Információ

Az antimuscarin szerek növelik-e a cAMP-t vagy a cGMP-t

Az antimuscarin szerek növelik-e a cAMP-t vagy a cGMP-t


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Az M2 és M4 muszkarin receptorok aktiválása gátolja az adenilát-ciklázt, amely csökkenti a cAMP szintjét. Várható, hogy az antimuszkarin szerek, például az ipratropium növelik a cAMP-szintet. Az ipratropium farmakológiai hatását azonban a megnövekedett cGMP-szint közvetíti [1]. Miért van ez így?

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/138578


A ciklikus dinukleotidok megkötik a HCN4 C-linkerét, hogy szabályozzák a csatorna cAMP válaszkészségét

A cAMP a szívritmus autonóm szabályozását közvetíti a hiperpolarizáció által aktivált ciklikus nukleotid-kapuzott (HCN) csatornákon keresztül, amelyek a pacemaker I áramának hátterében állnak.f. A cAMP kötődése a C-terminális ciklikus nukleotidkötő doménhez növeli a HCN nyitott valószínűségét egy konformációs változás révén, amely a C-linkeren keresztül éri el a pórust. Strukturális és funkcionális analízis segítségével azonosítottunk egy kötőzsebet a HCN4 C-linkerében. A ciklikus dinukleotidok, az emlősök másodlagos hírvivőinek feltörekvő osztálya, megkötik a C-linker zsebet (CLP), és antagonizálják a csatorna cAMP-szabályozását. Ennek megfelelően a ciklikus dinukleotidok megakadályozzák az I cAMP szabályozásátf a sinoatriális csomópont myocytáiban, 30%-kal csökkentve a pulzusszámot. A CLP elfoglalása ezért hatékony mechanizmust jelent a β-adrenerg stimuláció gátlására az I.f. Eredményeink rávilágítanak a C-linker szabályozó szerepére, és azonosítják a potenciális gyógyszercélpontot a HCN4-ben. Ezenkívül ezek az adatok kiterjesztik a ciklikus dinukleotidok jelátviteli hatókörét emlősökben, túlmutatva a veleszületett immunrendszerben betöltött elsőként jelentett szerepükön.


Bevezetés

A nitrogén-oxidot (NO) először Stuehr és Marletta (1985) 1 írta le, mint aktivált egér makrofágok termékét. Ezenkívül az endothelium-derived relaxing factor (EDRF) néven ismert anyagot, amelyet Furchgott és Zawadzki (1980), 2, 3 ír le, NO-ként azonosították.

Az oldható guanilát-ciklázt (sGC), amely a guanozin-5-trifoszfát (GTP) ciklikus guanozin-3',5'-monofoszfáttá (cGMP) történő enzimatikus átalakulásáért felelős, csaknem három évtizeddel ezelőtt azonosították először emlőssejtek alkotóelemeként. 4

A NO és a cGMP együttesen egy különösen széles körű jelátviteli rendszert alkotnak, ha figyelembe vesszük a cGMP számos szerepét a fiziológiai szabályozásban, beleértve a simaizom relaxációt, a vizuális transzdukciót, a bél iontranszportját és a vérlemezke funkciót. 5

Az erekciós diszfunkció (ED) a kielégítő szexuális teljesítményhez elegendő erekció elérésének vagy fenntartásának állandó képtelensége, és az öregedés természetes folyamatának tekintik. 6 Tanulmányok kimutatták, hogy az ED-t a corpus cavernosum nem megfelelő relaxációja okozza NO termelési zavarral. 7

Nyilvánvaló, hogy az NO a domináns neurotranszmitter, amely a cavernazális simaizom relaxációért és ezáltal a pénisz erekciójáért felelős. Hatását a második hírvivő cGMP létrehozása közvetíti. A neurális eredetű NO-t a pénisz simaizom-relaxációjának közvetítőjeként állapították meg, és úgy gondolják, hogy a nitrogén-monoxid-szintáz (NOS) konstitutív formái közvetítik az erekciót. 8 A felszabaduló NO aktiválja az sGC-t, amely katalizálja a GTP átalakulását intracelluláris második hírvivő cGMP-vé a simaizomsejtekben. A cGMP növekedése modulálja a sejtes eseményeket, például a simaizomsejtek relaxációját. 9

Ez az áttekintés leírja a barlangi relaxációban szerepet játszó sejtes eseményekről szóló jelenlegi ismereteket, valamint az NO által közvetített relaxációban szerepet játszó feltételezett tényezők körét.


Absztrakt

A pitvari natriuretikus peptidre (ANP) vagy a nitrogén-monoxidra (NO) reagáló ciklikus GMP (cGMP) a simaizomtónus rövid távú változásainak és a krónikus gyógyszeres kezelésre vagy a proliferatív jelekre adott hosszabb távú válaszok fontos szabályozója. A simaizomsejtek (SMC) azon képessége, hogy foszfodiészteráz (PDE) izoenzimek különböző kombinációit használják fel, lehetővé teszi, hogy a cGMP közvetítse ezeket a többszörös folyamatokat. Például a PDE5 mint fő cGMP-hidrolizáló PDE hatékonyan szabályozza a simaizom relaxáció kialakulását. A kontrakció létrejöttéhez a PDE5 aktiválódik, és a cGMP csökken. Ezzel szemben a PDE5 aktivitás blokkolása lehetővé teszi a relaxációs ciklus meghosszabbítását és fokozását. A közelmúltban kimutatott PDE5 közvetlen aktiválása a cGMP-nek a GAF A doménhez való kötődésével arra utal, hogy ez a szabályozó hely új gyógyszerfejlesztés célpontja lehet. A vazokonstriktor által kiváltott összehúzódással összefüggő kalcium-túllépés egy kalcium/kalmodulin-függő PDE-t (PDE1A) is aktivál. A PDE5 és a PDE1A együtt kellően csökkenti a cGMP-t ahhoz, hogy lehetővé tegye az összehúzódást. Hosszabb távon mind a PDE5, mind a PDE1A mRNS-t a guanilil-cikláz krónikus stimulációja indukálja. Ez az indukció a NO-felszabadító gyógyszerekkel szemben kialakuló tolerancia fő oka. Végül a cGMP vagy cAMP magas szintje fékként is hat az SMC-k számos mitogénre adott proliferatív válaszának csillapítására. Az érkárosodást követően az SMC proliferáció megtörténtéhez a cGMP és cAMP szintjét csökkenteni kell. Emberben ezt a csökkenést nagyrészt egy másik Ca 2+ /kalmodulin-függő PDE (PDE1C) indukciója okozza, amely lehetővé teszi a fék feloldását és a proliferáció megindulását.

A ciklikus nukleotid másodlagos hírvivőkről, a cAMP-ről és a cGMP-ről kimutatták, hogy a folyamatok széles skáláját szabályozzák a test számos különböző szövetében, és azt javasolták, hogy még sok mást is szabályoznak. Valójában olyan sok különböző folyamat modulálására javasolták őket, hogy egészen a közelmúltig nehéz volt megérteni, hogy ezek az egyszerű, kicsi, másodlagos hírvivő molekulák hogyan biztosíthatják mind a hatás specifikusságát, mind pedig az ilyen szabályozáshoz szükséges funkciók sokféleségét. Különösen problematikus annak megértése, hogy a nagyon gyors és nagyon lassú folyamatok hogyan modulálhatók ugyanazokkal a mechanizmusokkal.

Jelentős fogalmi előrelépést jelentett azon mechanizmusok megértésében, amelyekkel az ilyen időben és térben eltérő folyamatok szabályozhatók, annak felismerése, hogy a szervezetben számos különböző izoenzim van jelen a cAMP és cGMP szintéziséhez (ciklázok) és lebontásához (foszfodiészterázok, PDE-k). 1 Például legalább 10 különböző adenilil-cikláz gént és közel 20 különböző PDE gént azonosítottak emlősfajokban. Bármely sejttípus két vagy három különböző ciklázt és három vagy négy különböző PDE-t expresszálhat. Ennél is fontosabb, hogy a sejt bármely részében kifejezhető lehetséges kombinációk száma nagyon nagy. Ezért a szintetikus és lebontó enzimek egyedi kombinációinak differenciált expressziója és lokalizációja minden sejtnek molekuláris megoldást kínál ezekre a problémákra.

