Információ

8.8: Az E. coliban történő rekombinációhoz szükséges enzimek – Biológia

8.8: Az E. coliban történő rekombinációhoz szükséges enzimek – Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

A rekombinációt végző enzimek megtalálásának kezdeti lépései a mutánsok genetikai szűrése voltak E. coli amelyek hibásak a rekombinációban. Vizsgálatokat dolgoztak ki a rekombináció tesztelésére, és olyan mutánsokat izoláltak, amelyek a rekombinációs gyakoriság csökkenését mutatták. Ezeket az úgynevezett komplementációs csoportokhoz rendelték recA, recB, recC, recD, és így tovább. Körülbelül 20 különböző gén (különböző rec komplementációs csoportokat) azonosítottak ben E. coli. Mindegyik gén a rekombinációhoz szükséges enzimet vagy enzimalegységet kódol.

E gének közül sokat klónoztak, és kódolt termékeiket különféle enzimatikus funkciókkal jellemezték. Azonban még mindig nincs világos képünk arról, hogy ezek az enzimek hogyan működnek együtt a rekombináció végrehajtásában, és a rekombinációt sem sikerült helyreállítani ban ben vitro tisztított komponensekből. Tovább bonyolítja a dolgokat, hogy több rekombinációs útvonal is jelen van. Sok munkát kell még elvégezni a rekombináció teljes megértéséhez biokémiai szinten. Ennek ellenére a rekombinációs enzimek tömbje legalább részleges képet ad a rekombináció mechanizmusairól. Továbbá az enzimek, amelyekre jellemző E. coli homológjaik és megfelelői vannak más fajokban. Úgy tűnik, hogy a rekombinációs gépezet egyes aspektusai széles filogenetikai tartományban konzerváltak.

A fő enzimatikus lépések a 8.12. ábrán láthatók. Három különböző útvonalat jellemeztek, amelyek különböznek a behatoló egyetlen DNS-szál létrehozásához használt lépésekben. Mindhárom útvonal a RecA-t használja a homológ párosításhoz és a szálcseréhez, a RuvA-t és a RuvB-t az elágazás migrációjához, valamint a RuvC-t és a DNS-ligázt a felbontáshoz. Ezeket a lépéseket és enzimeket külön-külön tárgyaljuk a következő szakaszokban.

8.12. ábra. Enzimatikus lépések a rekombinációban. A rekombináció három útvonalát mutatjuk be, kezdve egy kovalensen zárt, szupertekercses körrel (a duplex minden szála vékony vonallal van feltüntetve) és egy lineáris duplex (mindegyik szál vastag fehér vonallal van feltüntetve) szubsztrátumként. A három útvonal különbözik az iniciáláshoz használt enzimekben, de a következő lépésekben mindháromban közös enzimeket használnak. A Kowalczykowski et al. (1994) Microbiological Reviews, 58:401-465.


DNS-javítás: A sérült DNS 6 legjobb javítási mechanizmusa | Genetika

A következő pontok kiemelik a sérült DNS hat legjobb helyreállító mechanizmusát. A javítási mechanizmusok a következők: 1. Fotó újraaktiválás 2. Kivágás javítás 3. Újrakombinációs javítási mechanizmus 4. A DNS javítása homológ rekombinációval 5. SOS Sérült DNS javítása 6. Eltérés javítása.

1. javítási mechanizmus. Fénykép újraaktiválása:

Tudjuk, hogy az UV-sugárzással besugárzott baktériumok közvetlenül ezután látható fénynek való kitétele jelentős mértékben visszaállítja az UV-inaktivált baktériumok életképességét. Ez a fotoreaktivációnak nevezett jelenség a timin dimerek enzimatikus hasításán alapul.

Az enzim, a fotoliáz, kötődik a timin dimerhez, és katalizálja a dimer ciklobutángyűrűjének fotokémiai hasítását, így a timin szabaddá válik. Az enzim látható fényt használ a reakcióhoz. A timin-dimerek mellett más pirimidin-dimereket – például a citozin-citozint és a citozin-timin-dimert – is megtámadja az enzim. Az enzim mentes minden fajspecifikustól. Fotoliázokat prokariótákban és eukariótákban is kimutattak.

A fotoliáz hatását UV-sugárzással besugárzott, timin dimereket tartalmazó DNS-re a 9.70. ábra mutatja vázlatosan:

Megfigyelték, hogy az 5-brómuracilt tartalmazó UV-sugárzással besugárzott DNS – amely a timin analógja, és beépül a timint helyettesítő replikálódó DNS-be – ellenáll a fotoreaktivációnak. Az ilyen DNS megköti a fotoliáz enzimet, de az enzim nem disszociál a dimertől, és nem tudja felszabadítani a szabad timin molekulákat.

2. javítási mechanizmus. Kivágás javítás:

A fotó-reaktiváláson kívül más mechanizmusok is léteznek a sérült DNS helyreállítására. Ezek egyike a kivágási javítás, amely fény hiányában történik, azaz nem szükséges látható fénynek kitenni. Sötét javításként is ismert.

A kimetszés javítása lényegében a DNS egyik szál sérült részét tartalmazó DNS-szegmens eltávolításából és a DNS-szál eltávolított szegmensének új szintéziséből áll, templátként a sértetlen szál felhasználásával. Az első lépés, amelyet bevágásnak neveznek, magában foglalja a sérült szegmens endonukleáz általi felismerését.

Az enzim felhasítja a cukor-foszfát gerinc foszfodiészter kötését az 5′ végén körülbelül nyolc nukleotiddal a sérült hely előtt, így egy 3′-OH csoport szabadul fel. A következő lépés, amelyet kivágási lépésnek neveznek, egy vágást foglal magában a sérült helytől 4-5 nukleotiddal lefelé, és egy 5′-3′ exonukleáz katalizálja.

