Információ

Mi az a szabályozható promoter? És hogyan lehet szabályozni?

Mi az a szabályozható promoter? És hogyan lehet szabályozni?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Olvasok egy szabadalmat, ahol (S. cerevisae YNP5 törzsben):

leszabályozza az ERG9 gént úgy, hogy a natív ERG9 promotert a szabályozható MET3 promoterre cseréli

Mi az a szabályozható promóter, és hogyan lehet szabályozni? Kell valamit hozzáadni a húsleveshez, hogy csökkentse a kifejezést?

Nem látok semmi különöset a táptalajban.


A szabályozható promóter azt jelenti, hogy a gén expressziója ettől a promotertől 5'-irányban indukálható vagy elnyomható. A Met3 egy példa az ilyen szabályozható promóterekre, és metioninnak a tápközeghez való hozzáadása szabályozza. Az élesztőben a Met3 gén az ATP-szulfurilázt kódolja, amely egy enzim a metionin bioszintetikus folyamatában. Metionin hozzáadásakor a Met3 promoter által vezérelt gén elnyomódik, mivel annak expressziós szintje fordítottan korrelál a tápközeghez adott metionin koncentrációjával (ábra ebből a cikkből):


Mi az a szabályozható promoter? És hogyan lehet szabályozni? - Biológia

Baktériumokban és archaeákban a kapcsolódó funkciókkal rendelkező szerkezeti fehérjék – mint például az egyetlen biokémiai folyamat sok lépését katalizáló enzimeket kódoló gének – általában együtt kódolódnak a genomban egy blokkban, amelyet egy ún. operon és egy szingli vezérlése alatt íródnak össze promóter. Ez policisztronos átiratot képez (1. ábra). A promoter ezután egyidejűleg irányítja ezen strukturális gének transzkripciójának szabályozását, mert vagy mindegyikre szükség lesz egyszerre, vagy egyikre sem lesz szükség.

1. ábra Prokariótákban a rokon funkciójú szerkezeti gének gyakran együtt szerveződnek a genomon, és egyetlen promoter irányítása alatt íródnak át. Az operon szabályozó régiója magában foglalja mind a promotert, mind az operátort. Ha egy represszor kötődik az operátorhoz, akkor a szerkezeti gének nem íródnak át. Alternatív megoldásként az aktivátorok kötődhetnek a szabályozó régióhoz, fokozva a transzkripciót.

François francia tudósok Jákób (1920–2013) és Jacques Monod a Pasteur Intézetben elsőként mutatták be a bakteriális gének operonokba szerveződését a lac operon nak,-nek E. coli. Ebben találták meg E. coli, a laktóz energiaforrásként való felhasználásához szükséges enzimeket kódoló összes szerkezeti gén egymás mellett helyezkedik el a laktózban (ill. lac) operon egyetlen promóter irányítása alatt, a lac promóter. Ezért a munkájukért 1965-ben elnyerték az élettani és orvosi Nobel-díjat.

Bár az eukarióta gének nincsenek operonokba szervezve, a prokarióta operonok kiváló modellek a génszabályozás általános megismerésére. Az eukariótákban van néhány géncsoport, amelyek az operonokhoz hasonlóan működnek. Számos alapelv alkalmazható eukarióta rendszerekre, és hozzájárulnak ahhoz, hogy megértsük az eukarióták génexpressziójában bekövetkezett változásokat, amelyek kóros elváltozásokat, például rákot eredményezhetnek.

Minden operon tartalmaz olyan DNS-szekvenciákat, amelyek befolyásolják saját transzkripcióját, ezek a szabályozó régiónak nevezett régióban találhatók. A szabályozó régió magában foglalja a promotert és a promotert körülvevő régiót, amelyhez transzkripciós faktorok, szabályozó gének által kódolt fehérjék, kötődni tudnak. A transzkripciós faktorok befolyásolják a kötődést RNS polimeráz a promóterhez, és lehetővé teszi annak progresszióját, hogy átírja a strukturális géneket. A represszor egy transzkripciós faktor, amely elnyomja a gén transzkripcióját külső ingerre válaszul azáltal, hogy egy DNS-szekvenciához kötődik a szabályozó régióban, az úgynevezett operátor, amely a promoter RNS-polimeráz kötőhelye és az első szerkezeti gén transzkripciós starthelye között helyezkedik el. A represszorkötés fizikailag blokkolja az RNS-polimerázt a szerkezeti gének átírásában. Ezzel szemben an aktivátor egy transzkripciós faktor, amely egy külső ingerre adott válaszként növeli a gén transzkripcióját azáltal, hogy elősegíti az RNS polimeráz kötődését a promoterhez. An induktorA szabályozó molekulák egy harmadik típusa, egy kis molekula, amely vagy aktiválja vagy elnyomja a transzkripciót egy represszorral vagy aktivátorral való kölcsönhatás révén.

A prokariótákban vannak példák olyan operonokra, amelyek géntermékei meglehetősen következetesen szükségesek, és amelyek expressziója ezért szabályozatlan. Ilyen operonok konstitutívan kifejezve, ami azt jelenti, hogy folyamatosan átíródnak és lefordítják őket, hogy a sejtet állandó, közbenső fehérjetermék-szintekkel biztosítsák. Az ilyen gének olyan enzimeket kódolnak, amelyek részt vesznek a sejtek karbantartásához szükséges háztartási funkciókban, beleértve a DNS-replikációt, -javítást és -expressziót, valamint a magmetabolizmusban részt vevő enzimeket. Ezzel szemben vannak más prokarióta operonok, amelyek csak szükség esetén expresszálódnak, és represszorok, aktivátorok és induktorok szabályozzák őket.


13.1: A GAL1 promoter szabályozása

  • Közreműködött: Clare M. O&rsquoConnor
  • emeritus docens (biológia) a Boston College-ban

Az élesztőben a glikolízis fontos szerepet játszik az energiatermelésben, és a glükóz messzemenően a preferált szénforrás. Az egyéb szénforrások metabolizmusában részt vevő gének általában elnyomódnak, ha glükóz áll rendelkezésre. Ha azonban a glükóz nem áll rendelkezésre, az élesztő olyan géneket aktivál, amelyek más elérhető energiaforrásokat, például galaktózt metabolizálnak. A galaktóz fokozza a galaktózt a sejtekbe szállító enzimek számos génjének átírását, és végül glükóz-6-foszfáttá (G6P), a glikolízis közbenső termékévé alakítják át. A galaktóz által indukált útvonal első génje, GAL1, galaktokinázt kódol, amely a galaktózt galaktóz-1-foszfáttá foszforilezi. (Nézze meg a GAL1 útvonalak linkje SGD-ben.) Az GAL1 A promóter az ORF helytől 5'-irányban beépült mind a pBG1805, mind a pYES2.1 plazmidokba, és ezért szabályozza a plazmid által kódolt transzkripciót MET/Met és lacZ gének a transzformált sejtekben.

