Study (COGS), we were able to carry out fine mapping of the hTERT locus. This study revealed that the minor alleles at rs10069690 and at rs2242652 were candidate causal variants for risk of estrogen receptor-negative breast cancer, breast cancer in BRCA1 mutation carriers, serous low malignant potential ovarian cancer and serous invasive ovarian cancer with odds ratios ranging from 1.15–1.40 [13,24] and for risk of prostate cancer [13,24]. This rs10069690 SNP is also associated with risk of a wide variety of cancers, including colon cancer, acute lymphoblastic leukemia (ALL), and chronic lymphocytic leukemia (CLL) [25,30–32]. However, no fine mapping has been performed for the latter associations to determine whether it is likely to be directly responsible or simply correlated with a better candidate causal SNP. Consequently, there is a growing need to delineate how this allele confers cancer risk.

We previously generated hTERT minigenes, which included intron 4 with the major (G) or minor, cancer-risk associated (A) allele at rs10069690 [13]. Transfection of these minigenes into the telomerase-positive breast cancer cell line MCF7, and RT-PCR using primers spanning intron 4, revealed an additional band in the presence of the A allele [13]. When this band was excised and sequenced it was identified as a novel hTERT splice variant, INS1b, which contains an intron 4 insert of 480 base pairs. Sequence analysis showed that this transcript was the product of an alternative splicing event at an additional splice donor site created by the G to A polymorphism at rs10069690 (Fig 1A).

(A) Schematics of hTERT minigenes generated by inserting the intron 4 sequence, containing either the major (G) or minor (A) allele at rs10069690, into an hTERT cDNA expression construct. The sense-strand sequence of the minigene from the end of exon 4 to the beginning of exon 5 is shown. The red text indicates the splice site consensus sequences with vertical lines representing the exon-intron boundaries. The minor allele at rs10069690, a G to A polymorphism, introduces an additional splice donor site into the sequence. If this site is utilized, 480 bp of intron 4 is retained within the mature mRNA. (B) Schematic of mRNA and protein expression resulting from the minor allele at rs10069690. RT-PCR using primers spanning from the end of exon 3/beginning of exon 4 to the middle of exon 6 generate a 441 bp product from canonically spliced hTERT mRNA, and products that are 38 bp and 480 bp larger from alternative hTERT splice products INS1 and INS1b, respectively. The alternative splice variant formed from the utilization of the additional splice donor site contains a premature stop codon and is therefore predicted to encode a truncated form of hTERT, which contains the telomerase N-terminal (TEN) and RNA binding (RBD) domains, but not the reverse transcriptase (RT) and C-terminal (C-term) domains. (C) Three cell lines (HT1080, MCF7 and A2780) and cell strain (Fre-71s-1) were transfected with hTERT minigenes containing intron 4 with either the Major (G) or Minor (A) allele of rs10069690. RT-PCR was performed with the primers indicated in Fig 1B and products were separated by gel electrophoresis. In each case, the minigene with the minor allele at rs10069690 resulted in co-expression of canonical hTERT, and the variants INS1 and INS1b. Other bands were identified as non-specific (ns) hybrid DNA species, including a mixture of INS1b and canonical hTERT (INS1b/hTERT) transcripts. (D) RT-PCR was performed on cell lines homozygous (AA) or heterozygous (AG) for the minor allele at rs10069690 to identify endogenous expression of INS1b.

In the present study, we investigated the mechanism by which the SNP confers elevated cancer risk. We found that the presence of this polymorphism resulted in the production of both full length and an alternatively spliced hTERT transcript, which were expressed in a cell type-specific manner. The alternative transcript produced a severely truncated protein (INS1b), which retained its hTR binding capability but lacked the reverse transcriptase domain. INS1b directly caused decreased telomerase activity, telomere shortening, and an elevated telomere-specific DNA damage response. Our data demonstrate that INS1b binds to hTR, sequestering it in an inactive form, thereby acting in a dominant negative manner to limit the amount of active telomerase available to extend the telomeres. The combination of the fine mapping data and a mechanism for cancer risk make it highly likely that this is a causal, rather than a correlated cancer risk SNP.