Az artériás simaizomzatban számos folyamatot a cAMP és a cGMP szabályoz. Ide tartoznak az anyagcsere- és mechanikai események, amelyek viszonylag gyors ütemben szabályozódnak. Az izom kontraktilis tónusa talán a legjobb példa erre. 2 Mind a cAMP, mind a cGMP nagyrészt simaizom-relaxációt okoz az intracelluláris kalciumszintet csökkentő vagy a miozin-foszfatáz aktiválása révén. A ciklikus nukleotidok által szabályozott lassabb változások közé tartozik a sérülés hatására bekövetkező megváltozott proliferáció, vagy akár hosszabb távú deszenzibilizáció a gyógyszerek vagy hormonok általi krónikus stimulációra. Mint minden szabályozó hírvivő esetében, a ciklikus nukleotid jelek amplitúdóját és időtartamát a szintézis sebessége és a degradáció sebessége szabályozza. Ebben a cikkben áttekintünk néhány jelenlegi gondolatot a simaizom működésének ciklikus nukleotidok általi szabályozásáról, és különösen a foszfodiészterázok szerepéről, amelyek vagy hidrolizálnak, vagy reagálnak a cGMP-re.

A sima izomműködés szabályozása ciklikus nukleotid foszfodiészterázokkal

Jelenleg 11 különböző PDE-géncsaládról ismert, hogy az emlősök szöveteiben expresszálódik (1. ábra). A legtöbb család egynél több gént tartalmaz, és a legtöbb gén egynél több mRNS-t kódol (alternatív splicing vagy alternatív transzkripciós starthelyekkel). Fajtól függően az artériás simaizomzatban jelen lévő fő foszfodiészterázok a PDEs1A, 1B és 1C, a PDEs3A és 3B, valamint a PDE5. Néhány fajban jelentős mennyiségű PDE4 aktivitás a simaizomban is kifejeződik. Mivel a PDE4 specifikus a cAMP-re, és a cGMP nem szabályozza, szerepét ebben az áttekintésben nem tárgyaljuk tovább. Bázis körülmények között (azaz alacsony kalciumszint esetén) úgy gondolják, hogy a legaktívabb cGMP-t hidrolizáló PDE a simaizomban a cGMP-specifikus, cGMP-kötő PDE, a PDE5. Magasabb kalciumtartalmú körülmények között (pl. izomösszehúzódás során és esetleg osztódásra serkentett sejtekben) a PDE1 variánsok közül egy vagy több válhat a domináns PDE-vé. Bár a PDE3 nem rendelkezik akkora teljes katalitikus kapacitással, mint a másik kettő, mégis szerepet játszhat a cAMP és talán a cGMP szabályozásában a sejt specifikus részeiben. Ezt az enzimet erősen gátolja a cGMP, és számos korábbi tanulmányban cGMP-inhibált PDE-nek nevezték. Minden esetben emlékeznünk kell arra, hogy ezek a különböző PDE-k nem szükségszerűen osztoznak ugyanazon a szubcelluláris lokalizációban, és ezért gyakran legalább részben különböző funkcionális részeket szolgálnak ki a sejtben.

1.ábra. 11 PDE géncsalád tartományszervezése. Minden PDE jelentős homológiát mutat a katalitikus doménjében, de nagymértékben különbözik az N-terminális részeikben, amelyek különböző típusú szabályozó doméneket tartalmaznak. Az UCR domén egy upstream konzervált régió, amely csak a PDE4-ben található. A GAF és PAS tartományok a megfelelő csoportok kezdőtagjainak kezdőbetűiből származnak. A GAF doméneket (c GMP által szabályozott foszfodiészterázok, számos denilil-cikláz és F hlA) eredetileg a PDE2, PDE5 és PDE6 definíciói határozták meg, később pedig a PDE10 és PDE11. A PAS domént (Per, A RNT és S im fehérjék) csak a PDE8-ban találták meg.

PDE5: cGMP-specifikus, cGMP-kötő foszfodiészteráz

PDE5 és sima izomlazítás

Jól ismert, hogy a nitrogén-monoxid (NO), a pitvari natriuretikus peptid (ANP) és számos más endogén értágító szer szabályozza a simaizom tónusát a guanilil-cikláz aktiválása, a cGMP-szint emelkedése és a cGMP-függő proteinkináz (PKG) aktiválása révén (ábra). 2). Úgy tűnik, hogy a NO/cGMP hatása a simaizom összehúzódására specifikusan a PKG által közvetített, de nem a cAMP-dependens protein kináz (PKA) által, mivel PKG-I-hiányos egerekben az aorta simaizomzatának cGMP által kiváltott relaxációja teljesen megszűnik, míg a cAMP -a függő relaxációt nem befolyásolja. 2 Számos specifikus fiziológiai szubsztrátja van a PKG-nek a simaizomban, beleértve a miozin-foszfatáz szabályozó miozinkötő alegységét, 3 kalcium-aktivált maxi K + (BK)kb) csatornák, 4 és IRAG (IP3 receptorhoz kapcsolódó cGMP kináz szubsztrát). 5 Mindezen célpontok foszforilációja hozzájárul az intracelluláris Ca 2+ koncentráció csökkenéséhez vagy a Ca 2+ iránti érzékenység csökkenéséhez, és ezáltal csökkenti a simaizom tónusát. 6

2. ábra. A cGMP a simaizom működésének fontos szabályozója. A nitrogén-monoxid (NO) és más endogén értágítók szabályozzák a simaizom tónusát a cGMP/PKG jelátviteli útvonalon keresztül. I, PDE5 hatékonyan szabályozza a simaizom relaxáció kialakulását. A PDE5 aktivitás blokkolása lehetővé teszi a simaizomzat fokozását és meghosszabbítását a relaxációs ciklusban. II, A krónikus nitroglicerin-kezelésre adott hosszabb távú válaszok (nitro-tolerancia) változásokat idéznek elő a PDE1A és a PDE5-ben, és ezáltal kevésbé reagálnak a cGMP-re. III, a PDE1C csak a proliferatív fenotípusú humán simaizomsejtekben indukálódik, és gátlása az SMC-k proliferációjának elnyomását eredményezi.

A PDE5, mint a simaizomsejtekben kifejeződő fő cGMP-hidrolizáló PDE, képes hatékonyan szabályozni ezt a cGMP/PKG jelátviteli útvonalat, különösen alacsony kalciumszint esetén. Amint azt később tárgyaltuk, magasabb kalciumtartalmú körülmények között a PDE1-ek valószínűleg egyre fontosabb szerepet játszanak. A PDE5 minden típusú vaszkuláris és zsigeri (méh, vékonybél) SMC-ben megtalálható. A PDE5 fiziológiai jelentőségét a simaizomtónus szabályozásában a leghatékonyabban specifikus inhibitorának, a szildenafilnek (Viagra, Pfizer Pharmaceuticals) sikeres klinikai alkalmazása bizonyítja az erekciós zavarok kezelésében. 7 A corpus cavernosum simaizomzatának ellazulását az endothel sejtekből és az artériákat és a sinusoidokat körülvevő nemkolinerg nonadrenerg (NANC) neuronokból történő NO felszabadulás indukálja a corpora cavernosában. A PDE5 hidrolitikus aktivitásának gátlásával a szildenafil a NO hatására nagyobb arányban halmozódik fel a cGMP, így fokozza az erekciós választ. 8

PDE5 és pulmonalis vasculature

A közelmúltban a pulmonális hipertónia kezelése a PDE5-gátlók klinikai alkalmazásának új lehetséges területeként jelent meg. A pulmonális hipertónia egy életveszélyes betegség, amelyet magas pulmonális artériás nyomás és vaszkuláris ellenállás jellemez. 9 A pulmonalis érrendszerben a NO fontos szerepet játszik érrelaxánsként. Jelenleg az inhalációs nitrogén-monoxid az egyik leghatékonyabb terápia a pulmonális hipertónia kezelésére. 10 Az exogén módon beadott NO egyik előnye, hogy csekély hatással van a szisztémás vérnyomásra. A NO felezési ideje azonban viszonylag rövid, ezért a hatékony NO kezeléshez többszöri beadás szükséges. Sajnos a tachyphylaxia általában néhány napon belül jelentkezik.