Ezáltal a DNS egy szegmense, beleértve a sérült helyet is, eltávolítható. Az utolsó lépésben, amelyet javítási lépésként ismerünk, a DNS-polimeráz I a DNS-szál új szakaszát szintetizálja a 3′-OH végtől kezdve, templátként az ép komplementer szálat használva. Végül az újonnan szintetizált szálat DNS-ligáz köti össze az 5′-végével, hogy befejezze a javítást. A lépéseket vázlatosan a 9.71. ábra mutatja.

A kivágás javításának egy másik változatát a glikoziláz enzim katalizálja, amely a timin dimer timinje és a DNS-szál cukor-foszfát gerince közötti N-glikozidos kötést hasítja. A következő lépésben a foszfodiészter kötést ugyanannak az enzimnek az endonukleáz aktivitása eltávolítja, amely felismeri a vak dezoxiribózt anélkül, hogy bázis lenne hozzá kapcsolva.

A következő lépésben a DNS-polimeráz I elindítja a DNS-szintézist a szabad 3′-OH végén, és kiszorítja a timin dimert néhány további szomszédos nukleotiddal együtt, amint az a 9.72. ábrán látható. Ez a fajta kivágási javítás E. coliban és számos más baktériumban is előfordul, mint például a Micrococcus luteus.

A kimetszés helyreállítása akkor figyelhető meg, ha az UV-kezelt baktériumokat néhány órán át sötét helyen tárolják olyan tápközegben, amely nem támogatja a növekedést, mielőtt visszahelyeznék őket a normál növekedést támogató táptalajba (folyadéktartó helyreállás). Úgy tűnik, hogy a DNS-polimeráz I fontos szerepet játszik a kivágás javítási mechanizmusában.

Kimutatták, hogy az E. coli mutánsok, amelyekben ez az enzim hiányos, kiterjedt DNS-károsodást mutatnak UV-besugárzást követően, feltehetően azért, mert az ilyen mutánsok nem képesek helyreállítani a sérült DNS-t kivágás javító mechanizmussal. Emlékeztetni kell arra, hogy normál DNS-replikációban a polimeráz III (pol III) katalizálja a DNS-szintézist.

3. javítási mechanizmus. Újrakombinációs javítási mechanizmus:

Ez egy másik módja a sérült DNS helyreállításának. Lényegében az egyik DNS-molekula sérült szegmensének egy másik sértetlen szegmensére történő cseréjéből áll. Mivel az ilyen csere csak a sérült DNS replikációja után megy végbe, ezt replikáció utáni javításnak is nevezik.

Amikor egy sérült DNS-molekula - pl. A timin-dimereket tartalmazó DNS UV-sugárzás hatására – a DNS polimeráz III segítségével replikációba kezd, az enzim a dimerhez érve leállítja a szintézist a szabályos kettős hélixben lévő dimer okozta torzulás miatt.

Ennek eredményeként a replikációs villa előrehaladása átmenetileg leáll, amint elér egy dimert. A DNS-szintézis ezután egy új helyen indul újra, néhány nukleotiddal a timin-dimer hely mellett. Így a dimer hellyel és néhány szomszédos nukleotiddal szemben rés keletkezik. Az újonnan szintetizált leányszál több hézaggal, azaz rövid darabokban keletkezik, ha több dimer is előfordul ugyanabban a templátszálban (9.73. ábra).

A leányszálban lévő hézagokat ezután egy testvér-DNS kettős hélixből származó sértetlen homológ szegmensek kicserélésével töltik fel. A donorszálban keletkezett hézagokat ezután a DNS polimeráz I segítségével új DNS szintézissel kitöltik, és a DNS ligázzal lezárják a 9.74. ábrán látható módon. Így a rekombinációs javítórendszerben az egyik szálból hiányzó DNS-szál részeit egy testvér kettős hélix másik normál DNS-szálából nyerik ki.

A sérült DNS-szál továbbra is a sérült helyén marad, és replikálódik, hogy a leányszálban rések keletkezzenek, amelyeket újrakombinációs javítómechanizmussal helyrehoznak. Végső soron a sérült szál túlsúlyban lesz a normál DNS-nél, és jelentéktelen lesz.

A rekombinációs javítási mechanizmusban a recA gén fontos szerepet játszik. Megfigyelték, hogy a recA mutánsok rendkívül érzékenyek a sugárzások és a kémiai mutagének halálos hatásaira. A recA génről ismert, hogy nagyon fontos szerepet játszik a genetikai rekombinációban pl. konjugációban, ahol a recA’ recipiens nem mutat genetikai rekombinációt. A gén rekombinációs javításban is működik, ahol a DNS-szálak cseréje is szerepet játszik.

4. javítási mechanizmus. A DNS javítása homológ rekombinációval:

Erre a fajta javításra akkor van szükség, ha a DNS-molekulák mindkét szála megsérül az egymással szemben lévő helyeken. Ilyen esetben a hiányzó szegmensek nem pótolhatók testvérszálakból a replikáció után a szokásos rekombinációs javítómechanizmussal. Az elveszett részeket egy másik homológ DNS-molekulából kell visszanyerni.

Az aktívan növekvő baktériumokban minden sejt általában egynél több DNS-kópiát tartalmaz. Tehát egy sérült molekula elveszett részei helyrehozhatók egy normál DNS-molekulával való keresztezéssel, amely homológ szegmensek cseréjével jár. Ezt a típusú DNS-javítást homológ rekombinációs javításnak nevezik. Röntgensugárzás hatására a DNS kettős szálú törései indukálhatók. A Rec A fehérje fontos szerepet játszik az ilyen típusú javításokban is.