BEVEZETÉS

Lung cancer retains the leading position in cancer-related deaths in the United States. In 2002, it is estimated that there will be 154,900 deaths and 169,400 new cases from lung and bronchial cancer in the United States, compared with 156,900 deaths and 164,100 new cases in 2000 (1) . NSCLC3 comprises more than 80% of lung cancers, and complete surgical resection of primary tumors in early-stage disease is the only potentially curative treatment. For patients with stage I NSCLC (about 17% of all patients with NSCLC), the average 5-year survival rate is about 60%. Adjuvant cytotoxic chemotherapy has been proposed and evaluated in the setting of NSCLC, and it offers limited hope of improving prognosis (2) . One area of intense research on early-stage NSCLC is the identification of molecular markers to complement TNM staging to fully assess the prognosis of patients and to evaluate the effects of novel chemotherapy agents and regimens (3) . Such prognostic markers include a wide variety of protein molecular markers that can be classified by different antibodies as molecular genetic markers, metastatic propensity markers, differentiation markers, and proliferation markers (3) . Other markers have been evaluated at the mRNA level including retinoic acid receptor-β, cyclooxygenase-2, vascular endothelial growth factor, MMP-2 and -9, E-cadherin, angiopoietin-2, and CD44. These markers have been associated with clinicopathological variables and survival time in patients with NSCLC (4, 5, 6, 7, 8) .

Telomerase is a ribonucleoprotein enzyme that lengthens chromosome ends that have been shortened during successive cycles of cell division (9) . Telomerase is expressed in up to 85% of NSCLCs (10 , 11) , and its activation plays a critical role in tumorigenesis by sustaining cellular immortality (12 , 13) . Hahn et al. (14) proved that disruption of the intracellular pathways regulated by large T antigen, oncogenic ras, and telomerase suffices to create a human tumor cell. The components of human telomerase include an RNA subunit (hTERC), a catalytic protein subunit (hTERT), and other telomerase-associated proteins (15) . It has been shown that the expression pattern of hTERT is closely associated with telomerase activity (16, 17, 18) . The recent development of ISH techniques that can reliably detect hTERT mRNA has made it possible to examine the expression of this critical telomerase component at the single-cell level (18, 19, 20, 21) . In our previous study (22) , we evaluated hTERT expression in bronchial biopsy samples and found that it was a frequent event and appeared at a very early stage in cigarette smoking-induced lung carcinogenesis, making it clearer that telomerase plays a critical role in tumorigenesis. Because we have established a reliable ISH technique for detecting hTERT mRNA expression in paraffin-embedded tissue, we decided to evaluate the prognostic value of hTERT in a relatively homogeneous tumor, in a population of 153 patients with stage I NSCLC.


Hivatkozások

Blackburn EH: Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Lett. 2005, 579: 859-862. 10.1016/j.febslet.2004.11.036.

Shay JW, Bacchetti S: A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer. 1997, 33: 787-791. 10.1016/S0959-8049(97)00062-2.

Belgiovine C, Chiodi I, Mondello C: Telomerase: cellular immortalization and neoplastic transformation. Multiple functions of a multifaceted complex. Cytogenet Genome Res. 2008, 122: 255-262. 10.1159/000167811.

Nakayama J, Tahara H, Tahara E, Saito M, Ito K, Nakamura H, Nakanishi T, Tahara E, Ide T, Ishikawa F: Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nat Genet. 1998, 18: 65-68. 10.1038/ng0198-65.

Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, Caddle SD, Ziaugra L, Beijersbergen RL, Davidoff MJ, Liu Q, Bacchetti S, Haber DA, Weinberg RA: hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Sejt. 1997, 90: 785-795. 10.1016/S0092-8674(00)80538-3.

Horikawa I, Barrett JC: Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003, 24: 1167-1176. 10.1093/carcin/bgg085.

Flores I, Benetti R, Blasco MA: Telomerase regulation and stem cell behaviour. Curr Opin Cell Biol. 2006, 18: 254-260. 10.1016/j.ceb.2006.03.003.

Ohmura H, Tahara H, Suzuki M, Ide T, Shimizu M, Yoshida MA, Tahara E, Shay JW, Barrett JC, Oshimura M: Restoration of the cellular senescence program and repression of telomerase by human chromosome 3. Jpn J Cancer Res. 1995, 86: 899-904.