A szildenafil pulmonális hipertónia kezelésére való alkalmazása pozitív eredményeket mutatott emberekben. Egy súlyos primer pulmonális hipertóniában szenvedő betegek klinikai vizsgálata a szisztolés pulmonális nyomás drámai javulását mutatta ki orális szildenafil kezelés után. 11 Egy másik jelentésben a szildenafilről azt találták, hogy erős pulmonalis értágító, és jobb, mint az inhalált NO a pulmonalis artériás nyomás és a pulmonalis vaszkuláris ellenállás csökkentésében. 12 A szildenafil és az NO kezelés kombinációja még nagyobb, szinergikus hatást produkált.

PDE5 és a szisztémás érrendszer

Eredetileg a szildenafilt anginás gyógyszerként tesztelték, a PDE5-öt célozva a szisztémás érrendszerben. 13 A korai klinikai vizsgálatok során azonban hamar nyilvánvalóvá vált, hogy a szildenafilnek csak szerény hatása van a szisztémás vérnyomás csökkentésére. Mindazonáltal ez a csekély hatás súlyos hipotenzióba fordulhat szildenafil és nitroglicerin vagy más szerves nitrátok kombinációját szedő betegeknél. Ez összhangban van a PDE5 széles körben elterjedt előfordulásával minden simaizomágyban. Mivel a szildenafil képes nagymértékben fokozni a NO-t termelő vegyületek hatását, a szildenafil alkalmazása ellenjavallt a legtöbb olyan betegnek, aki bármilyen szerves nitrátot is használ. 14

Így, mint minden PDE5-inhibitor esetében, a szildenafil akkor a leghatékonyabb, ha a NO/cGMP jelátviteli útvonal aktiválva van, ami arra utal, hogy ezeknek az inhibitoroknak a klinikai alkalmazása potenciálisan kiterjeszthető más, a cGMP jelátvitel változásával összefüggő betegségekre is.

A közelmúltban két másik PDE5-specifikus inhibitor, a tadalafil (Cialis, Lilly ICOS LLC) és a vardenafil (Levitra, Bayer és GlaxoSmithKline) kifejlesztéséről számoltak be. 15,16 Mindegyik képes gátolni a PDE5 aktivitást IC-vel50nmol/L koncentráció tartományban van, és jelenleg mindkettőt merevedési zavarok kezelésére használják. Mindegyikük nagyon hasonló affinitással rendelkezik a PDE5-höz, de farmakokinetikájukban és más PDE-kkel szembeni szelektivitásukban némileg eltérnek. 17 Még nem világos, hogy ezek a különbségek javítanak-e a klinikai hatékonyságban vagy a mellékhatások megjelenésében.

PDE5 illesztési változatok és tartományszervezés

A PDE5A három különböző izoformájáról számoltak be, a PDE5A1, PDE5A2 és PDE5A3 (táblázat). Minden PDE5 variáns csak az N-terminális végén tér el. Az első PDE5, amelyet homogenitásig tisztítottak, a szarvasmarha tüdejéből származó oldható enzim volt. 18 Eredetileg cGMP-kötő, cGMP-specifikus PDE néven ezt az izoformát PDE5A1 néven ismerik. Úgy tűnik, hogy ez a domináns forma, amely a legtöbb PDE5-tartalmú szövetben expresszálódik. A humán PDE5A1 nagyon hasonló a szarvasmarha PDE5A1-hez, azzal a különbséggel, hogy az N-terminális végén további 10 aminosavat tartalmaz. 19–21 Egy másik változat, a PDE5A2, szignifikánsan rövidebb aminosav N-terminális fragmentumot tartalmaz, és több fajban is kimutatták. 22 A PDE5A3-ról csak emberi szövetekben számoltak be RT-PCR adatok alapján. 23

Asztal 1. A PDE5 izoformák N-terminális végükben különböznek

A PDE5 nagymértékben specifikus a cGMP hidrolízisre, és két homológ N-terminális szabályozó domént tartalmaz, amelyeket nemrég GAF A és GAF B néven határoztak meg a hasonló szabályozó motívumokkal való szekvenciahomológiájuk alapján, amelyekről ismert, hogy fehérjék nagy csoportjában jelen vannak. 24 Ennek a csoportnak a kezdeti tagjai a cG MP által szabályozott foszfodiészterázok (PDE2, PDE5 és PDE6), számos denilil-cikláz és egy bakteriális transzkripciós faktor, az F hlA voltak. A mozaikszó, a GAF, e csoportok első betűiből származik. Az adatbázisban nemrégiben végzett keresés azt mutatja, hogy közel ezer másik fehérje tartalmaz GAF domént. Sokan azonban csak prokariótákban fejeződnek ki.

A PDE5 GAF A doménje a leginkább homológ a PDE2 GAF B doménjével, amely szintén nagy specifitással köti a cGMP-t. A közelmúltban sikerült megoldani a PDE2 cGMP-hez kötött GAF A/B doménjeinek kristályszerkezetét. 25 Úgy gondolják, hogy a PDE5 GAF domének szerkezete nagyon hasonló lesz.

A PDE5 aktivitás szabályozásának mechanizmusai

A PDE5 PKG-indukált foszforilációja

Néhány évvel ezelőtt in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a PDE5 az N-terminális részén (92-es szerin) foszforilálódik, és a cGMP kötődése a PDE5 nem katalitikus GAF doménjéhez szükséges a PKA vagy PKG általi foszforiláció maximális sebességéhez. 26,27 Ez a foszforilációs hely minden PDE5 izoformában konzervált, beleértve a szarvasmarha, ember, kutya, egér és patkány PDE5-öt. Mindazonáltal továbbra is kérdéses maradt, hogy a foszforilációnak van-e fiziológiai jelentősége in vivo. Hamarosan kimutatták, hogy tenyésztett patkány simaizomsejtekben a 32P beépülhet a PDE5-be 32P-ATP-vel történő előjelölés és ANP-kezelés után. 28

Újabban egy kvantitatívabb megközelítés, amely a PDE5 foszforilációs helyére specifikus antitesteket alkalmaz, jó korrelációt mutatott az aktivitás és a PKG általi fokozott foszforiláció között, mind in vitro, mind intakt sejtekben nem. 29 A 8-Br-cGMP hozzáadása a tenyésztett humán simaizomsejtekhez a PDE5 foszforilált formájának fokozatos felhalmozódásához vezetett (3A. ábra). Amikor a PDE5 foszforilációját összehasonlították az értágító-stimulált foszfoprotein (VASP) foszforilációjával, amely a PKA és a PKG jól jellemzett szubsztrátja, azt találták, hogy a PDE5 foszforilációjának időbeli lefolyása hasonló a VASP-éhoz.Kimutatták, hogy a PKG aktiválása után a teljes PDE5 25-30%-a foszforilálódott, és az immunprecipitált PDE5 2-2,5-szer nagyobb aktivitást mutatott, mint a nem foszforilált alapforma, ha 1 μmol/L cGMP szubsztrát koncentráció mellett vizsgálták.