A javítási folyamat egyszálú szegmensek előállításával kezdődik az egyes szálak 3′-OH végén egy nukleáz hatására, és a Rec A fehérje kötődik az egyes szálakhoz. A Rec A fehérje kötődése elindítja a szálcserét a normál DNS-duplex homológ szegmensei és a sérült szegmens között. A keresztezés eredményeként két DNS-molekula képződik, amelyek mindegyikének van egy sértetlen szála és egy szála hézagokkal.

A hézagokat ezután új DNS-szintézis tölti be, amelyet DNS-polimeráz katalizál, és DNS-ligáz zár. Az ép szálat sablonként használják. Így a keresztezés, amely általában a genetikai diverzitás létrehozásának mechanizmusa a homológ kromoszómákon található gének összekeverésével, a sérült DNS helyreállításának eszközeként is funkcionálhat. A Rec A fehérje létfontosságú szerepet játszik mindkét folyamatban (9.75. ábra).

5. javítási mechanizmus. SOS Sérült DNS javítása:

Az SOS javítási mechanizmus bonyolultabb módon működik. A mutagén ágensek által a DNS-ben okozott károsodások összetett változások sorozatát idézik elő, amelyeket együttesen SOS-reakciónak neveznek. A válasz megnövekedett kapacitáshoz vezet a sérült DNS kivágási javítási és rekombinációs útvonalakkal történő helyreállításához.

Az SOS-választ két fehérje kölcsönhatása hozza létre: a Rec A fehérje, amely a recA gén terméke, és a Lex A fehérje, amely a lexA gén terméke. A Rec A fehérje amellett, hogy szerepet játszik a genetikai rekombinációban és a rekombinációs javításban, proteáz funkcióval is rendelkezik. A Lex A fehérje számos gén represszoraként működik, amelyek SOS génként ismertek, beleértve a recA gént is. Normál körülmények között, azaz amikor az SOS válaszra nincs szükség, ezeket a géneket a Lex A represszor elnyomja.

Az SOS válasz kezdeti eseménye a RecA proteáz aktivitásának aktiválása, amelyet DNS-károsodás indukál. A Rec A proteáz aktivitása a DNS-károsodást követően néhány percen belül aktiválódik. A proteázaktivitás katalizálja a Lex A represszor hasítását, ami inaktívvá teszi azt. Ennek eredményeként az SOS gének expresszálhatók a DNS-javításhoz szükséges enzimek előállításához.

Az eseményeket a 9.76. ábra mutatja:

Az SOS válasz, ahogy a neve is sugallja, vészhelyzeti intézkedés a mutációs károk helyreállítására. Lehetővé teszi a sejt túlélését olyan körülmények között, amelyek egyébként halálosak lettek volna. A DNS-molekulák javításában azonban megnő az új mutációk létrehozásának lehetősége. Ennek az az oka, hogy az SOS javítórendszer lehetővé teszi a DNS-szintézist a sérült terület megkerülésével.

Amikor a DNS polimeráz III elér egy sérült helyet, amelyhez a Rec A kötődik, a fehérje (Rec A) kölcsönhatásba lép a DNS polimeráz molekula epszilon alegységével. Ez az alegység felelős a megfelelő bázis beépítéséért a növekvő DNS-szálba. Ennek eredményeként a lánc megnyúlása folytatódik, elkerülve a sérült helyet, de megnő a rossz alap beépítésének esélye. Az SOS javítás ezért növeli a bázisok hibás párosítása miatti mutáció esélyét. Ezt hibára hajlamos bypass-javításnak nevezik.

Javasoltak egy újabb modellt, amely az UV-sugárzás által besugárzott DNS SOS-javításán alapul bakteriofágokban. Ismeretes, hogy az UV-sugárzás nemcsak timin, hanem timin, citozin és citozin dimerjeit is termeli. A replikáció során amikor elérik, az SOS javítórendszer átmenetileg leáll, és a cisztozin uracillá dezaminálódik.

Az Uracil adeninnel párosul, átmeneti mutációt hozva a C-G bázispár T-A-ra cserélésével. Ez egy hibamentes bypass javítás, amely szerint még mindig mutációt okoz. Hibamentesnek nevezik, mert a templát DNS-szál hűen másolódik az újonnan szintetizált szálban. A C-ről U-ra való váltás magában a sablonszálban történik.

Javítási mechanizmus # 6. Eltérés javítása:

A mutáció sebessége általában 10-7 és 10-11 között változik a baktériumokban. A normál DNS-replikáció során azonban a megfelelő bázis új szálba történő beillesztésekor sokkal nagyobb arányban fordul elő hiba, általában 10-5-ös gyakorisággal. Ez a nagy különbség azt jelzi, hogy a baktériumok beépített mechanizmussal rendelkeznek a replikáció során előforduló legtöbb hiba kijavítására.

A legtöbb bakteriális DNS polimeráz amellett, hogy polimeráz aktivitással rendelkezik, exonukleáz aktivitással is rendelkezik, amely ellentétes irányban működik, azaz míg a polimerizáció az 5′ —> 3′ irányban, addig az exonukleáz a 3′ —> irányban működik. 5′ irányba. Amikor tévedésből rossz bázist inszertálnak a polinukleotid láncba, a DNS-polimeráz leáll, és egy lépést hátrafelé halad, és a nem megfelelő bázist az exonukleáz aktivitás eltávolítja. A polimeráz ezután egy megfelelő bázis behelyezésével folytatja normál aktivitását. Ezt a DNS-polimeráz ellenőrző funkciójának nevezik. A DNS polimeráz megváltozott epszilon alegységével rendelkező mutánsok nem látják el a lektorálási funkciót.