A szemközti oldalon található ábra egyszerű áttekintést nyújt a génexpressziórólGAL1 promóter glükóz, raffinóz és galaktóz jelenlétében. A promóter negatív és pozitív szabályozó helyeket is tartalmaz a DNS-szekvenciáján belül. Glükóz jelenlétében a represszor fehérjék a negatív szabályozó helyekhez kötődnek, és elnyomják a transzkripciót. A Gal4p transzkripciós aktivátor pozitív szabályozó helyekhez kötődik. A Gal4p egy transzkripciós faktor, amely dimerként kötődik a DNS-hez. (A fejezet elején látható ábra a DNS-sel komplexált Gal4p DNS-kötő és dimerizációs doménjeinek kristályszerkezetét mutatja.) Glükóz jelenlétében a Gal4p inaktív, mert a Gal80p represszor fehérjéhez kötődik.

A glükózrepresszió enyhíthető, ha rossz szénforrásban, például raffinózban növesztjük a sejteket. A raffinóz galaktózból, fruktózból és glükózból álló triszacharid. A raffinóz nem képes magas szintet indukálni GAL1 kifejezést, amihez galaktóz szükséges. Galaktóz jelenlétében kifejeződik a GAL1 gén növekszik

1000-szerese a glükóz jelenlétében megfigyelt szintnek. Ez a stimuláció elsősorban a Gal4p aktivitásának köszönhető, amely már nem kötődik a gátló Gal80p fehérjéhez. A Gal4p a galaktóz metabolizmus fő szabályozójaként működik. Az aktiválás mellett GAL1 transzkripció, a Gal4p is kötődik a promóterekhez GAL7 és GAL10 gének, amelyek a mellett találhatók GAL1 gén az élesztő kromoszómán 2. Mint GAL1, az GAL7 és GAL10 gének a galaktóz anyagcserében részt vevő fehérjéket kódolnak.

rendelete a GAL1promóter. Glükóz jelenlétében a transzkripció elnyomódik, mivel a represszor fehérjék a szabályozó helyekhez kötődnek
a DNS-ben és a Gal4p transzkripciós aktivátorban. A glükóz represszió enyhült raffinóz jelenlétében, de a Gal4p inaktív marad.
A Gal4p aktiválja a transzkripciót galaktóz jelenlétében a Gal80p fehérje eltávolítása miatt.


Kifejezés a T7 RNS polimeráz/promoter rendszer használatával

Ez az egység a gének expresszióját írja le úgy, hogy azokat a T7 bakteriofág RNS polimeráz szabályozása alá helyezi. A T7 RNS-polimeráz egy nagyon aktív enzim: az RNS-t az E. coli RNS-polimerázának többszörös sebességével szintetizálja, és ritkábban fejezi be a transzkripciót, transzkripciója képes megkerülni a plazmidot, így az RNS többszöröse a plazmid hosszának. . A T7 RNS-polimeráz szintén nagymértékben szelektív a saját promóter szekvenciájánál történő beindításra, és rezisztens az E. coli RNS-polimerázt gátló antibiotikumokkal, például rifampicinnel szemben. Következésképpen a rifampicin hozzáadása a T7 RNS polimerázt termelő sejtekhez a gének kizárólagos expresszióját eredményezi egy T7 RNS polimeráz promoter (p(T7)) szabályozása alatt. Az alapprotokoll szerint két plazmidot tartanak fenn ugyanazon E. coli sejten belül. Az egyik (az expressziós vektor) p(T7)-et tartalmaz az expresszálandó gén előtt. A második a T7 RNS polimeráz gént tartalmazza egy hővel indukálható E. coli promoter irányítása alatt. Hőindukció hatására a T7 RNS polimeráz termelődik, és elindítja a transzkripciót az expressziós vektoron, ami a p(T7) szabályozása alatt álló gén(ek) expresszióját eredményezi. Kívánt esetben a géntermékek egyedileg jelölhetők az eljárás minimális tápközegben történő végrehajtásával, rifampicin hozzáadásával az E. coli RNS polimeráz gátlására, majd a fehérjék [35S]-metioninnal történő jelölésével.


Hivatkozások

Gray WM: A növények növekedésének és fejlődésének hormonális szabályozása. PLoS Biol. 2004, 2: E311-10.1371/journal.pbio.0020311.

Lumba S, Tsuchiro T, Delmas F, Hezky J, Provart N, Lu QSM, McCourt P, Gazzarrini S: Az embrionális levélidentitás gén FUSCA3 szabályozza a vegetatív fázisátmeneteket azáltal, hogy negatívan modulálja az etilén által szabályozott génexpressziót Arabidopsisban. BMC Biol. 2012, 10: 8-10.1186/1741-7007-10-8.

Gazzarrini S, Tsuchiya Y, Lumba S, Okamoto M, McCourt P: A FUSCA3 transzkripciós faktor a gibberellin és az abszcizinsav hormonokon keresztül szabályozza az Arabidopsis fejlődési időzítését. Dev Cell. 7, 373-385 (2004). 10.1016/j.devcel.2004.06.017.

Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME: Etilén a növénybiológiában. 1992, San Diego: Academic Press, 2

Chen YF, Etheridge N, Schaller GE: Etilén jelátvitel. Ann Bot (London). 2005, 95: 901-915. 10.1093/aob/mci100.

Zhu Z, An F, Feng Y, Li P, Xue L, AM, Jiang Z, Kim JM, To TK, Li W, Zhang X, Yu Q, Dong Z, Chen WQ, Seki M, Zhou JM, Guo H: Az etilénnel stabilizált transzkripciós faktorok (EIN3/EIL1) derepressziója jázmonát és etilén jelátviteli szinergiát közvetít az Arabidopsis-ban. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108: 12539-12544. 10.1073/pnas.1103959108.

Lingam S, Mohrbacher J, Brumbarova T, Potuschak T, Fink-Straube C, Blondet E, Genschik P, Bauer P: Interaction between the bHLH transzkripciós faktor FIT and ETHYLENE INSENSITIVE3/ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 felfedi az iron kapcsolat szabályozását és etilén jelátvitel az Arabidopsisban. Növényi sejt. 2011, 23: 1815-1829. 10.1105/tpc.111.084715.

Zhong S, Zhao M, Shi T, Shi H, An F, Zhao Q, Guo H: Az EIN3/EIL1 együttműködik a PIF1-gyel, hogy megakadályozza a fotooxidációt és elősegítse az Arabidopsis palánták zöldítését. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 21431-21436. 10.1073/pnas.0907670106.

Chen MK, Hsu WH, Lee PF, Thiruvengadam M, Chen HI, Yang CH: A MADS box gén, a FOREVER YOUNG FLOWER represszorként működik, és szabályozza a virágszerv öregedését és abszcisszióját az Arabidopsisban. Plant J. 2011, 68: 168-185. 10.1111/j.1365-313X.2011.04677.x.

Chuck G, Hake S: A fejlődési átmenetek szabályozása. Curr Opin Plant Biol. 2005, 8: 67-70. 10.1016/j.pbi.2004.11.002.