Tanaka H, Shimizu M, Horikawa I, Kugoh H, Yokota J, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for a putative telomerase repressor gene in the 3p14.2-p21.1 region. Genes Chromosomes Cancer. 1998, 23: 123-133. 10.1002/(SICI)1098-2264(199810)23:2<123::AID-GCC5>3.0.CO2-4.

Horikawa I, Oshimura M, Barrett JC: Repression of the telomerase catalytic subunit by a gene on human chromosome 3 that induces cellular senescence. Mol Carcinog. 1998, 22: 65-72. 10.1002/(SICI)1098-2744(199806)22:2<65::AID-MC1>3.0.CO2-J.

National Center for Biotechnology Information. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]

Horikawa I, Cable PL, Mazur SJ, Appella E, Afshari CA, Barrett JC: Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene transcription: evidence for an endogenous mechanism of transcriptional repression. Mol Biol Cell. 2002, 13: 2585-2597. 10.1091/mbc.E01-11-0107.

Ducrest AL, Amacker M, Mathieu YD, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M, Lingner J: Regulation of human telomerase activity: repression by normal chromosome 3 abolishes nuclear telomerase reverse transcriptase transcripts but does not affect c-Myc activity. Cancer Res. 2001, 61: 7594-7602.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. Cancer Res. 2003, 63: 689-695.

Dowdy SF, Scanlon DJ, Fasching CL, Casey G, Stanbridge EJ: Irradiation microcell-mediated chromosome transfer (XMMCT): The generation of specific Chromosomal arm deletions. Genes Chromosomes Cancer. 1990, 2: 318-327. 10.1002/gcc.2870020410.

Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER: Search for unknown tumor-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003, 38: 307-321. 10.1002/gcc.10271.

Buerstedde JM, Takeda S: Increased ratio of targeted to random integration after transfection of chicken B cell lines. Sejt. 1991, 67: 179-188. 10.1016/0092-8674(91)90581-I.

Dieken ES, Epner EM, Fiering S, Fournier RE, Groudine M: Efficient modification of human chromosomal alleles using recombination-proficient chicken/human microcell hybrids. Nat Genet. 1996, 12: 174-182. 10.1038/ng0296-174.

Koi M, Lamb PW, Filatov L, Feinberg AP, Barrett JC: Construction of chicken x human microcell hybrids for human gene targeting. Cytogenet Cell Genet. 1997, 76: 72-76. 10.1159/000134519.

Kuroiwa Y, Shinohara T, Notsu T, Tomizuka K, Yoshida H, Takeda S, Oshimura M, Ishida I: Efficient modification of a human chromosome by telomere-directed truncation in high homologous recombination-proficient chicken DT40 cells. Nucleic Acids Res. 1998, 26: 3447-3448. 10.1093/nar/26.14.3447.

Meaburn KJ, Parris CN, Bridger JM: The manipulation of chromosomes by mankind: the uses of microcell-mediated chromosome transfer. Chromosoma. 2005, 114: 263-274. 10.1007/s00412-005-0014-8.

Nishimoto A, Miura N, Horikawa I, Kugoh H, Murakami Y, Hirohashi S, Kawasaki H, Gazdar A, Shay J, Barrett JC, Oshimura M: Functional evidence for a telomerase repressor gene on human chromosome 10p15.1. Onkogén. 2001, 20: 828-835. 10.1038/sj.onc.1204165.

Oshimura M, Barrett JC: Multiple pathways to cellular senescence: role of telomerase repressors. Eur J Cancer. 1997, 33: 710-715. 10.1016/S0959-8049(97)00090-7.

Tanaka H, Horikawa I, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for inactivation of distinct telomerase repressor genes in different types of human cancers. Int J Cancer. 2005, 115: 653-657. 10.1002/ijc.20879.

Ji L, Minna JD, Roth JA: 3p21.3 tumor suppressor cluster: prospects for translational applications. Future Oncol. 2005, 1: 79-92. 10.1517/14796694.1.1.79.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. Cancer Res. 2003, 63: 689-695.