Bár a DNS-polimeráz általi lektorálás hatékony módja sok nem illeszkedő bázis eltávolításának, számos ilyen hiba továbbra is fennállhat a replikáció után. Az ilyen össze nem illő bázispárokat el kell távolítani. Ezeket egy másik javítómechanizmus javítja, az úgynevezett eltérés-javítás.

Ebben a javító mechanizmusban három géntermék (fehérje) vesz részt – a Mut S, a Mut L és a Mut H. Ennek a javítási folyamatnak az első lépése a Mut S fehérje kötődése a nem illeszkedő bázispárhoz. A második lépés magában foglalja a templát egy specifikus szekvenciájának felismerését, amely a -GATC-m E. coli, amelyben az A (adenin) az N-6 pozícióban metilálódik.

A Mut L és Mut H fehérjék, amelyek az új szál metilálatlan -GATC- szekvenciájához kötődnek, komplexet képeznek a Mut S-sel, amely a mismatch párhoz kötődik. Ezáltal a mismatch pár közel kerül a -GATC- szekvenciákhoz. A Mut H fehérje ezután a GATC-helyen elvágja a metilálatlan DNS-szálat, és az eltérést egy exonukleáz eltávolítja.

A keletkező rést ezután DNS polimeráz III és DNS ligáz tölti ki (9.77. ábra):


Eredmények

A szubsztrátok a bakteriális rekombináció in vivo nyomon követésére

A homológ rekombináció kinetikai vizsgálatai megfelelő mennyiségű szubsztrát szinkron bevitelét teszik szükségessé a sejtekbe. Ennek eléréséhez a λ fág hatékony adszorpcióját és szabályozott injekcióját alkalmaztuk. Egyidejűleg kétféle λ kromoszómát fecskendeztünk be, amelyek nem átfedő deléciókat tartalmaztak (​ ábra (2A. ábra), 2A), a fertőzöttből származó tisztított teljes DNS-t. E. coli sejteket, és blot-hibridizációt használtunk az injektált kromoszómák sorsának, valamint a rekombinánsok kialakulásának követésére (​. ábra (2B. ábra). 2B).


2. Rekombináns DNS technológia

A rekombináns DNS-technológia magában foglalja a genetikai anyag organizmuson kívüli megváltoztatását, hogy az élő szervezetekben vagy termékeikben javított és kívánt tulajdonságokat kapjunk. Ez a technológia magában foglalja a kívánt génszekvenciával rendelkező, különböző forrásokból származó DNS-fragmensek beépítését keresztül megfelelő vektor [12]. A szervezet genomjában történő manipulációt vagy egy vagy több új gén és szabályozóelem bevezetésével, vagy az endogén gének expressziójának csökkentésével vagy blokkolásával hajtják végre gének és elemek rekombinációja révén [13]. Enzimatikus hasítást alkalmazunk, hogy különböző DNS-fragmenseket kapjunk, restrikciós endonukleázokat használva a specifikus célszekvencia DNS-helyekhez, majd DNS-ligáz aktivitást alkalmazunk a fragmentumok összekapcsolására, hogy a kívánt gént a vektorban rögzítsük. A vektort ezután bejuttatjuk egy gazdaszervezetbe, amelyet úgy növesztünk, hogy a beépült DNS-fragmentum több kópiáját állítsák elő a tenyészetben, végül a releváns DNS-fragmenst tartalmazó klónokat kiválasztják és begyűjtik [11]. Az első rekombináns DNS (rDNS) molekulákat 1973-ban hozták létre Paul Berg, Herbert Boyer, Annie Chang és Stanley Cohen, a Stanford Egyetem és a San Francisco-i Kaliforniai Egyetem munkatársai. 1975-ben az Asilomar Konferencia során megvitatták az rDNS technológia szabályozását és biztonságos használatát. Paradox módon az Asilomar korabeli tudósok nézete szerint a mezőgazdaságot és a gyógyszerfejlesztést elősegítő rekombináns DNS-módszerek a vártnál tovább tartottak a váratlan nehézségek és akadályok miatt a kielégítő eredmények elérésében. Az 1980-as évek közepe óta azonban az egészség javítása érdekében folyamatosan fejlesztették az olyan termékeket, mint a hormonok, vakcinák, terápiás szerek és diagnosztikai eszközök [13].