Mi az a Promoter

A promóter a gén egyik fő szabályozó eleme, amely elindítja a transzkripciót. A gén közelében, a kodonszekvenciától felfelé található. A promóter mérete 100-1000 bp lehet. A válaszelemeknek nevezett specifikus DNS-szekvenciák kezdeti kötőhelyeket biztosítanak mind az RNS-polimeráznak, mind az RNS-polimerázt toborzó transzkripciós faktoroknak. Az RNS-polimeráz a transzkripcióért felelős enzim, amely komplementer RNS-nukleotidokat polimerizál, hogy mRNS-molekulát szintetizáljon.

2. ábra: Promóter

A szigma faktorhoz kapcsolódó bakteriális RNS polimeráz kötődhet a promoterhez. A szigma faktor egy bakteriális transzkripciós iniciációs faktor. Az eukariótákban körülbelül 7 különböző alap transzkripciós faktort kell a promoterhez kötni az RNS polimeráz toborzásához.


A promóter szekvencia és erőssége közötti kapcsolat a génexpresszióban

A promóter ereje vagy aktivitása fontos a géntechnológiában és a szintetikus biológiában. Egy adott RNS-hez bizonyos erősségű konstitutív promóter gyakran újra felhasználható más RNS-ekhez. Ezért az egyik promoter erősségét főként a nukleotidszekvenciája határozza meg. A géntechnológia és a szintetikus biológia egyik fő nehézsége az, hogy hogyan lehet egy adott fehérje expresszióját egy adott szinten szabályozni. Ennek a célnak az egyik általában használt módja az, hogy kiválasztunk egy megfelelő erősségű promotert, amely felhasználható a transzkripció sebességének szabályozására, amely azután a fehérje expressziójának kívánt szintjéhez vezet. Ebből a célból eddig számos promóter könyvtárat hoztak létre kísérletileg. Mindazonáltal kívánatosak olyan elméleti módszerek, amelyek segítségével megjósolható az egyik promoter erőssége annak nukleotidszekvenciájából. Az ilyen módszerek nemcsak a meghatározott erősségű promoter tervezésében értékesek, hanem a géntranszkripcióban a promoter mechanizmusának megértéséhez is. Ebben a tanulmányban különféle teszteken keresztül egy elméleti modellt mutatunk be a promoter erőssége és a nukleotidszekvencia közötti kapcsolat leírására. Elemzésünk azt mutatja, hogy a promoter erősségét nagyban befolyásolják azok a nukleotidcsoportok, amelyek szekvenciájában három szomszédos nukleotid található. Mindeközben a promoterszekvencia különböző régióiban lévő nukleotidok eltérő hatást gyakorolnak a promoter erejére. A kísérleti adatok alapján E. coli Számításaink azt mutatják, hogy a promóter szekvencia -10 régiójában, -35 régiójában és diszkriminátor régiójában lévő nukleotidok fontosabbak a promoter erősségének meghatározásában, mint a távolsági régióban lévő nukleotidok. A kísérleti adatokhoz illesztéssel kapott modellparaméter-értékekkel elméletileg négy promoter könyvtárat építenek fel a megfelelő kísérleti környezetekhez, amelyekben korábban mérték a génexpresszióban a promoter erejét.

Grafikai absztrakt

Ez az előfizetéses tartalom előnézete, hozzáférés az intézményen keresztül.


Eredmények

Feltételes kimerülése Lhx8 által Gdf9Cre masszív primordiális tüszőaktivációt okoz

Korábban már beszámoltunk a globális kiütésről Lhx8 meddőséget és petesejtek elvesztését okozza a szülés utáni 7. napon (PD7) [14]. A globális kiütésben Lhx8, ősszerű tüszők képződnek (20 μm-nél kisebb átmérőjű petesejtek, amelyeket lapos granulosa sejt vesz körül), de a petesejtek nem nőnek. Mivel Lhx8 Mind az embrionális, mind a születés utáni női csírasejtekben expresszálódik, lehetséges, hogy a globális kiütés Lhx8 megzavarja a korai embrionális utakat, amelyek a szülés utáni petesejtek kimerüléséhez vezetnek. Ezért megvizsgáltuk a szülés utáni funkcióit Lhx8 feltételes knockout egér generálásával, floxed segítségével Lhx8 allél (Lhx8 flx/flx ) [15] és a Gdf9Cre transzgenikus egér [16]. Az Gdf9Cre transzgén inaktiválódik Lhx8 kifejezetten az őspetesejtekben. Gdf9Cre nagyon hatékony a petesejtekben, és ha bármelyikben jelen van Lhx8 flx/flx vagy Lhx8 flx/- állatok, ugyanazt a petefészek fenotípust mutatták. Használtuk Lhx8 flx/flx Gdf9Cre hatásainak tanulmányozására Lhx8 a primordiális tüszők feltételes hiánya a petefészek fejlődésére.

A PD7 és PD14 esetében az LHX8 fehérje kimerült Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészkek és masszív petesejtek aktiválódása következett be az őstüszőkben, ami a 20 μm-nél nagyobb átmérőjű petesejtekben nyilvánult meg anélkül, hogy a környező lapos granulosa sejtek jelentős mértékben átalakultak volna (1a–f ábra). A PD7-nél Lhx8 flx/flx Gdf9Cre az egerekben petefészkenként 398 ± 53 aktivált őstüsző volt, míg petefészekenként 16 ± 2 Lhx8 flx/flx vezérlők. A primordiális tüszők száma petefészkenként 1917 ± 23 volt Lhx8 flx/flx kontrolloknál, és szignifikánsan csökkent 1043 ± 119-re petefészekenként Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerek (1c. ábra). Az elsődleges tüszők számának csökkenését észleltük Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerekben, ami blokkolja az aktivált őstüszőkről az elsődleges tüszőkre való átmenetet. A PD7-ben elhanyagolható számú fejlett tüszőtípus (több réteg granulosa sejttel körülvett petesejtek) volt jelen Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészek, összehasonlítva a Lhx8 flx/flx vezérlők.