3. ábra. Intakt sejtekben a PKG aktiválása, de nem a PKA, PDE5 foszforilációhoz vezet. A, 1 mmol/l 8-Br-cGMP-t adtunk a tenyésztett humán méh simaizomsejtekhez, és a sejteket különböző időpontokban gyűjtöttük össze a 8-Br-cGMP hozzáadása után. A foszfo-PDE5 felhalmozódást Western blot analízissel detektáltuk foszfo-specifikus PDE5 antitest alkalmazásával. A VASP PKG-preferált helyének, a 239-es szerinnek a foszforilációját monoklonális foszfo-szerin 239-specifikus VASP antitest alkalmazásával detektáltuk. B, A kontroll egerekből származó egér aorta simaizomsejteket (+/+) és PKG I-hiányos egereket (-/-) 1 mmol/l 8-Br-cGMP-vel (1), 1 mmol/l 8-Br-vel inkubáltunk. cAMP (2), vagy mindkettő (3) 30 és 60 percig. A foszfo-PDE5 felhalmozódást Western blot analízissel detektáltuk foszfo-specifikus PDE5 antitest alkalmazásával. A Rybalkin SD, Rybalkina IG, Feil R, Hofmann F, Beavo JA alapján készült. A cGMP-specifikus foszfodiészteráz (PDE5) foszforilációjának szabályozása simaizomsejtekben. J Biol Chem. 2002277:3310–3317.

Az intakt SMC-kben a PDE5-re vonatkozó proteinkináz-specifitással kapcsolatos kérdés megválaszolásához a PKG I génben megzavart egerekből származó aorta SMC-ket használtunk. A PKG I -/- sejtek 8-Br-cGMP-vel történő inkubálása nem eredményezte a PDE5 foszforilációját, míg a PKG I +/+ sejtekben a PDE5 jelentős foszforilációja volt megfigyelhető (3B. ábra). A 8-Br-cAMP önmagában vagy a 8-Br-cAMP és 8-Br-cGMP kombinációja nem stimulálta a PDE5 foszforilációját a PKG I -/- aorta SMC-kben. Ezek a kísérletek egyértelmű bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a PDE5 foszforilációja in vivo túlnyomórészt a cGMP/PKG I-en keresztül, és nem a cAMP/PKA útvonalon keresztül történik. 29

A kapcsolódó vizsgálatokban a PDE5-ről kimutatták, hogy a cGMP jelátvitel fontos szabályozója a vérlemezkékben. Ezekben a sejtekben NO donorok, mint a GSNO (S-nitrozoglutation) rendkívül gyors növekedést produkálnak, majd gyorsan csökken az intracelluláris cGMP. A PDE5 aktivitás és a foszforiláció időfüggő változása korrelált ezzel a gyors hanyatlással, bár a guanilil-cikláz deszenzitizációját nem figyelték meg. 30

A cGMP kötődés a GAF tartományhoz közvetlenül aktiválja a PDE5 katalitikus aktivitást

Mivel a cGMP kötődése a PDE2-höz aktiválja annak katalitikus aktivitását31, felmerült a kérdés, hogy a cGMP kötődése a PDE5 GAF doménjéhez hasonló aktivációt okoz-e vagy sem. Bár gyanús volt, évekig nem találtak bizonyítékot az elképzelés alátámasztására.

Ennek a problémának az egyik megközelítése a cGMP fluoreszcens analógját (Ant-cGMP-2′-) alkalmazta.O-antraniloil cGMP), amely gyengén kötődött a GAF doménhez, de megfelelő szubsztrát volt a katalitikus domén számára. 32 A katalitikus aktivitás cGMP-kötődés általi aktiválását azonban nem mutatták ki közvetlenül.

A közelmúltban egy rekombináns PDE5-öt használó vizsgálatban a cGMP-nek a szabályozó GAF A doménhez való kötődése utáni közvetlen PDE5 aktivációról számoltak be. Amikor a PDE5-öt előinkubáltuk cGMP-vel, a PDE5 nagymértékű (akár 10-szeres), időfüggő aktiválódását figyelték meg (4A. ábra). 33 A PDE5 újraaktiválható egy másik részlet cGMP hozzáadása után is az előinkubációs keverékhez. A cGMP által kiváltott PDE5 aktiváció akkor volt a legmagasabb, amikor a PDE5 aktivitást 0,1 μmol/L cGMP-vel (9-11-szer) határozták meg. 1,0 μmol/L cGMP-nél a PDE5 aktiválása csak 2-3-szoros volt, 10 μmol/L cGMP-nél pedig nem észleltek aktivációt (4B. ábra). A PDE5 megfigyelt aktiválása nem a PDE5 foszforilációjának eredménye, mivel a foszforilációs hely (92-es szerin) alaninná történő mutációja nem változtatta meg a cGMP általi PDE5 aktiváció mintáját.

4. ábra. Az A, a PDE5 közvetlenül aktiválódik a cGMP-nek a PDE5 GAF A doménjéhez való kötésével. HEK 293 sejtekben expresszált egér rekombináns PDE5-öt előinkubáltuk 50 μmol/L cGMP-vel jégen (töltött háromszögek), majd megfelelő hígítások után a PDE5 aktivitást 0,1 μmol/L cGMP-vel 5 percig 30°C-on mértük. További 50 μmol/L cGMP-t adtunk az előinkubációs keverékhez 60 perccel az előinkubáció megkezdése után, ahogy azt egy nyíl jelzi (nyitott háromszögek). A PDE5 aktivitást pmol · min −1 · μg −1 fehérjeként fejeztük ki. B, A PDE5 mAb/P3B2-vel történő előkezelése blokkolja a cGMP által kiváltott PDE5 aktivációt és csökkenti az alap PDE5 aktivitást. A PDE5 aktivitást 0,1 μmol/L, 1,0 μmol/L vagy 10 μmol/L cGMP-nél mértük. A mintákat kezelés nélkül (kontroll) vagy jégen 50 μmol/L cGMP-vel (+cGMP), vagy mAb/P3B2-vel 30 percig jégen (+mAb/P3B2) vagy mAb/P3B2-vel végzett előinkubálás után analizáltuk. 30 percig, majd 50 μmol/L cGMP-vel (+mAb/P3B2+cGMP). A PDE5 aktivitást a kontroll százalékában fejeztük ki, és a kontroll (nem stimulált) PDE5 aktivitást 100%-ban határoztuk meg. A Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA alapján készült. A PDE5 aktivált állapotba kerül, amikor a cGMP a GAF A doménhez kötődik. EMBO J. 200322:469–478.

Annak igazolására, hogy a PDE5 aktiváció hatása a cGMP cGMP-kötő helyek közvetlen hatásának tulajdonítható-e, egy egér monoklonális antitest (mAb/P3B2), amelyet a PDE5 GAF doménje ellen termeltek, úgy találták, hogy képes lényegében blokkolni. cGMP kötődik a PDE5 GAF A doménjéhez. Amikor ezt a cGMP-blokkoló monoklonális antitestet a cGMP előinkubáció előtt alkalmaztuk, teljesen megakadályozta a PDE5 aktiválódását, és nagymértékben csökkentette a PDE5 hidrolitikus aktivitását (4B. ábra). Ezek az adatok erősen jelzik, hogy a GAF doménjéhez kötött cGMP nagymértékben stimuláló hatást fejt ki a PDE5 katalitikus doménre, és ilyen hatás nélkül a PDE5 csak nagyon alacsony belső hidrolitikus aktivitással rendelkezik.

A cGMP kötődése szükségesnek és elegendőnek tűnik a PDE5 teljes aktiválásához, mivel az aktivált PDE5 in vitro foszforilációja nem mutatott további aktivációt. Ismeretes, hogy a cGMP kötődése a GAF doménhez szükséges a PKG általi foszforilációhoz, és hogy a foszforiláció növeli a látszólagos affinitást a cGMP-kötéshez. 27 Ezért úgy tűnik, hogy a PDE5 foszforilációja valójában in vivo stabilizálja az enzim cGMP-hez kötött, aktivált állapotát. Valószínűleg ez magyarázza, hogy a legtöbb tanulmány miért mutat kétszeres vagy kisebb aktiválást, ha 1 μmol/L szubsztrát mellett vizsgálják. Továbbá, mivel a PDE5 a PKG szelektív szubsztrátja, a PDE5 foszforilációs állapota, amely pozitívan korrelál a PKG aktivitás változásaival, in vivo specifikus markerként használható a PKG aktiválásához olyan szövetekben, mint a simaizom, a vérlemezkék és a kisagy. amelyek PKG-t és PDE5-öt is tartalmaznak.

Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy a PDE5 legalább két különböző konformációs állapotban létezhet in vivo: nem aktivált és a cGMP-kötés hatására aktiválódik (5. ábra). A nem aktivált PDE5 alacsony belső katalitikus aktivitású állapotban van, amely reverzibilisen aktivált állapotba konvertálható a cGMP megkötésekor. A PDE5 reverzibilis konformációs állapotai eltérő kinetikai és gátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Például a cGMP-aktivált PDE5 nagyobb érzékenységet mutatott a PDE5-specifikus inhibitor szildenafil iránt, mint a nem aktivált PDE5. Az IC50 A szildenafil-gátlás 2,1-ről 0,63 nmol/l-re csökkent, amikor a PDE5 aktivitást 0,1 μmol/l cGMP szubsztrátkoncentráció mellett határozták meg.

5. ábra. A PDE5 közvetlenül aktiválódik, amikor a cGMP kötődik GAF A doménjéhez. A cGMP-hez kötött PDE5 nem aktivált állapotban van. A PDE5 aktivált állapotba kerül, miután a cGMP a GAF A doménhez kötődik. A PKG csak az aktivált PDE5-öt foszforilálja. A Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA alapján készült. A PDE5 aktivált állapotba kerül, amikor a cGMP a GAF A doménhez kötődik. EMBO J. 200322:469–478.

A közelmúltban kimutatták, hogy a cGMP kötődése a cGMP-kötő helyekhez növelheti a3H-szildenafil kötődését a katalitikus helyhez. 34 3H-szildenafil kicserélődési disszociációs módszerrel két KD értéket (12 és 0,83 nmol/L) találtunk, ami arra utal, hogy a PDE5 katalitikus hely két „konformere” létezik.

Érdekes módon azt is megállapították, hogy a PDE5 azon képessége, hogy a cGMP-vel közvetlenül aktiválódjon, viszonylag friss készítményekre korlátozódott. 33 A PDE5 fokozatosan elvesztette válaszkészségét a cGMP stimulációra egy hét jégen való tárolás után. Annak ellenére, hogy ennek a változásnak a mechanizmusát nem határozták meg, ez a hatás valószínűleg megmagyarázza, hogy korábban miért nem számoltak be cGMP-indukált PDE5 aktivációról, mivel az izolálására hagyományosan többlépéses tisztítási protokollokat alkalmaztak. Azt, hogy a tárolás által aktivált PDE5 nem visszafordíthatatlan „mesterséges” vagy más konformációs állapotot jelent-e, még meg kell határozni.

A cGMP-indukált, PKG-független PDE5 aktivációról is beszámoltak PKG-hiányos vérlemezkékben. 35 Miután ezekhez a sejtekhez 500 μmol/L cGMP-t adtunk, a PDE5 aktivitás 1,0 µmol/L cGMP-vel mérve körülbelül 2,5-szeresére nőtt. Hasonló szintű PDE5 aktivációt (2,9-szeres) figyeltünk meg a kontroll mintákban, ahol a PDE5 PKG foszforilált. Érdekes módon a cGMP felhalmozódásának kinetikája a 300 μmol/L GSNO-val kezelt PKG I hiányos vérlemezkékben ugyanaz volt, mint a vad típusú egerek vérlemezkéiben, azaz a cGMP nagyon gyors 5 másodperces emelkedése, majd a cGMP teljes eltűnése. 15 másodpercen belül. Míg a kontroll vérlemezkékben a PDE5 lényegében foszforilált, addig a PKG -/- egerek vérlemezkéiben a PDE5 csak kismértékben foszforilált, valószínűleg PKA.

A GAF a PDE5 tartománya az új gyógyszerfejlesztés valószínű célpontja?

Az összes eddig leírt PDE5 inhibitort kompetitív inhibitorként fejlesztették ki az aktív helyen. Az a tény, hogy a cGMP kötődése a PDE5 GAF doménjéhez aktiválást okozhat, arra utal, hogy mind a PDE5-aktivitás antagonistái, mind agonistái kifejleszthetők az ehhez a helyhez való kötődés alapján. Mivel az összes PDE katalitikus doménjében nagymértékű szekvencia-hasonlóság van, a legtöbb inhibitor szelektivitási profilja legalább részben átfedi egymást. Például a zaprinast, egy ismert PDE5 katalitikus hely antagonista, szintén viszonylag jó inhibitora a PDE1-eknek. Minél nagyobb a homológia a PDE-k között, annál nagyobb a valószínűsége, hogy ugyanazokat az inhibitorokat kötik. Emiatt sok PDE5 inhibitor egyben PDE6 inhibitor is. Még a szildenafil is, amely a PDE5 egyik legspecifikusabb inhibitora, még mindig képes gátolni a PDE6 fotoreceptort nmol/l koncentrációtartományban. Valószínű, hogy ez a gátlás megmagyarázhatja azokat a vizuális mellékhatásokat, amelyeket egyes betegek jelentenek a szildenafil klinikai alkalmazása után. 8 A tadalafil, egy újabb PDE5-inhibitor, sokkal specifikusabb a PDE5-re, mint a PDE6-ra, de viszonylag jó PDE11-gátló, IC-vel.50 37 nmol/l. Az egyik legújabb PDE5 szelektív inhibitor, a vardenafil IC-vel rendelkezik50 162 nmol/l PDE11 gátlásra. A szildenafil IC-vel gátolja a PDE11-et50 2730 nmol/l. 17

Ezért a cGMP PDE5 GAF A doménjéhez (cGMP antagonisták) való kötődésének egyik lehetséges előnye a katalitikus hely antagonistákkal elérttől eltérő szelektivitásprofil lehet. Fordítva, egy cGMP-kötőhely agonista is lehetséges. Egy ilyen szer várhatóan nagyon alacsonyan tartja az intracelluláris cGMP-szintet. Ez előnyös lehet például neuronális excitotoxicitás vagy ischaemiával és reperfúzióval kapcsolatos toxicitás kezelésében.

PDE1: Kalmodulin-stimulált ciklikus nukleotid foszfodiészterázok

PDE1 illesztési változatok és tartományszervezés

A Ca 2+ /calmodulin-stimulált PDE-k (CaM-PDE-k) enzimek nagy családját alkotják, amelyeket három gén kódol, a PDE1A, PDE1B és PDE1C. 36 Minden génen belül több amino- vagy karboxi-terminális splice variánst azonosítottak. A CaM-PDE-k két Ca 2+/calmodulin kötődomént tartalmaznak, és ezeknek a PDE-knek a teljes aktiválásához mind a Ca 2+, mind a kalmodulin kötődése szükséges. A Ca 2+ /CaM általi aktiválás mértéke 3-10-szeres vagy még magasabb is lehet, az enzimkészítmény forrásától, szövetétől és tisztaságától függően. In vitro a PDE1-ek nem stimulált alapállapotát a Ca 2+ Ca 2+ kelátképzővel (pl. EGTA) történő eltávolításával érjük el.