A rekombináns DNS-technológia gyors megközelítést kínál azon mutációk genetikai expressziójának alapos vizsgálatára, amelyek az eukarióta génekbe klónozott inzulin gének beillesztése révén kerültek be egy majomvírus-fragmensbe [3]. Hasonló módon gátolta a tumor növekedését az adenovírus vektor, amely antiangiogén hatások révén kódolja az endosztin humán szekréciós formát. Az antiangiogén hatás fokozható dl1520 az Ad-Endo replikáció megmentésével [14]. Célzott génmegszakítást alkalmaztak tumorellenes származékok előállítására más gazdaszervezetekben, amelyek szerkezetileg hasonlóak voltak a termelési útvonalakban [15]. Emellett hosszabb hatású terápiás fehérjéket fejlesztettek ki rekombináns DNS-technológiával, például a további glikozilációs helyet tartalmazó szekvenciák az egyik leggyakrabban követett megközelítés. Ezzel a technikával egy új kiméra gént fejlesztettek ki, amely az FSH-t tartalmazza β-alegységet kódoló szekvenciák és a hCG C-terminális peptidje β-alegységet kódoló szekvenciák [16]. A kutatók vektorokat és kombinált vektorokat is kifejlesztettek génterápiás és genetikai módosítási megközelítésekhez. Jelenleg a vírusvektorok óriási figyelmet kaptak a klinikai körülmények között, amelyek közül néhányat kereskedelmi forgalomba is hoztak. Elvileg a vírusokat úgy módosítják, hogy biztonságosak legyenek klinikai célokra. Számos alkalmazási területük van, beleértve a súlyos betegségek, köztük a rák kezelését in vivo vagy génterápiával (ex vivo), vakcinázással és fehérjetranszdukciós megközelítésekkel [17]. A klinikai minőségű vírusvektorok fejlesztése a fejlett gyártási technológiáknak köszönhetően lehetővé vált [18]. Jelenleg a súlyos káros hatások miatt a retrovirális vektorok veszítenek jelentőségükből, jóllehet a virális entitások gyorsan és helyesen adják át a géneket számos fajba. A legegyszerűbb, nem vírusos génbejuttató rendszer a "csupasz" DNS-t használja, amikor közvetlenül bizonyos szövetekbe, különösen az izmokba injektálják, jelentős génexpressziót eredményez a legkevesebb mellékhatással [19]. Újabban egy P1 vektort terveztek a rekombináns DNS bejuttatására E. coli elektroporációs eljárásokkal. Ezt az új klónozó rendszert 15 000 klónkönyvtár létrehozására használják, kezdetben átlagosan 130� kb pár inszert méretű. A PAC klónozó rendszer hasznosnak tekinthető komplex genomelemzésben és térképezésben [20]. Az alacsony kópiaszámú vektorok, például a pWSK29, pWKS30, pWSK129 és pWKS130 konstrukcióját PCR és rekombináns DNS technológia alkalmazásával végeztük. Ezek a vektorok egyirányú deléciók generálására exonukleázzal, komplementációs analízisre, DNS szekvenálásra és run-off transzkripcióra is használhatók [21]. Az 1. ábrán a rekombináns DNS technológia alkalmazásainak széles körét foglaltuk össze.

A rekombináns DNS-technológia különféle alkalmazásainak illusztrációja.


Anyagok és metódusok

Baktérium és fág törzsek

A baktériumtörzsek azok E. coli K12 származékok és a táblázatban találhatók. Új genotípusokat állítottunk elő standard P1 fág által közvetített transzdukció segítségével (Miller 1992). Jelenléte recA, recG, ruvA, ruvB, és ruvC Az allélokat a fokozott UV-fényérzékenységi fenotípusok igazolták. Mert ruv recG kettős mutánsokat, extrém UV-érzékenységet (Lloyd 1991) igazoltak. Az SMR650-t az SMR632-ből állítottuk elő a transzdukciójával ruvC53 eda-51::Tn10 (Lloyd 1991) a CS85-ből, majd recG258::Tn10 minikan RDK2655-ből (Lloyd és Buckman 1991, R. Kolodnertől szereztük be). Az SMR3124 hasonló módon készült [RDK2641 adományozottruvA59::Tn10 (Shurvinton et al. 1984)]. Az SMR540-ből származó P1-gyel transzdukált SMR632 (laboratóriumi gyűjtemény, allél R. Maurertől, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) SMR4594-et eredményezett. Az SMR4600 az SMR4594 ruvC53 eda-51::Tn10 (Lloyd és Buckman 1991) és recG258::Tn10 minikan (Lloyd és Buckman 1991). Az SMR4601-et SMR4594-ből állította elő SMR624-en növesztett P1-gyel (Harris et al. 1994).

Az SMR3731-et az SMR632 λ-val történő lizogenizálásával állítottuk előJts15 red3 gam210 Δnin5 Sam7 [λSR459 (Sawitzke és Stahl 1997)], majd a kanamicinrezisztenciává történő transzdukciót P1-gyel grpD55 malF::Tn10::kan törzs (Bull és Hayes 1996). Az SMR3732 az SMR3731-ből transzdukálással készült ruvC53 eda57::Tn10::bütyök (CS85 × P1 RM5258 transzduktánsból nyertük) és recG162 zib-636::Tn10(Storm et al. 1971).

A λ fágok vagy a λSR gyűjteményből származnak, vagy F. W. Stahl (Oregon Egyetem, Eugene) vagy S. Hayes (Saskatchewan Egyetem, Saskatoon, Kanada) ajándékai. A keresztezésekben a rekombinánsok gyakoriságának mérésére használt fág genotípusok (. és ábra) Razavy et al. (1996) és λΔb2 piros3 gam210 cén857 Sam7(nin + ) λbio1 (nin + ). Az ábrán használt fágok λSR27, bio1 Δnin5, és az ábrán MMS1816, λJts15 int4 red3 gam210 cén857 Δnin5 MMS1817, λint4 red3 gam210 Δnin5 Sam7és homoimmun profág MMS2076, λJts15 red3 gam210 Δnin5 Sam7, az MMS2084 által biztosított segédcsomagolási funkciókkal, λJts15 int4 red3 gam210 imm 434 Δnin5 Sam7 (Sawitzke és Stahl 1997).

A fágállományok növekedése és E. coli kultúrák

dnaEts törzseket 28°C-on tenyésztettük. ruv recGA kettős mutánsok lassan növekszenek, és kis telepeket képeznek, így a tenyészetek hajlamosak gyorsabban növekvő és nagyobb mutáns telepek felhalmozódására, amelyek szuppresszor mutációkat és valódi reverziókat hordoznak (Lloyd és Buckman 1991, Harris és mtsai. 1996). ruv recG A kettős mutáns törzseket 32 ​​°C-on növesztettük, hogy elkerüljük a szuppresszorok felhalmozódását, amelyek általában e törzsek magasabb hőmérsékleten történő termesztésével kapcsolatosak (Harris és mtsai. 1996). Valamennyi törzs UV- és gyógyszerérzékenységi fenotípusát az egyes kísérletekben használt tenyészeteknél (és/vagy egy adott tenyészetből származó ~30 telepnél) megerősítettük. A tenyészeteket rutinszerűen monitoroztuk a szuppresszorok vagy revertánsok esetleges felhalmozódása szempontjából is, a korábban leírtak szerint (Harris et al. 1996).