Szülés utáni inaktiválása Lhx8 a primordiális tüszők idő előtti aktiválódását és a petefészek elégtelenségét okozza. a és b Anti-LHX8 antitesteket használtunk a petesejtek kimutatására paraformaldehiddel fixált és hematoxilinnel ellenfestett petefészkekben, amelyeket a születés utáni 7. napon vettünk (PD7). A petefészkek kontrollból származnak (Lhx8 flx/flx , A) és Lhx8 feltételes kiütés (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, B) egerek. Nyílhegyek ban,-ben betét Az A panelen az őstüszőket jelölik, amelyek anti-LHX8 antitestekkel festődnek (barna jel). Nyílhegyek ban,-ben betét a B panelen aktivált primordiális tüszők (20 μm-nél nagyobb petesejtek cuboidális granulosa sejtek nélkül) láthatók. d, e, g és h A kontrollból (D és G) származó PD14 (D és E) és PD21 (G és H) petefészkek periodikus sav-Schiff (PAS) festése, ill. Lhx8 feltételes knockout (E és H) egerek. Nyílhegyek ban,-ben betét A D és E panelek primordiálisan aktivált primordiális tüszőket jeleznek. c, f és én A petefészek tüszőtípusainak számszerűsítése in Lhx8 flx/flx és Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerek. Öt pár PD7 (C), PD14 (F) és PD21 (I) petefészket paraffinba ágyaztunk, és 5 μm vastagságban sorozatosan metszettek, és megszámoltuk a tüszőket. Az anti-NOBOX antitestek a petesejtek sejtmagjait festik meg a follikulogenezis során, és a petesejtek azonosítására használták őket. Minden ötödik szakaszt megszámoltak. Pontoztuk a primordiális tüszőket (PF), az aktivált primordiális tüszőket (PF-törvény, a petesejtek átmérője 20 μm-nél nagyobb cuboidális granulosa sejtek nélkül), az elsődleges tüszőket (PrF) és a másodlagos/antrális tüszőket (SF/AF). *P < 0,05, **P < 0,01. Skálasávok: 100 μm (A, B, D, E, G és H) 20 μm (betét A, B, D és E)

PD14-nél, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre a petefészkekben petefészkenként 847 ± 82 aktivált őstüsző volt, míg petefészekben ez az arány 15 ± 7 volt. Lhx8 flx/flx vezérlők. A primordiális tüszők száma jelentősen csökkent 1753 ± 204 hüvelykről Lhx8 flx/flx 353 ± 58 hüvelykre vezérli Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészkek (1f. ábra). A PD21-re a tüszők összszáma a primordiálistól a másodlagosig jelentősen csökkent a Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészek (1g–i. ábra). A PD35-re már alig észleltek petesejteket és tüszőket Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészek (lásd 1. további fájl: S1C ábra) és Lhx8 flx/flx Gdf9Cre a nőstények sterilek voltak (lásd 2. kiegészítő fájl: S2A ábra). Vizsgálataink azt mutatják, hogy a szülés utáni inaktiváció a Lhx8 Az őstüszők petesejtjein belül masszív petesejtek aktiválódásához, a petesejtek aktivációjának a szomatikus sejttranszformációtól való leválasztásához, a petesejtek halálához és meddőséghez vezet.

Az LHX8 kölcsönhatásba lép a PI3K-AKT útvonallal

Megvizsgáltuk a PD7-ben a PI3K-AKT-mTOR útvonalak fontos tagjait kódoló gének RNS expresszióját. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek. A valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) nem mutatott ki szignifikáns változást az expressziójában Pten, Akt, Foxo3, Pdk1, Mtor, Rps6, Deptor, Rictor, vagy Tsc1/2 (ezek egy része a 2. ábrán látható). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az LHX8 nem befolyásolja közvetlenül a PI3K-AKT-mTOR útvonalon fehérjéket kódoló gének egy részhalmazának transzkripcióját. Ezután felmértük, hogy a PI3K-AKT útvonal aktiválódott-e a fehérje szintjén Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek. Az AKT egy szerin/treonin-specifikus protein kináz, amely kulcsszerepet játszik az apoptózisban és a PFA-ban. A foszforilált AKT több downstream útvonalat aktivál, beleértve a FOXO3 foszforilációt, ami petesejtek aktiválódását eredményezi [8]. A PD7 petefészkekből származó petesejtek Western blot elemzése azt mutatta, hogy az AKT foszforilációja két helyen, az S473-ban és a T308-ban magasabb volt Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek, mint a kontrollokban (2h. ábra). Érdekes módon azonban csak a p-AKT-t (T308) észlelték az aktivált őstüszőkben (lásd 3. kiegészítő fájl: S3 ábra).

Az AKT aktiválva van Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek. ag Petesejteket izoláltak a PD7 kontrollból (Lhx8 flx/flx , Ctrl) és Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) egér petefészkeket és RNS-t extraháltunk a cDNS konverzióhoz és a valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakcióhoz (RT-qPCR). Az adatok normalizálásra kerültek Gapdh kifejezést és átlagos relatív mennyiségként adják meg (összehasonlítva a kontrollal), a hibasávok pedig az átlag standard hibáját jelentik. Diáké t-tesztet használtunk a számításhoz P értékeket. Az egyetlen szignifikáns különbség a kifejezésben volt megfigyelhető Lhx8, ahogy az várható volt. ** P < 0,01. h Petesejteket izoláltunk a PD7 kontrollból és Lhx8 flx/flx Gdf9Cre A petefészkek fehérjét extraháltuk, és Western blot tesztet végeztünk három független mintán, az AKT és két foszforilált formája (S473 és T308) elleni antitestek felhasználásával. Kontrollként hiszton H3 immunreaktivitást használtunk

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációja és az rpS6 foszforilációja a PI3K-AKT-mTOR útvonalon keresztül kapcsolódik a PFA-hoz [5, 6, 8]. Megvizsgáltuk a FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációját és az rpS6 foszforilációját PD7-ben Pten és Lhx8 feltételes kiütések (3. ábra és 4. kiegészítő fájl: S4. ábra). A FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációja kiemelkedő volt a 30 μm-nél nagyobb petesejtekben, de nem mutatott nyilvánvaló transzlokációt a 20 és 30 μm közötti petesejtek között Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerek (3d-f, f', p ábra). Az őstüszők petesejtek in Pten és Lhx8 feltételes egyszeri kiütések, valamint a megfelelő kontrollok nem mutattak FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációt. A FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokáció azonban szignifikánsan indukálódott a PD7 kettős primordiális (<20 μm) oocitáiban (3j–l, l', p ábra). Lhx8/Pten feltételes kiütések (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre). Ezek az adatok az LHX8 és PTEN fehérjék szinergikus hatását jelzik a FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációjára.

Lhx8 és Pten feltételes kiütési hatások a FOXO3 lokalizációjára. ac Kontroll egerekben (Lhx8 flx/flx ), a FOXO3 a primordiális petesejtek sejtmagjában és citoplazmájában (PF, nyilak ban ben c'). df Ban ben Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerekben a kiterjedt nukleocitoplazmatikus transzlokáció nem figyelhető meg a 20 és 30 μm közötti aktivált primordiális tüszőkben (aPF, nyíl ban ben f'), de megfigyelhető a 30 μm-nél nagyobb aktivált primordiális tüszőkben (aPF, nyíl F'-ben). dén A FOXO3 lokalizációjának hasonló expressziós mintája létezik Pten feltételes kiütés (Pten flx/flx Gdf9Cre) egerek. Az nyilak ban ben én' primordiális tüszőket (PF), amelyek mind a nukleáris, mind a citoplazma FOXO3 expresszióját és a FOXO3 citoplazma expresszióját jelentik az aktivált primordiális tüszőkben (aPF) 30 μm alatt. jl Azonban az egerekben, amelyek feltételesen hiányosak mindkettőből Lhx8 és Pten (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre), a FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációja jelen van a primordiális, aktivált és primer petesejtekben. A negatív kontroll az immunfluoreszcencia másodlagos antitestek jelenlétében, és az alábbi ábrán látható mo. Az dobozos területek C-ben F, I, L és O C', F', I', L' és O' nagyítva látható. p A FOXO3 eloszlásának grafikus ábrázolása (csak a citoplazma vagy a sejtmag és a citoplazma). A petesejteket méret (átmérő) szerint csoportosították: kisebbek, mint 20 μm, 20 és 30 μm között, és nagyobbak, mint 30 μm. Csak azokat a petesejteket számoltuk meg, amelyek tisztán DAPI nukleáris festődéssel rendelkeznek. Skálasávok: 50 μm (A–C, D–F, G–I, J–L és M–O) 20 μm (C', F', I', L' és O')