A CaM-PDE-k képesek a cGMP-t és a cAMP-t is hidrolizálni, de a szubsztrátspecifitás eltérő a különböző génekben. A PDE1A és a PDE1B azonos nagy affinitást mutat a cGMP-vel szemben, de eltérő és kisebb affinitást mutat a cAMP-hez. A PDE1B affinitása a cAMP-hez nagyobb, mint a PDE1A-é. A PDE1C abban különbözik a PDE1A-tól és a PDE1B-től, hogy egyformán jól hidrolizálja a cGMP-t és a cAMP-t. Az azonos géncsaládból származó splice variánsok hasonló szubsztrát-jellemzőket tartanak fenn. Mindazonáltal az amino-terminális végének eltéréseiről azt találták, hogy mélyreható hatást gyakorolnak a kalmodulin azon képességére, hogy PDE1 aktivációt indukáljon. Például a szarvasmarha PDE1A1 és PDE1A2 fehérjeszekvenciája azonos, kivéve a nagyon N-terminális 18 aminosavat, de a PDE1A1 kalmodulin általi aktiválásának fele 0,1 nmol/l, míg a PDE1A2 esetében ez 10-szer magasabb. 37

PDE1A és nitrát tolerancia

A Ca 2+ /CaM által stimulált PDE enzimaktivitásról korábban kimutatták, hogy fontos a vaszkuláris cGMP-szintek és reaktivitás szabályozásában (2. ábra). 38 A legtöbb érszűkítő, mint például a noradrenalin (NE), az angiotenzin II (Ang II) és az endothelin-1 (ET-1) növeli az intracelluláris Ca 2+ -t, amelyről úgy gondolják, hogy az érösszehúzó szerek által közvetített simaizom-összehúzódás fő mechanizmusa. Ennek megfelelően egy Ca 2+ /CaM-stimulált PDE-t találtunk a fő enzimnek, amely felelős a cGMP hidrolíziséért érszűkítőkkel, például NE-vel stimulált nyúl aortában. 39 A PDE1A1 aktiválódását a Ca 2+ -koncentráció növekedésével igazolták tenyésztett patkány aorta SMC-kben. Például azt találták, hogy az Ang II stimulálja a PDE1A1 aktivitást patkány aorta SMC-ben, valószínűleg a Ca 2+ koncentráció Ang II által közvetített növekedésén keresztül. 40 A PDE1A1 gátlása blokkolta az ANP által kiváltott cGMP felhalmozódás Ang II által közvetített gyengülését, ami arra utal, hogy a PDE1A1 közvetíti az Ang II gátló hatását a cGMP felhalmozódásra.

A PDE1A1 és PDE5A1 Ca 2+ és cGMP általi gyors alloszterikus szabályozása mellett a PDE1A1 és 5A1 hosszabb távú expressziós szintjét különféle farmakológiai reagensek vagy patofiziológiai beállítások szabályozzák. Például a PDE1A1 enzimaktivitás, a fehérjeszint és az mRNS expresszió szelektíven felszabályozott a krónikus nitroglicerin (NTG) kezelés által kiváltott nitráttoleráns patkánymodellben. A 40 NTG továbbra is az egyik legfontosabb gyógyszer a stabil és instabil angina pectoris kezelésében. 41 Akut beadás esetén az NTG erős értágító képességgel rendelkezik az artériákon, vénákon és koszorúér kollaterális ereken. Az NTG krónikus beadása azonban korlátozott a nitráttolerancia gyors fejlődése miatt. 42,43 Számos mechanizmust javasoltak ennek a jelenségnek a magyarázatára, mint például a neurohormonális ellenszabályozás (úgynevezett pszeudotolerancia), 44 vagy magára az érszövetre jellemző mechanizmusok, mint például az intracelluláris SH-csoport kimerülése, az oldható guanilil-cikláz (sGC) deszenzitizálása. ), 45 a reaktív oxigénfajták vaszkuláris termelésének növekedése, 46 vagy a PDE aktivitás növekedése (úgynevezett valódi vaszkuláris tolerancia). 47 A krónikus NTG-kezelésről kimutatták, hogy az érösszehúzó szerek, például a katekolaminok, az Ang II, a KCl és a szerotonin iránti érzékenység megnövekedett 48, amelyek mindegyike veszélyeztetheti az NTG értágító kapacitását, és ezáltal hozzájárul a tolerancia kialakulásához.

Az NTG NO felszabadításával érrelaxációt vált ki. A NO aktiválhatja az sGC-t és növelheti a szöveti cGMP szintjét. 49 Amint azt korábban leírtuk, a cGMP viszont aktiválja a PKG-t, amelyről kimutatták, hogy a kontraktilitást szabályozó fehérjék foszforilációján keresztül közvetíti az érrelaxációt. Függetlenül a tolerancia mechanizmusától, úgy tűnik, hogy ez nem csak a későbbi nitrátexpozíció hatására csökkenő cGMP-emelkedéssel jár, hanem az érösszehúzó szerekre, például az NE-re adott válaszként is. 45 Érdekes módon a csökkent intracelluláris cGMP szint funkcionális következményei jól magyarázzák mind a tolerancia hátterében megfigyelhető jelenséget, mint az NTG-re való csökkent érzékenységet, mind az érszűkítőkkel szembeni fokozott érzékenységet. Így, amint azt korábban említettük, a Ca 2+ /CaM-stimulált PDE1A1 aktivitása és expressziója szelektíven indukálódott patkány aortában, amelyet 3 napig kezeltek klinikailag releváns dózissal (10 μg · kg -1 · min -1 ) NTG. 40 A PDE inhibitor vinpocetin részben helyreállította a toleráns érrendszer érzékenységét a későbbi NTG expozícióra. Az érrendszerben a PDE1A1 elsősorban az SMC-kben van jelen. Ezért az NTG-kezelést követően a PDE1A1 expressziójában bekövetkező változások az intakt aortában nagy valószínűséggel az SMC-kben fordulnak elő. A nitráttoleráns erekben az NE iránti érzékenység növekedését az NE nagyobb cGMP-csökkentő hatása okozta a nitráttoleráns erekben. 45 Ezek a megfigyelések együttesen erősen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a PDE1A1 indukciója a nitráttoleráns erekben lehet az egyik olyan mechanizmus, amellyel a NO/cGMP által közvetített értágulat deszenzitizálódik és a Ca 2+ által közvetített érszűkület szenzitizálódik. A PDE1A1 expresszió és/vagy aktivitás szelektív gátlása ezért új terápiás megközelítés lehet a nitráttolerancia korlátozására.

Végül tenyésztett patkány SMC-kben az Ang II kezelés gyorsan és átmenetileg felszabályozza mind a PDE1A1, mind a PDE5A1 mRNS expresszióját, amit megnövekedett fehérjeszint és enzimaktivitás követ. 51 A PDE1A1 és PDE5A1 expresszió Ang II szabályozásának molekuláris mechanizmusa nagyon hasonlónak tűnik a közvetlen korai génhez, a c-foshoz. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a PDE1A1 és PDE5A1 mRNS expressziójának megváltoztatása fontos mechanizmus a cGMP-hidrolizáló aktivitás szabályozásában az érrendszeri SMC-kben fiziológiás és patológiás körülmények között. Azonban, amint azt a következő részben tárgyaljuk, az emberi és nem emberi (például patkány vagy majom) SMC-k eltérő PDE expressziós profillal rendelkeznek. Ezért, mivel a nitráttoleráns modellek többnyire nem humán szövetekkel végzett kísérleteken alapulnak, emberi erekben vizsgálatokat kell végezni.

PDE1C és az emberi artériás sima izomsejtek szaporodása
A PDE1C indukálódik az emberi SMC-k proliferációjában

Amint azt korábban említettük, az összes PDE1 izoforma, a PDE1A, PDE1B és PDE1C expresszálódhat az artériás SMC-kben, különböző körülmények között és különböző fajokban. Úgy tűnik azonban, hogy a PDE1A és PDE1B expresszióját nem szabályozza az SMC-k proliferatív állapota. 52 Ez a rész a PDE1C-re fog összpontosítani, egy olyan izoformára, amelyet a Ca 2+ /calmodulin aktivál, mint az összes többi PDE1-et, de a PDE1A-val és a PDE1B-vel ellentétben képes a cGMP-t és a cAMP-t is azonos hatékonysággal hidrolizálni. 53