λ fág törzseket (könnyű izotópokat hordozó) növesztünk, és a plakk vizsgálatokat standard eljárások szerint végeztük (Murray 1983). A 13C-vel és 15N-nel jelölt λ fágsűrűségű törzseket Stahl et al. (1972) prototróf baktériumokon 12-14 órán át 32 °C-on.

Rekombinációs vizsgálatok

Az ábrákon szereplő kísérleteket a korábbiakhoz hasonlóan végeztük (Razavy et al. 1996), azzal a különbséggel, hogy a vegyes fertőzésekre szánt tenyészeteket 32 ​​°C-on növesztettük, 10-30 μl fagyasztott baktériumtenyészetből beoltva.

Λ rekombinációs vizsgálat DNS-replikáció hiányában

Előmelegített, sűrűségjelzéssel ellátott λ piros gam nin(λSR27) előmelegített SMR4594, 4600 és 4601 (43,5 °C-on, moi = 10) fertőzöttek, amelyeket 28 °C-on 2 × 108 sejt/ml-ig növesztettek tripton táptalajban + 1% élesztőkivonat, 0,2%. maltóz és 0,01 mg/ml B1-vitamin (+25 μg/ml kanamicin ruv recGtörzsek, a felhalmozódás elkerülése érdekében recG transzpozonkivágással képződött revertánsok). A fertőzött sejteket 30 percig buborékoltattuk, 4 ml előmelegített húslevessel (fent) hígítottuk, 35 percig 43,5 °C-on buborékoltattuk, majd hideg TM pufferrel (10 mm, Tris Mg) mostuk, majd hűtött lében (fent) újraszuszpendáltuk. lizozimmal és kloroformmal lizáltuk, pelletizáltuk, és a felülúszókat összegyűjtöttük. Az egyes lizátumokhoz elkészített sűrűséggradienseket (McMilin és Russo 1972) két csepp frakcióként 1 ml TB-be gyűjtöttük, és SMR423-on titráltuk.

A részleges replikációs blokk alatt képződött központi és végi λ rekombinánsok vizsgálata

A részleges replikációs blokkolást homoimmun represszióval és heteroimmun helper fág fertőzéssel értük el Sawitzke és Stahl (1997) leírása szerint, kivéve, hogy E. coli törzsek is hordozták a grpD55 mutáció.grpD55 olyan DnaB helikázt kódol, amely nem lép kölcsönhatásba a λ replikációs fehérjékkel (Bull és Hayes 1996). Ennek az allélnak a hiányában a λ-replikációt nem lehetett kellőképpen blokkolniruv recG törzseket, hogy lehetővé tegyük bármely nem replikálódott fág (HH csúcsok) felbontását. A rekombinánsokat a JAS36 és JAS38 törzseken vizsgáltuk a leírtak szerint (Sawitzke és Stahl 1997).


Az E. coli kromoszómális origójában a replikáció megindításához szükséges szálelválasztást egy távoli RNS-DNS hibrid segíti elő.

Az Escherichia coli iniciátor fehérje, az ATP-vel komplexált dnaA kötődik a replikációs origóhoz (oriC), és megolvasztja a duplexet az oriC AT-ban gazdag részében. A duplex nyitásához minimális hőmérséklet és szuperhélix sűrűség szükséges. A HU fehérje alacsony szintje (5 molekula/oriC) stimuláló hatású, valószínűleg azáltal, hogy elősegíti a DNS hajlítását. A HU fehérje magas szintje (136 molekula/oriC) visszafogja a szabad szuperhelicitást. Az oriC olvadásának kedvezőtlen körülményei között (azaz HU hiánya, magas HU szint, alacsony hőmérséklet vagy alacsony szuperhélicitás) a transzkripció aktiválhatja a replikáció beindítását azáltal, hogy az oriC-től nagy távolságra is elhelyezkedő R-hurkot generál. A dnaB-helikáz belépése előtti oriC-ben a szál-szétválasztási szakasz specifikusan stimulált volt. Az R-hurok általi aktiválást blokkolták, amikor egy 14 GC bázispárból álló szakaszt helyeztek be a hurok és az oriC közé. Így úgy tűnik, hogy az oriC távoli R-hurok általi aktiválása megköveteli a DNS átolvadását a köztes szekvencián keresztül.


Eredmények

A topo IV és a giráz hatása az Int rekombinációra in vivo

Első kísérletsorozatunkban az Int rekombinációs reakciót alkalmaztuk. Ez a helyspecifikus rekombináz reagál (−) szuperspirált plazmidokkal, amelyek közvetlenül ismétlődő DNS-kötő helyeket tartalmaznak, és többszörösen kapcsolt katenánokat képeznek (Spengler és mtsai., 1985). In vivo ezeket a katenánokat a 2-es típusú topoizomerázok gyorsan leválasztják szabad körökbe (Bliska és Cozzarelli 1987). A reakcióprotokoll, amelyet annak meghatározására használtunk, hogy melyik enzim köti le az Int-termékeket, a ​ ábrán, az 1. ábrán látható. 1 . A törzsek egy mutáns λ fág lizogének voltak, amely az Int gént tartalmazza a hőmérséklet-érzékeny represszor szabályozása alatt. cI857 (Bliska és Cozzarelli 1987). A törzsek a pJB3.5d Int rekombinációs szubsztrátot hordozták (Bliska és Cozzarelli 1987). Az Int expressziót úgy indítottuk el, hogy a tenyészeteket 10 percre 43°C-ra állítottuk a represszor inaktiválására. Norfloxacint adtunk hozzá (vagy nem), és a tenyészeteket visszahelyeztük 30°C-ra, hogy aktiváljuk a termolabilis vad típusú Int fehérjét (Guarneros és Echols, 1973). Így a plazmid szubsztrát rekombinációja és a topoizomeráz gátlása egyszerre indult be (0 időpont). A tenyészeteket 30 és 000 °C hőmérsékleten inkubáltuk 60 percig. Ha a dekatenációért felelős topoizomerázt gyógyszer gátolja, akkor a rekombinált plazmid DNS katenánként csapdába kerül.