Yang ZQ, Yoshida MA, Fukuda Y, Kurihara N, Nakamura Y, Inazawa J: Molecular cytogenetic analysis of 17 renal cancer cell lines: increased copy number at 5q31-33 in cell lines from nonpapillary carcinomas. Jpn J Cancer Res. 2000, 91: 156-163.

Garzon R, Calin GA, Croce CM: MicroRNAs in Cancer. Annu Rev Med. 2009, 60: 167-179. 10.1146/annurev.med.59.053006.104707.

Mitomo S, Maesawa C, Ogasawara S, Iwaya T, Shibazaki M, Yashima-Abo A, Kotani K, Oikawa H, Sakurai E, Izutsu N, Kato K, Komatsu H, Ikeda K, Wakabayashi G, Masuda T: Downregulation of miR-138 is associated with overexpression of human telomerase reverse transcriptase protein in human anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Cancer Sci. 2008, 99: 280-286. 10.1111/j.1349-7006.2007.00666.x.

Hoshiya H, Kazuki Y, Abe S, Takiguchi M, Kajitani N, Watanabe Y, Yoshino T, Shirayoshi Y, Higaki K, Messina G, Cossu G, Oshimura M: A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene. Mol Ther. 2009, 17: 309-317. 10.1038/mt.2008.253.

Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, Shirayoshi Y, Oshimura M: Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 321: 280-290. 10.1016/j.bbrc.2004.06.145.

Kazuki Y, Hoshiya H, Kai Y, Abe S, Takiguchi M, Osaki M, Kawazoe S, Katoh M, Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Kajitani N, Yoshino T, Shirayoshi Y, Ogura A, Shinohara T, Barrett JC, Oshimura M: Correction of a genetic defect in multipotent germline stem cells using a human artificial chromosome. Gene Ther. 2008, 15: 617-624. 10.1038/sj.gt.3303091.

Kouprina N, Larionov V: TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution. Nat Rev Genet. 2006, 7: 805-812. 10.1038/nrg1943.

Nihei N, Kouprina N, Larionov V, Oshima J, Martin GM, Ichikawa T, Barrett JC: Functional evidence for a metastasis suppressor gene for rat prostate cancer within a 60-kilobase region on human chromosome 8p21-p12. Cancer Res. 2002, 62: 367-370.

Kugoh HM, Hashiba H, Shimizu M, Oshimura M: Suggestive evidence for functionally distinct, tumor-suppressor genes on chromosomes 1 and 11 for a human fibrosarcoma cell line, HT1080. Onkogén. 1990, 5: 1637-1644.

Wong JM, Kusdra L, Collins K: Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage. Nat Cell Biol. 2002, 4: 731-736. 10.1038/ncb846.

Tomizuka K, Yoshida H, Uejima H, Kugoh H, Sato K, Ohguma A, Hayasaka M, Hanaoka K, Oshimura M, Ishida I: Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. Nat Genet. 1997, 16: 133-143. 10.1038/ng0697-133.


Köszönetnyilvánítás

Grant support: National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Postdoctoral Fellowships (228413, Y. Cao 228412, A.S. Nouwens), NHMRC Healthy Ageing Research Grant (219306, L.I. Huschtscha and R.R. Reddel), and a Wellcome Trust Senior Research Fellowship (GRO66727MA, T.M. Bryan).

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

We thank Kathleen Collins for the construct pBABE-puro-U3-hTR Karen MacKenzie and Laura Veas for the hTR2 and B2M primers Julie Jurczyluk for the construct pJJ101-hTERT1-182aa, in vitro transcribed hTR, and technical assistance Scott Cohen for the construct pUC-hTR and the direct telomerase activity assay and Jeremy Henson, Akira Nguyen, Ze Huai Zhong, Jane Noble, and Elizabeth Collins for technical assistance and advice.


Nézd meg a videót: mRNA Splicing (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Vomi

    Véleményem szerint hibát követel el. Meg tudom védeni a pozíciót. Írj nekem a PM -ben, beszélünk.

  2. Teetonka

    Elnézést kérek, de azt hiszem, tévedsz. Meg tudom védeni az álláspontomat. Írj nekem PM -ben.

  3. Amold

    Úgy gondolom, hogy tévedsz. Beszéljük meg. Küldjön e -mailt a miniszterelnöknél.



Írj egy üzenetet