Megvizsgáltuk a double hatásait is Pten és Lhx8 hiányosság az rpS6-on. Az mTORC1 elősegíti a fehérje transzlációját és a sejtnövekedést, részben az S6K1 aktiválása révén (treonin 389 foszforilációjával), valamint az eIF4E-kötő fehérjék foszforilációjával és inaktiválásával. Az S6K1 felelős az rpS6 foszforilációjáért és aktiválásáért, ami fokozott fehérjetranszlációhoz és riboszóma biogenezishez vezet. Hatalmon, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, és Pten flx/flx Gdf9Cre petefészkekben, az rpS6 csak a növekvő tüszőkben aktiválódott szignifikánsan PD7-nél (lásd 4. további fájl: S4 ábra). Azonban a PD7 Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre petefészkekben az rpS6 szignifikáns aktiválódását mutatták ki a primordiális (<20 μm) oocitákban (lásd 4. további fájl: S4D, D' ábra). Ezek az eredmények azt is jelzik, hogy a Lhx8 és Pten Az útvonalak szinergikusan kölcsönhatásba lépnek, hogy felgyorsítsák a PFA-FOXO3 nukleocitoplazmatikus transzlokációjával és az rpS6 foszforilációjával kapcsolatos két eseményt.

Lin28a Az RNS és a fehérje expressziója az Lhx8flx/flxGdf9Cre petesejtekben felfelé szabályozott

Az LHX8 egy transzkripciós faktor, és arra számítunk, hogy fő hatása az RNS szintjén lesz. Ezért elemeztük a transzkriptumát Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészkek nagy áteresztőképességű RNS szekvenálás (RNS-seq) segítségével. Minden mintában 180 millió címkét szekvenáltunk, és összehasonlítottuk a PD7-ből származó PI3K-AKT-mTOR útvonalakban lévő gének által kódolt RNS-címkék relatív mennyiségét. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre és kontrollálja a petefészket. Nincsenek szignifikáns különbségek a PI3K-AKT-mTOR útvonal gének RNS expressziójában (Pik3r1, Pik3ca, Készlet, Kitl, Gsk3b, Cdnd1, Wee1, Cdkn1a/b, Rheb, Mlst8, Mapkap1, Prr5, és Eif4ebp1) nyilvánvalóak voltak az RNS-seq kísérletben (lásd 5. további fájl: S1 táblázat).

Az ismert PI3K-AKT-mTOR gének expressziójának elemzése mellett a transzkriptom globális különbségeit is tanulmányoztuk. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre és kontrollálja a petefészket. Hatszoros növekedést észleltünk Lin28a RNS átiratok be Lhx8 flx/flx Gdf9Cre a kontroll petefészkekhez képest (4b. ábra és 5. kiegészítő fájl: S1 táblázat). Az anti-LIN28A antitestekkel végzett immunfluoreszcencia és Western blot analízis azt mutatta, hogy a LIN28A fehérje szignifikánsan magasabb szinten expresszálódik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek a kontrollokhoz képest (4a, c ábra).

Lhx8 elnyomja Lin28a kifejezés. a Az anti-LIN28A antitestekkel végzett immunfluoreszcencia azt mutatja, hogy a LIN28A elsősorban a petefészekben expresszálódik. A LIN28A bősége magasabb Lhx8 feltételesen hiányos petesejtek (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre) a kontrollokhoz képest (Lhx8 flx/flx ). b és c Lin28a A transzkriptumok és a fehérje szignifikánsan erősebben expresszálódik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petesejtek (G9cKO), ellentétben a kontrollokkal (Ctrl). af Kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálatok anti-LHX8 affinitás tisztított antitestekkel petesejteken. d Egy feltételezett LHX8 DNS-kötőhelyet, a TGATTG-t [22], amely tökéletesen illeszkedik az LHX8 kötő konszenzus szekvenciához, azonosítottak a -536-tól -531. Lin28a transzkripció iniciációs hely. e Az anti-LHX8 antitestek kicsapják a TGATTG kötőszekvenciát tartalmazó genomiális DNS-t a Lin28a a ChIP-kvantitatív PCR (qPCR) szerint. Az immunglobulin G (IgG) antitestek kontrollként szolgáltak. A százalékos beviteli módszert használják a qPCR adatok elemzésére. Az „input” a kromatin pelletekből származó PCR termék immunprecipitáció előtt. Háromszoros átlag Ct korrigált bemenetre normalizálva használtuk a százalékos bemenet kiszámításához. Két primer-készletet (F1 és R1) és (F2 és R2) használtunk a ChIP-qPCR végrehajtásához. f Az oocita bemeneti DNS, valamint a normál tengerimalac IgG és anti-LHX8 antitestek által az F1/R1 és F2/R2 primer készletek által kicsapott DNS PCR amplifikációja. Skálalécek: 50 μm (A)

A LIN28A egy RNS-kötő fehérje, amely blokkolja a biogenezist hagyja-7 mikroRNS-ek és az emlősök testméretének és anyagcseréjének ismert szabályozója, beleértve a menarche kezdetét [17, 18]. Lin28a elsősorban petesejtekben és embrió őssejtekben expresszálódik [19, 20]. Ezenkívül a PI3K-AKT-mTOR útvonalakat a LIN28A aktiválhatja [21]. A LIN28A tehát szerepet játszhat a petesejtek aktiválásában és növekedésében.

Az LHX8 közvetlenül kötődhet az LHX8 DNS-kötő motívumhoz Lin28a promóter

Kipróbáltuk, hogy az LHX8 tud-e kötődni a Lin28a promóter. Az LHX8 egy petesejt-specifikus LIM homeodomain transzkripciós szabályozó, amely várhatóan megköti a DNS-t. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az LHX8 homeodomain elsősorban egy TGATTG DNS-motívumhoz kötődik [22]. Egyetlen -531-536 bp TGATTG DNS-motívumot azonosítottunk a feltételezett transzkripciós iniciációs helytől felfelé. Lin28a gén (4d. ábra). Az Lin28a A TGATTG motívum megőrződött más emlősökben, beleértve az embert is. Kromatin immunprecipitációs (ChIP) kísérletet hajtottunk végre vad típusú petesejteken, magas specifikus és affinitástisztított anti-LHX8 antitesteink felhasználásával [13]. Az anti-LHX8 antitestek előnyösen immunprecipitálták a Lin28a A TGATTG motívumot tartalmazó promoter DNS-fragmens (4e., f. ábra). Ezek az adatok továbbá arra utalnak, hogy az LHX8 elnyomja Lin28a kifejezés közvetlenül kötődik a Lin28a promóter.