 Kísérleti rendszer az λ Int rekombinációval előállított katenánok szétválasztásának mérésére. A sejteket 30°C-on 70 Klett egység sűrűségig növesztettük, és 43°000°C-ra toltuk, ahol az Int expresszálódik, de inaktív. 30ଌ-ra való leváltáskor az Int rekombinálja a pJB3.5d szubsztrát plazmidot, hogy többszörösen összekapcsolt katenánokat hozzon létre. A 2-es típusú topoizomeráz szétválasztja a katenánokat, így szabad 0,6 és 2,9 kb méretű köröket szabadít fel.

Mielőtt megvizsgálnánk a termékek katenázott részét, fontos megjegyezni, hogy a norfloxacin befolyásolja a rekombináció gyakoriságát. A topoizomerázok gátlása nemcsak a dekatenációt gátolja, hanem befolyásolja a sejt DNS szuperspirálozásának szintjét is, ami viszont modulálja a rekombinációt (Nash 1990). Mivel a szupertekercselés még maguknak a topoizomerázoknak is befolyásolja a transzkripciót (Menzel és Gellert 1983), ezért az Int transzkripcióját a norfloxacin hozzáadása előtti időre korlátoztuk, hogy biztosítsuk, hogy a DNS szuperspirálozásában bekövetkező változások ne legyenek hatással az Intre. szintézis, csak az Int rekombinációs képessége alapján (​ ábra (1. ábra 1 ).

Megmértük a norfloxacin hatását a rekombináció mértékére mind a hat teszttörzsben, az LZ33–LZ38 (lásd a ​ táblázatot, az 1. táblázatot). 1 ). Az egyszerűség kedvéért ezeket a törzseket a topo IV és giráz genotípussal hivatkozzuk. A plazmidokat a rekombinációs reakciók során különböző időpontokban izoláltuk, DNáz I-gyel bemetszettük, és nagy felbontású gélelektroforézissel és Southern blottal analizáltuk. A rekombináns termékekben lévő jelölőanyag mennyiségét az összes plazmid DNS-ben lévő teljes jelölés százalékában az egyes törzseknél a ​ ábra mutatja, a 2. ábra. 2. Ezen és két további ábrán az eredményeket oszlopdiagramok formájában mutatjuk be. A bal oldali három panel az gyrA + törzsek és a jobb oldalon lévő három törzsek gyrA L83, amely a girázt rendkívül ellenállóvá teszi a norfloxacinnal. A felső sorban, parC vad típusú a középső sorban, parC közepes mértékben rezisztens a norfloxacinnal szembenparC L80) és az alsó sorban, parC rendkívül ellenálló a norfloxacinnal szembenparC K84). Minden egyes törzs esetében megmutatjuk a rekombináció mértékét 0, 30, 60, 90 vagy 120 µm norfloxacin jelenlétében. Minden gyógyszerkoncentráció esetén az adatok 0, 20, 30, 45 és 60 perccel jelennek meg a gyógyszer hozzáadása után, és a 30°C-ra való csökkentést követően. A gyógyszerkoncentrációkat a Kén értékek, amelyeket a topo IV vagy a giráz gátlására határoztunk meg in vitro és in vivo (​ táblázat (2A 2A táblázat, lásd Anyagok és módszerek). Kén értékeket, elkészítettük a ​ táblázatot, a 2B 2B táblázatot, amely minőségileg mutatja a vad típusú vagy mutáns giráz és a topo IV gátlását a jelen munkában használt gyógyszerkoncentrációk mellett.


Nyárias

D) megakadályozza, hogy az aktivátor fehérjék kötődjenek a DNS-helyekhez.

A) binds to RNA polymerase when tryptophan is present.

B) binds to the trp operator in the absence of tryptophan.

C) binds to the trp operator in the presence of tryptophan.

A) Attenuation is the only mechanism used to regulate the trp operon.

B) One of the enzymes in the Trp biosynthetic pathway binds to the mRNA and blocks translation when tryptophan levels are high.

C) The leader peptide plays a direct role in causing RNA polymerase to attenuate transcription.

D) Trp codons in the leader peptide gene allow the system to respond to tryptophan levels in the cell.

A) Large polycistronic transcripts are common.

B) Most regulation is positive, involving activators rather than repressors.

C) Transcription and translation are mechanistically coupled.

D) Transcription does not involve promoters.

A) Access to eukaryotic promoters is restricted by the structure of chromatin.

B) Most regulation is positive, involving activators rather than repressors.

C) Larger and more multimeric proteins are involved in regulation of eukaryotic transcription.

D) Transcription and translation are separated in both space and time.

A) A, C, G, and U are the only bases present in the molecule.

B) Although composed of a single strand of RNA, each molecule contains several
short, double-helical regions.

C) Any given tRNA will accept only one specific amino acid.

D) The amino acid attachment is always to an A nucleotide at the 3' end of the molecule.

A) "recognize" specific tRNA molecules and specific amino acids.

B) in conjunction with another enzyme attach the amino acid to the tRNA.