Felnőtt vagy újszülött donorok ép mellkasi aortájának simaizomzata nem expresszál PDE1C-t. 52 Ezzel szemben a PDE1C nagymértékben expresszálódik az ép humán magzati aorta simaizmában, amely bőségesen tartalmaz proliferáló sejteket, a proliferáló sejtmagi antigén expressziójával mérve (2. ábra).54 Ezen túlmenően, a PDE1C expressziója és aktivitása jelentős indukciót mutat az emberi felnőtt és újszülött aorta SMC-kben, amelyeket a tenyészetben proliferációra serkentettek. 52 Így, az érintetlen felnőtt vagy újszülött emberi aortával szemben, az SMC-k tenyésztésekor és HPLC-vel történő elemzésekor a PDE1C magas aktivitását figyelték meg (6A. ábra). Ahogy az várható volt, a PDE1C hidrolizálja a cGMP-t és a cAMP-t is Ca 2+/calmodulin jelenlétében (a 6A. ábrán szilárd szimbólumokkal jelölve), és a PDE1C fehérjét a rekombináns PDE1C C-terminálisa ellen termelt antitestek ismerik fel (6A. ábra). de nem a PDE1A vagy PDE1B elleni antitestekkel. A tenyészetben proliferatív humán SMC-kben indukált PDE1C a teljes cGMP-hidrolizáló aktivitás 85%-át és a teljes cAMP-hidrolizáló aktivitás 80%-át teszi ki (alacsony szubsztrátkoncentráció mellett) Ca 2+/calmodulin jelenlétében. Palmer és Maurice nemrégiben megerősítette a magas PDE1C aktivitás jelenlétét tenyésztett humán aorta SMC-kben. 55 Bőséges PDE1C aktivitást találtak a carotis artériából izolált tenyésztett humán SMC-kben és számos, különböző simaizom-tartalmú szervekből származó humán proliferáló SMC-ben is, ami azt mutatja, hogy a PDE1C indukció nem korlátozódik a tenyésztett aorta SMC-kre. 52

6. ábra. A humán és majom SMC-k különböző PDE-expressziós mintázattal rendelkeznek: a PDE1C indukálódik humán SMC-ben az elsődleges tenyészetben, de nem indukálódik a majom SMC-kben. A PDE aktivitás nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elúciós profilja emberi (A) és majom (B) aorta SMC-kből származó Ca 2+ /calmodulin hiányában vagy jelenlétében primer tenyészetben. A PDE aktivitást minden frakcióban vagy 1 μmol/L cAMP-vel (háromszögek) vagy 1 μmol/L cGMP-vel (négyzetek) határoztuk meg Ca 2+ nélkül (1 mmol/L EDTA nyitott szimbólumok jelenlétében), vagy 1 mmol/L CaCl-tal.2 és 4 μg/mL kalmodulint (töltött szimbólumok). A PDE1A, PDE1B, PDE1C és PDE5 kimutatható sávjait tartalmazó immunblotok a megfelelő kromatográfiás frakcióik felett láthatók. A Rybalkin SD, Bornfeldt KE, Sonnenburg WK, Rybalkina IG, Kwak KS, Hanson K, Krebs EG, Beavo JA alapján készült. A kalmodulin-stimulált ciklikus nukleotid-foszfodiészteráz (PDE1C) szintetikus, proliferatív fenotípusú humán artériás simaizomsejtekben indukálódik. J Clin Invest. 1997100:2611–2621.

A fenti vizsgálatok egyértelmű összefüggést mutattak ki egyrészt a PDE1C expressziójának és aktivitásának indukciója, valamint a magzati aortában lévő humán SMC-k proliferációs képessége és a tenyésztett humán SMC-k között. Annak további igazolására, hogy a PDE1C expresszióját a sejt proliferatív állapota szabályozza, humán SMC-ket helyeztünk I. típusú fibrilláris kollagénre. Ez a típusú kollagén az SMC-k 56 teljes növekedését és az ép aortában található SMC-ekhez hasonló fenotípust eredményez. 57 Azzal a hipotézissel összhangban, hogy a PDE1C expresszióját a proliferatív állapot szabályozza, az I. típusú fibrilláris kollagénre szélesztett tenyésztett humán SMC-k PDE1C expressziója jelentősen csökkent. 54 Másrészt az alacsony szérumkörülményeknek kitett tenyésztett humán SMC-k nem csökkentik jelentős mértékben a PDE1C expresszióját. Érdekes módon az I-es típusú fibrilláris kollagén által kiváltott nyugalom kifejezettebb, mint a szérumelvonás által kiváltott nyugalom. Így a fibrilláris kollagénre helyezett sejteknek több időre van szükségük ahhoz, hogy belépjenek az S-fázisba a fibrilláris kollagénből való felszabadulás után, mint azokhoz a sejtekhez, amelyek korábban nem voltak kitéve fibrilláris kollagénnek. Valószínű, hogy a kollagén fibrilláris szerkezete azt eredményezi, hogy a sejtek kilépnek a sejtciklusból (a legtöbb sejt G-ben lenne0), míg a szérum megvonása G1 letartóztatás. Így a PDE1C expressziója először leszabályozódik, amikor az SMC kilép a sejtciklusból G-be0.

Végül egyértelmű összefüggés van a DNS-szintézis indukálásához szükséges idő és a PDE1C-expresszió indukciója között az I-es típusú fibrilláris kollagénből felszabaduló és szérum jelenlétében szövettenyésztő műanyagra visszahelyezett SMC-kben (7A. ábra). Ezek a kísérletek együttesen azt mutatják, hogy a PDE1C expressziója nem csak az SMC-k sejtciklusba való belépésekor fokozódik, hanem le is szabályozódik, amikor sejtnyugalom indukálódik, és azt sugallják, hogy a teljes nyugalmi állapot vagy az SMC-k kilépése a sejtciklusból a G-be.0 szükséges a PDE1C expresszió csökkentéséhez.

7. ábra. A, a PDE1C indukció korrelál a sejtciklus progressziójával. Az immortalizált humán aorta SMC-ket (FLTR sejteket) fibrilláris kollagénre szélesztettük 2 napra. A sejteket ezután bevonat nélküli, 24 lyukú tálcákra 10% FBS jelenlétében újralemeztük. A DNS-szintézist a [3H]timidin beépüléseként mértük, és a három párhuzamos minta átlag±SD-jeként fejeztük ki. A PDE1C expressziót duplikált mintákban Western blot analízissel mértük. B, A PDE1C antiszensz oligonukleotidok gátolják az SMC proliferációt. Az alap PDE1C expresszió csökkentésére 2 napra fibrilláris kollagénre szélesztett FLTR sejteket PDE1C antiszensz vagy kontroll (fordított) oligonukleotidokkal kezeltük. A PDE1C expressziót Western blot analízissel mértük sejtekben, mielőtt újraterjesztettük (kontroll), vagy sejteket 3 napig újralemeztünk bevonat nélküli lemezeken. A PDE1C antiszensz oligonukleotidokkal vagy kontroll oligonukleotidokkal (fordított) kezelt sejteket is megszámoltuk. A kontrollt (sejtek fibrilláris kollagénen) 100%-ra állítottuk. Átdolgozva: Rybalkin SD, Rybalkina I, Beavo JA, Bornfeldt KE. A ciklikus nukleotid-foszfodiészteráz 1C elősegíti az emberi artériás simaizomsejtek proliferációját. Circ Res. 200290:151–157.

A PDE1C szabályozza az emberi SMC-k elterjedését

A fent leírt vizsgálatok azt mutatják, hogy a PDE1C expresszióját jelentősen szabályozza a sejtciklus a humán SMC-kben. Ez azt jelenti, hogy a PDE1C indukciója szükséges a sejtciklus progressziójához és a sejtproliferációhoz? Jelenleg két módszer áll rendelkezésre ennek a kérdésnek a megválaszolására: a PDE1C aktivitás gátlása farmakológiai inhibitorokkal és a PDE1C expresszió csökkentése PDE1C antiszensz vagy RNS interferencia technikákkal. A specifikus PDE izoformák eltérően reagálnak a farmakológiai inhibitorokra. 53 Mivel azonban nem álltak rendelkezésre specifikus PDE1C inhibitorok, a PDE1C aktivitás gátlására 8-metoximetil-3-izobutil-1-metil-xantint (8MM-IBMX) alkalmaztak 10-30 μmol/L koncentrációban. A tenyésztett humán SMC-k kezelése 8MM-IBMX-szel a DNS-szintézis jelentős csökkenését eredményezte. 54 A 8MM-IBMX ezen hatásai valószínűleg a PDE1C gátlásnak tulajdoníthatók, mivel ugyanazok a koncentrációk nem gátolják szignifikánsan a többi cAMP PDE-t (PDE3 és PDE4). Ezenkívül a 8MM-IBMX hatásait nem utánozták a PDE5 inhibitorok. A PDE1C szabályozó szerepének további igazolására a humán SMC proliferációban PDE1C antiszensz vizsgálatokat végeztünk. A PDE1C antiszensz oligonukleotidokkal végzett kezelés a PDE1C csökkent expresszióját eredményezte anélkül, hogy befolyásolta volna a PDE5 expresszióját, és jelentősen gátolta az SMC proliferációt (7B. ábra). Ezek az eredmények együttesen erősen azt sugallják, hogy a PDE1C indukciója elősegíti a humán artériás SMC-k proliferációját, és ennek előfordulásához szükség lehet.