Lin28a hiánya részben megmenti a Lhx8 flx/flx Gdf9Cre fenotípus

Adataink azt mutatják, hogy az LHX8 elnyomja Lin28a kifejezés. Mivel a LIN28A egy növekedést elősegítő faktor [17, 23], amely elsősorban petesejtekben expresszálódik, feltételeztük, hogy Lin28a a hiány megmenti Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-indukált PFA. Mi tenyésztettük Lin28a és Lhx8 pelyhesített egerek Gdf9Cre generálni Lhx8/Lin28a dupla feltételes kiütés (Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre).

Petefészek morfometriai elemzéseket végeztünk, hogy meghatározzuk a kettős kiütés PFA-ra gyakorolt ​​​​hatását. között nem volt megfigyelhető morfometriai különbség Lin28a flx/flx Gdf9Cre és kontroll nőstényeket PD7-nél (5a, c, e ábra). Ahogy az várható volt, szignifikánsan kevesebb aktivált primordiális tüszőt figyeltünk meg Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre összehasonlítva Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészkekben, de nem voltak teljesen normálisak a kontrollhoz képest (5a, b, d, f ábra).

Lin28a hiány menti meg Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-indukált PFA. ad A kontroll reprezentatív szövettana (Lhx8 flx/flx ), Lhx8 feltételes kiütés (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre), Lin28a feltételes kiütés (Lin28 flx/flx Gdf9Cre), és duplája Lhx8/Lin28a feltételes kiütés (Lhx8 flx/flx Lin28 flx/flx Gdf9Cre) petefészkek. Kettős Lhx8/Lin28a a feltételes kiütések az aktivált őstüszők számának csökkenését mutatják. Anti-Nobox antitesteket használtunk a petesejtek (sötétbarna) magjainak jelölésére. PF: primordiális tüsző aPF: aktivált őstüsző. e Az Lin28 flx/flx Gdf9Cre A (Lin28G9cKO) egerek fenotípusa hasonló a kontroll (Ctrl) egerekhez, és az őstüszők számát az összes tüsző százalékában fejezzük ki. f Az aktivált primordiális tüszők mennyiségi meghatározása a kontrollban, Lhx8 feltételes, és kettős Lhx8/Lin28a feltételes kiütések. Megjelenik a primordiális tüszők (PF) és az aktivált őstüszők (aPF) százalékos aránya. Három pár petefészek a Lhx8 feltételes kiütés és dupla Lhx8/Lin28a feltételes knockout egereket sorozatosan metszettek, és minden ötödik metszetet megszámoltunk. g Az AKT foszforilációja kétszeresére csökken Lhx8/Lin28a feltételes kiütések. Fluoreszcens p-AKT (T308) expresszióval határoztuk meg a primordiális és az aktivált primordiális tüszőkben. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) és Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre (G9dKO) petefészkek PD7-nél. Az AKT foszforilációja jelentősen csökkent Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre primordiális és aktivált őstüszők képest Lhx8 flx/flx Gdf9Cre. Diáké t-tesztet használtunk a számításhoz P értékeket. *P < 0,05, **P < 0,01. Skálalécek: 50 μm (A–D)

A részleges megmentése Lhx8 flx/flx Gdf9Cre- által kiváltott PFA Lin28a a hiány azzal érvel Lin28a a petesejtek növekedésének szabályozója. Az aktivált őstüszők számának csökkenése Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre petefészek arra utal, hogy az AKT útvonal aktivációja is csökken. Megvizsgáltuk a p-AKT (T308) jelet a primordiális és az aktivált primordiális tüszőkben. Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre és Lhx8 flx/flx Gdf9Cre petefészkekben (5g. ábra), és azt találta, hogy expressziója jelentősen csökkent a Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre petefészek a petefészkekhez képest Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerek.

Lhx8 szabályozza az elsődleges tüszők másodlagos átmenetét

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a PTEN által szabályozott útvonalak fontosak a primordiális petesejtek aktiválásában, de nem az elsődleges oocitákban [24]. Szerepét tanulmányoztuk Lhx8 primer petesejtekben generálásával Lhx8 flx/flx Zp3Cre egerek. Zp3Cre specifikusan az elsődleges oocitákban expresszálódik, és Lhx8 flx/flx Zp3Cre a petefészkek továbbra is expresszálják az LHX8-at primordiális, de nem elsődleges petesejtekben. A morfometriai elemzések kimutatták, hogy a Lhx8 flx/flx Zp3Cre feltételes knockout petefészek nem különbözött szignifikánsan Lhx8 flx/flx (kontroll) egerek PD0-nál és PD7-nél (6a–f. ábra). A PD14-nél azonban petefészekben 159 ± 23 primer tüszőt és 29 ± 7 másodlagos/antrális tüszőt számoltunk. Lhx8 flx/flx Zp3Cre egerek esetében, míg a kontroll egerekben petefészekenként 79 ± 6 primer tüsző és 108 ± 7 másodlagos/antrális tüsző (6g–i. ábra). A primer tüszők relatív növekedése PD14-nél és a többrétegű tüszők relatív csökkenése a Lhx8 flx/flx Zp3Cre petefészek azt jelezte, hogy az elsődleges tüszőkről a másodlagos tüszőkre való átmenet blokkolva volt, ami összhangban van a Lhx8 flx/flx Gdf9Cre egerek (1f. ábra). A PD21-nél és a PD30-nál azt figyeltük meg, hogy sok primer tüszőben nem voltak petesejtek (6k, n ábra). Megfestettük a LIN28A-t a PD21 petefészekben, és azt találtuk, hogy a LIN28A erősen expresszálódik Lhx8 hiányos petesejtek a Lhx8 flx/flx Zp3Cre petefészek, de az üres tüszőkben nem észleltünk expressziót (lásd 6. kiegészítő fájl: S5 ábra). Ezeket az üres primer tüszőket figyelmen kívül hagyva azonban az elsődleges tüszők száma a kontroll és a Lhx8 flx/flx Zp3Cre A petefészek nem különbözött szignifikánsan a PD21 vagy PD30 esetén (6l. ábra, o). A másodlagos/antrális tüszők esetében a szám meredeken csökkent 17 ± 3-ra PD21-nél és 2 ± 1-re PD30-nál Lhx8 flx/flx Zp3Cre 170 ± 2, illetve 104 ± 4 a kontroll egerekben. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a növekvő tüszőkészlet továbbra is kiürült a Lhx8 flx/flx Zp3Cre egerek. Lhx8 flx/flx Zp3Cre az egerek terméketlenek voltak (lásd 2. további fájl: S2A ábra), és a szuperovulációs kezelést Lhx8 flx/flx Zp3Cre az egerek nem termeltek petesejteket (lásd 2. további fájl: S2B ábra). Ez az eredmény összhangban volt a másodlagos/antrális tüszők éles esésével a Lhx8 flx/flx Zp3Cre petefészek a PD21-nél. Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy a folliculogenesis a Lhx8 flx/flx Zp3Cre Az egerek blokkolják az elsődleges tüszőstádiumból a másodlagos állapotba való átmenet során, és az elsődleges petesejtek pusztulását és terméketlenséget okozzák. The relative stability of the primordial follicle pool from PD14 to PD30 suggests that the PFA into primary follicles was not affected by the diminution in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries.