C) interact directly with free ribosomes.

D) occur in multiple forms for each amino acid.

B) formylmethionyl tRNAfMet.

D) initiation factor 2 (IF-2).

A) At least five high-energy phosphoryl groups are expended for each peptide bond formed.

B) During elongation, incoming aminoacylated tRNAs are first bound in the P site.

C) Elongation factor EF-Tu facilitates translocation.

D) Peptidyl transferase catalyzes the attack of the carboxyl group of the incoming amino acid on an ester linkage in the nascent polypeptide.

A) The first base in a codon is the most important for coding, followed by the second base, and the third base is least important.

B) Each amino acid can be specified by more than one codon.

C) Fewer amino acids are coded by the four bases than was expected.

D) The less complexity in an organism, the fewer codons are specified.

A) Specific pairing of purines with pyrimidines

B) Binding of large and small ribosimal subunits

C) Binding of codon with anticodon

D) Binding of tRNA with A-site on ribosomes

A) Phosphorylation from ATP

C) Formation of a temporary disulfide bond

A) Changes in the shape of the major and minor grooves, leading to single-stranded areas

B) Changes in the hydrogen bonding between bases in specific regulatory sequences of DNA

C) Proteins bound in the major groove of DNA through hydrogen bonds

D) Alterations in Lk of the DNA in specific regions that changes it from B-form to either Z-form or single strands

A) Increased rate of DNA condensation

B) Unwinding DNA in preparation for replication

C) Increased gene transcription

D) Formation of 30 nm filaments through acetylation

A) It is the binding site for ethidium bromide.

B) It is a binding site for regulatory proteins.

C) It is a region of denatured DNA to which restriction endonucleases bind.

D) It is a region of DNA that can form a hybrid duplex with DNA of another species.

When a certain compound (X) is added to the growth medium of E. coli, the separate enzymes A-ase and B-ase are both synthesized at a 50-fold higher rate than in the absence of X (which has a molecular weight of about 200). Which one of the following statements is true of such an operon?

A) Adding X to the growth medium causes a repressor protein to be released from the O region.

B) Adding X to the growth medium causes a repressor protein to bind tightly to the O region.

C) Synthesis of the mRNA from this operon is not changed by the addition of compound X.

D) The mRNA copied from this operon will be covalently linked to a short piece of DNA at the 5' end.


ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Bakteriofág λ strains: λDRL246 was constructed by cloning a Zeocin resistance marker in an EcoRI-BglII fragment from pZeoSV2(+) (Invitrogen Corp., San Diego) into the multicloning site of TXF97 (S t . P ierre and L inn 1996) using the BamHI and EcoRI sites. A 246-bp interrupted palindrome consisting of inverted repeats of 111 bp separated by a 24-bp spacer had been cloned previously from SKK43 (K ulkarni 1990) into pUC18 and was cloned into the multicloning site of λDRL246 as an EcoRI fragment to form λDRL282 (this laboratory). Two internal mismatches were introduced into the palindrome sequence during this process.

λDRL154 (pal571, Δspi6, cI857, χ + ) contains a 571-bp palindromic sequence (this laboratory). λDRL 152 is an isogenic phage lacking the palindrome sequence.

Lysogenization: Overnight cultures of bacterial strains to be lysogenized were diluted 10-fold in L broth containing 2% maltose and 5 m m Mg2ÍGY4 and grown to a cell density of 4 × 10 8 cells ml −1 (A650 = 0.9). Cultures were diluted with an equal volume of 10 m m Tris, 10 m m Mg2ÍGY4 pH 8 buffer (TM buffer) to give a final cell density of 2 × 10 8 pfu ml −1 . Bacteriophage lysates were diluted to 2 × 10 9 pfu ml −1 . An aliquot (0.15 ml) of phage was added to 0.15 ml of bacterial cells and allowed to adsorb for 60 min at 30°. Infected cells were diluted in phosphate buffer and appropriate dilutions plated on low-salt (85 m m NaCl) L AGAR plates supplemented with Zeocin (Invitrogen Corp.) at a concentration of 16 μg ml −1 or on L AGAR plates. To prevent the appearance of dnaC suppressor mutations the priA strains DL1133 and DL1134 (Table 1) were grown on minimal liquid medium (Spitzizen Salts supplemented with 0.2% glucose, 15 μg ml −1 threonine, 15 μg ml −1 histidine, 15 μg ml −1 arginine, 15 μg ml −1 leucine). Log phase cultures were then diluted with TM buffer and lysogenized in the same way as the other strains. The recombination efficiency of the priA strains was measured by P1 transduction frequency to check that suppressor mutations had not occurred.


Visualization of protoplast fusion and quantitation of recombination in fused protoplasts of auxotrophic strains of Escherichia coli

Protoplast fusion has been used to combine genes from different organisms to create strains with desired properties. A recently developed variant on this approach, genome shuffling, involves generation of a genetically heterogeneous population of a single organism, followed by recursive protoplast fusion to allow recombination of mutations within the fused protoplasts. These are powerful techniques for engineering of microbial strains for desirable industrial properties. However, there is a prevailing opinion that it will be difficult to use these methods for engineering of Gram-negative bacteria because the outer membrane makes protoplast fusion more difficult. Here we describe the successful use of protoplast fusion in Escherichia coli. Using two auxotrophic strains of E. coli, we obtained prototrophic strains by recombination in fused protoplasts at frequencies of 0.05–0.7% based on the number of protoplasts subjected to fusion. This frequency is three–four orders of magnitude better than those previously reported for recombination in fused protoplasts of Gram-negative bacteria such as E. coli és Providencia alcalifaciens.


Nézd meg a videót: Fehérjék irreverzibilis kicsapódása (Lehet 2022).