Lhx8 inactivation in primary follicles (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) abolishes follicle growth. Histomorphological analysis was done on control (Lhx8 flx/flx ) és Lhx8 deficient ovaries (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) at various stages of postnatal ovarian development ranging from newborn (PD0) to postnatal day 30 (PD30). af Periodic acid–Schiff (PAS) staining and counting of different follicle types in the newborn and PD7 ovaries showed no significant differences between control and Lhx8 deficient ovaries. go Anti-NOBOX antibodies were used to stain oocytes (brown immunoreactivity) in ovaries from PD14 (G and H), PD21 (J and K), and PD30 (M and N) mice. At PD14, the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries showed a significantly higher number of primary follicles (PrF) and significantly diminished number of secondary/preantral (SF/AF) follicles characterized by two or more layers of granulosa cells. At PD21 and PD30, the primary follicle pool did not differ significantly between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries however, there was a marked decrease in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in conditional knockouts including degenerating follicles without oocytes (marked by asterisks ban ben insets in K and N). The primordial follicle (PF) pool remained relatively stable between PD14 and PD30, with no significant difference between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries. **P < 0,01. Scale bars: 100 μm (A, B, D, and E) 200 μm (G, H, J, K, M, and N) 50 μm (insets of K and N)


Tetracycline-inducible Empty Backbones

Find a construct that will allow you to insert and induce your gene of interest.

ID Plazmid Leírás Co-expressed tTA, rtTA, or TetR On or Off PI
21916 Tet-pLKO-neo 3rd generation lentiviral plasmid for inducible expression of shRNA neomycin selection plasmid 21915 has puromycin selection TetR Tovább Wiederschain
41393 pCW57.1 Lentiviral vector for inducible expression for Gateway cloning selection cassette in format: PGK-rtTA-2A-puro see article for tagged insert options rtTA Tovább Gyökér
11651 pLVUT-tTR-KRAB Lentiviral vector for inducible expression of transgene or shRNA see article for detailed information about cloning and additional plasmids tetR-KRAB Tovább Aebischer & Trono
16542 pBI-MCS-EGFP Expression of your gene of interest (MCS with a &beta-globin poly A) & EGFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Egyik sem Tovább Vogelstein
25735 pSLIK-Neo Lentiviral vector for inducible expression of a miR-shRNA selection cassette in format: rtTA3+IRES+Neo see article for additional selection options third-generation rtTA Tovább Fraser
44012 pInducer20 Lentiviral vector for shRNA expression see article for additional tookit plasmids third-generation rtTA Tovább Elledge
19407 pTREtight2 Promoter contains a modified TRE that is silent in absence of binding tTA or rTA has high copy E. coli origin Egyik sem Bármelyik Ralser
64238 pTet-IRES-EGFP Lentiviral plasmid for inducible expression of transgene of interest and EGFP Egyik sem Bármelyik Lung
11662 pPRIME-TET-GFP-FF3 Lentiviral, miRNA expression (PRIME) system for application in knockdown of gene expression at a single copy in mammalian cells Expresses firefly luciferase hairpin and GFP under pTREtight promoter Egyik sem Bármelyik Elledge
35625 pAAV-Ptet-RFP-shR-rtTA AAV shRNA cloning vector for evaluation of shRNA efficacy using fluorescence use with pGFPns-reporter for cDNA target rtTA Tovább Gu
60495 pSBtet-GP Sleeping Beauty transposon system has luciferase in cloning site see article for additional selection and FP option rtTA Tovább Kowarz
16623 pBI-GFP Expression of your gene of interest & GFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Egyik sem Bármelyik Vogelstein
100521 pCW57.1-MAT2A Lentiviral Tet-Off all in one plasmid derived from pCW57.1. rtTA was replaced with tTA, and Puromycin was replaced with Blasticidin selection. Please NOTE, this vector contains an insert (MAT2A) which would need to be replaced by the gene of interest. tTA Ki Sabatini
92099 AAVS1_Puro_Tet3G_3xFLAG_Twin_Strep Bidirectional promoter controls expression of gene of interest with Strep-Tag and Tet-On 3G transactivator, creating an auto-regulated Tet-On 3G System. Contains homology arms for integration into AAVS1 Genomic Safe Harbor Locus. Tet-On 3G Tovább Doyon
58245 pGLTR-X-GFP Single vector lentiviral Gateway RNAi system for conditional cell line generation contains expression cassette for TetR-P2A-GFP see article for additional constructs TetR Tovább Geley


4. példa

In experiments using S. aureus cells grown in culture, intracellularly expressed ssJT01ss bound to and inhibited a specific essential cellular target in a manner similar to that of an antimicrobial drug. Hence induction of expression of this peptide during an infection should have the effect of an antibiotic. An established animal infection model was used to test this concept (Onyegji, C. O. et al., Antimikrobiális szerek és kemoterápia 38:112-117, 1994).

Six groups of CD-1 female mice (5 mice per group, Charles River Laboratories, Wilmington, Ma.) weighing 20-24 grams were used in this experiment. The inoculum was prepared from CYL316tt/pC 3 883 (encoding a ssJT01ss peptide-GST fusion protein under the control of the tet operon) which was cultured at 37° C. for 17 hours in TS broth containing erythromycin and kanamycin. 1.6×10 10 cfu (colony-forming units) of S. aureus CYL316tt/pC 3 883 (OD 600 of 0.1=10 8 cfu/ml) from the overnight culture were diluted to 20 ml with 0.01 M PBS (Sigma P-0261) containing 8% hog gastric mucin (Sigma M-2378) as well as 50 μg/ml kanamycin and 10 μg/ml erythromycin. Each mouse of groups 1 through 4 was injected with 0.5 ml of the inoculum intraperitoneally (i.p.), equivalent to 4×10 8 cfu/mouse (lethal dose). Groups 5 and 6 served as vector controls. Each mouse of these two groups was injected with 4×10 8 cfu of CYL316tt/pC 3 875, which was cultured and processed the same way as CYL316tt/pC 3 883. One half hour and four hours after the inoculation, groups 1 and 5 received a saline injection i.p. at 10 ml/kg groups 2 and 6 received i.p. injections of tetracycline (Sigma T-3383) at 8 mg/kg group 3 received i.p. injections of tetracycline at 4 mg/kg group 4 received i.p. injections of ciprofloxacin (Bayer 851510, dissolved in water) at 50 mg/kg. The injection volume for all the animals was 10 ml/kg. Surviving mice were counted at 7 days post inoculation. Ciprofloxacin given at 50 mg/kg protected all infected animals from lethal infection.

The data summarized in Table 2 demonstrate that induction of intracellular expression of the ssJT01ss peptide can be achieved in an animal infection. gátlása S. aureus MetRS by the intracellularly expressed ssJT01ss peptide cured a lethal infection in a mouse model.

TABLE 2
gátlása S. aureus growth in mice by intracellular production
nak,-nek S. aureus MetRS inhibitor
# of Mice# of Mice
Experimental ConditionTestedTúlélés
M1 Peptide
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C255
Expression Control
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C250

The relevant teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference herein in their entirety.

While this invention has been particularly shown and described with references to preferred embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

28 1 33 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 1 acgggtcgac tcatatcttt tattcaataa tcg 33 2 32 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 2 ccggaaagct tacttattaa ataatttata gc 32 3 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 3 taagtaagct taaggaggaa ttaatgatgt ctag 34 4 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 4 acgggtcgac ttaagaccca ctttcacatt taag 34 5 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 5 ctcggtaccg agctaaaatt cggaggcata tcaaatgagc tctgg 45 6 44 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 6 ggcatatcaa atgagctctg gaggtggagg catgtcccct atac 44 7 31 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 7 aggcctaggt taatccgatt ttggaggatg g 31 8 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 8 ctgatccgaa tacgtggcag ttgcggtggc ctatgcatag ct 42 9 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 9 atgcataggc caccgcaact gccacgtatt cggatcagag ct 42 10 48 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 10 tcgagttcat gaaaaactaa aaaaaatatt gacatcccta tcagtgat 48 11 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 11 agagataatt aaaataatcc ctatcagtga tagagagctt gcatg 45 12 29 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 12 caagctctct atcactgata gggattatt 29 13 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 13 ttaattatct ctatcactga tagggatgtc aatatttttt ttagtttttc atgaac 56 14 58 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 14 aataaaaaac tagtttgaca aataactcta tcaatgatag agtgtcacaa aaaggagg 58 15 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 15 gatagagtgt caacaaaaag gaggaattaa tgatgtcccc tatactaggt tattgg 56 16 36 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 16 ggattaaggt aaccttaatc cgattttgga ggatgg 36 17 12 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 17 Asp Pro Asn Thr Trp Gln Leu Arg Trp Pro Met His 1 5 10 18 6 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 18 Gly Gly Arg Gly Gly Met 1 5 19 54 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 19 gatcctaata catggcagtt gaggtggcct atgcatggcg gccgcggagg tatg 54 20 66 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 20 agctctgatc ctaatacatg gcagttgagg tggcctatgc attcttcagg cggccgcgga 60 ggtatg 66 21 21 PRT Artificial Sequence peptide 21 Ser Arg Trp Glu Lys Tyr Ile Asn Ser Phe Glu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 22 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 22 tctagatggg aaaaatatat taattctttt gaattagatt ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 23 21 PRT Artificial Sequence peptide 23 Ser Ser Gln Gly Thr Met Arg Trp Phe Asp Trp Tyr Arg Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 24 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 24 agctctcaag gtactatgag atggtttgat tggtatagat ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 25 49 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 25 agcaccttgg cggccgcgga ggtgctagca aaggagaaga actcttcac 49 26 37 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 26 aactgaggta acctcagttg tacagttcat ccatgcc 37 27 52 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 27 tttaccttgg cggccgcgga ggtaaactga agaaggtaaa ctggtaatct gg 52 28 40 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 28 acttagggta accttaagtc tgcgcgtctt tcagggcttc 40


Identification of the Omega4514 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus that is transcribed in vitro by the major vegetative RNA polymerase

Omega4514 is the site of a Tn5 lac insertion in the Myxococcus xanthus genome that fuses lacZ expression to a developmentally regulated promoter. DNA upstream of the insertion site was cloned, and the promoter was localized. The promoter resembles vegetative promoters in sequence, and sigma(A) RNA polymerase, the major form of RNA polymerase in growing M. xanthus, initiated transcription from this promoter in vitro. Two complete open reading frames were identified downstream of the promoter and before the Omega4514 insertion. The first gene product (ORF1) has a putative helix-turn-helix DNA-binding motif and shows sequence similarity to transcriptional regulators. ORF2 is most similar to subunit A of glutaconate coenzyme A (CoA) transferase, which is involved in glutamate fermentation. Tn5 lac Omega4514 is inserted in the third codon of ORF3, which is similar to subunit B of glutaconate CoA-transferase. An orf1 disruption mutant exhibited a mild sporulation defect, whereas neither a disruption of orf2 nor insertion Omega4514 in orf3 caused a defect. Based on DNA sequence analysis, the three genes are likely to be cotranscribed with a fourth gene whose product is similar to alcohol dehydrogenases. ORF1 delays and reduces expression of the operon during development, but relief from this negative autoregulation does not fully explain the regulation of the operon, because expression from a small promoter-containing fragment is strongly induced during development of an orf1 mutant. Also, multiple upstream DNA elements are necessary for full developmental expression. These results suggest that transcriptional activation also regulates the operon. Omega4514 is the first example of a developmentally regulated M. xanthus operon that is transcribed by the major vegetative RNA polymerase, and its regulation appears to involve both negative autoregulation by ORF1 and positive regulation by one or more transcriptional activators.

Ábrák

Physical map of the Ω4514…

Physical map of the Ω4514 insertion region and summary of upstream segments tested…

Developmental expression of lacZ under…

Developmental expression of lacZ under the control of the Ω4514 promoter. Developmental β-galactosidase…

Localization of an mRNA 5′…

Localization of an mRNA 5′ end within the Ω4514 upstream region. Low-resolution S1…

Primer extension analysis of Ω4514…

Primer extension analysis of Ω4514 mRNA. RNA was isolated from wild-type DK1622 cells…

Developmental expression of lacZ from…

Developmental expression of lacZ from a small segment containing the Ω4514 promoter. Developmental…

In vitro transcription from the…

In vitro transcription from the Ω4514 promoter. DNA fragments containing the Ω4514 promoter…

Western blot analysis of σ…

Western blot analysis of σ A in growing and developing M. xanthus cells.…

Hatása orf1 és orf2…

Hatása orf1 és orf2 mutations on developmental lacZ expression under the control…

Level of ORF1 protein and…

Level of ORF1 protein and β-galactosidase specific activity during growth and development. (A)…

Sequences of promoters transcribed in…

Sequences of promoters transcribed in vitro by M. xanthus σ A RNAP. Az…


Nézd meg a videót: 1 m Videokonferencia-rendszer (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Nekasa

    Bravo, seems to me, is a magnificent phrase

  2. Rockford

    The blog is just great, I will recommend it to my friends!

  3. Ali

    It is remarkable, this valuable opinion

  4. Akishura

    az üzenet érthető



Írj egy üzenetet