A PDE1C SMC proliferációra gyakorolt ​​hatását a cAMP vagy a cGMP, vagy mindkettő hidrolízise közvetíti? Úgy gondolják, hogy in vivo az SMC-k az endotélium által felszabaduló cAMP- és cGMP-emelő anyagok hatásának vannak kitéve. Prosztaciklin (OFJ2) egy példa az endotéliumból felszabaduló cAMP-indukáló ágensekre, míg az NO legalább részben a cGMP-szintek emelésével hat a célsejtekben (2. ábra). Mind a cGMP, mind a cAMP ismert, hogy gátolja az SMC proliferációt in vitro és in vivo. 58 Ennek megfelelően a humán SMC proliferáció gátolható olyan farmakológiai inhibitorokkal, amelyek szelektívek a cAMP-t hidrolizáló PDE-kre vagy a cGMP-t hidrolizáló PDE-kre. 54 A cGMP hatása az SMC proliferációra összetettebbnek tűnik, mint a cAMP-é. 59,60 A 8-Br-cAMP (a PDE által közvetített hidrolízissel szemben részben rezisztens cAMP analóg) által indukált sejtciklus-átmenet teljes elnyomásával ellentétben a 8-Br-cGMP késlelteti, de nem blokkolja a G-t.1-S átmenet humán újszülött köldökartéria SMC-ben. 60 Ezek a sejtek PKA-t és PKG-t is expresszálnak, amelyek a cAMP és cGMP jelátvitel effektorai. Így a cAMP és a cGMP által szabályozott molekuláris útvonalak eltérőek lehetnek. Ezt az elképzelést tovább támasztották azok az eredmények, amelyek szerint mind a 8-Br-cAMP, mind a 8-Br-cGMP teljesen elnyomja a vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF) által stimulált cdk4 aktivitást, de csak a 8-Br-cAMP eredményezte a cdk indukcióját. A p27 Kip1 inhibitor és a cdk2 aktiváció tartós elnyomása. 60 Alternatív megoldásként a 8-Br-cAMP és a 8-Br-cGMP különböző sebességgel hidrolizálódhat a humán köldökartéria SMC-iben expresszálódó PDE-k által, ami a 8-Br-cGMP átmenetibb hatását eredményezi, mint a 8-Br-cAMP. . Ebben az összefüggésben az is lényeges lehet, hogy a cAMP analógok és a PKA ezt követő aktiválása negatív visszacsatolást fejthet ki a PDE1C aktivitásra. 61

Humán SMC-kben a PDE1C gátlása mind a cAMP, mind a cGMP szintjének emelkedését eredményezi, 54 amint az a PDE1C enzimatikus jellemzői alapján várható lenne. Valójában a cAMP és a cGMP hatásai nem mindig függetlenek egymástól. Például egy közelmúltbeli tanulmány azt mutatja, hogy a PDE5 inhibitorok csökkentik a szarvasmarha koszorúér SMC-k proliferációját a cGMP emelkedése és a PDE3, a cGMP-vel gátolható cAMP-hidrolizáló PDE gátlása révén. 62 Ezen a mechanizmuson keresztül a cGMP megnövekedett intracelluláris szintje a cAMP-szintek emelkedését eredményezheti (lásd a PDE3-ról szóló részt). A PDE1C SMC proliferációra gyakorolt ​​hatása ezért mind a cGMP, mind a cAMP hidrolízisének köszönhető.

Miért indukálódik a PDE1C az emberi SMC-k elszaporodásakor, de nem a más fajok SMC-iben?

A mai napig kimutatható PDE1C aktivitást csak proliferáló humán SMC-kben figyeltek meg, és furcsa módon nem humán főemlősök (pigtail majom, Macaca nemestrinaés pávián), szarvasmarha SMC-k, sertés SMC-k, patkány SMC-k vagy juh SMC-k. 52,63 Másrészt ezek a fajok mindegyike expresszál PDE1A-t és/vagy PDE1B-t. Amint a 6B. ábra mutatja, a copfos majomból izolált proliferáló aorta SMC-k PDE-aktivitási profilja feltűnően különbözik az emberi aortából izolált SMC-kétől (6A. ábra). Mind a humán, mind a majom SMC-k PDE5-öt és PDE3/4-et expresszálnak, de míg a humán SMC-k PDE1C-t, addig a majom SMC-k PDE1B-t (6. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy jelentős különbségek vannak a PDE1C expressziójában és aktivitásában a különböző fajokból származó SMC-kben. Csak találgatni tudunk a PDE1C indukciójának okairól a proliferáló humán SMC-ben, szemben a más fajokból származó SMC-kkel. Lehetséges, hogy a humán SMC-knek kiterjedtebb és szabályozottabb cAMP- és cGMP-hidrolízisre van szükségük a sejtciklus progressziója során, mint sok más fajból származó SMC-nek. Az intracelluláris kalciumszint szigorúan szabályozott a sejtciklus progressziója során,64 és a PDE1C indukciója eszközül szolgálhat a mitogén kalcium jelátvitel koordinálására a cGMP és a cAMP növekedést gátló hatásának egyidejű csökkenésével. Függetlenül attól, hogy mi okozta a PDE1C indukcióját a proliferáló humán SMC-kben, különös gondossággal kell eljárni, amikor a szelektív PDE-inhibitorokkal állatkísérletekben kapott eredményeket extrapolálják az embereken végzett klinikai vizsgálatokra.

Tekintettel arra, hogy a PDE1C nyilvánvalóan kulcsfontosságú szerepet játszik az emberi simaizom-proliferáció szabályozásában, nem lenne meglepő, ha olyan terápiás szereket lehetne kifejleszteni, amelyek a PDE1C aktivitását célozzák. Az ilyen szerek várhatóan minimalizálják a túlzott simaizom-proliferatív választ, amely a ballonos angioplasztika vagy stentelés által okozott sérülésekre és gyulladásokra válaszul, és esetleg még magas vérnyomásra is reagál. Valószínűleg kevésbé mérgezőek is, mint sok jelenleg használt szer.

PDE3: cGMP-gátolt PDE

Mind a PDE3A, mind a 3B expresszálódik a legtöbb vaszkuláris simaizomágyban. Bár ezekben az érrendszerekben, vagy ami azt illeti, a szívsejtekben nem ők a cGMP hidrolízisének túlnyomó része, a PDE3-okat valószínűleg a cGMP szabályozza in vivo. A PDE3-nak nincs külön alloszterikus cGMP-kötő doménje, és a cGMP nem szabályozza őket ugyanúgy, mint a PDE-ket tartalmazó GAF-domént (PDE2 és PDE5). A PDE3 katalitikus helyek azonban hasonló nagy affinitást mutatnak a cAMP és cGMP iránt, de a V.max a cAMP esetében sokkal magasabb (4-10-szer), mint a cGMP esetében. Ezért az a mechanizmus, amellyel a cGMP gátolja a PDE3 katalitikus aktivitását, a cAMP-vel való versengés a katalitikus helyen. Így a cGMP átmeneti kapcsolóként működik, és gátolja a cAMP hidrolitikus aktivitását a PDE3 által, amíg maga hidrolizálódik.

PDE3 tartomány felépítése és funkciója

A PDE3 család két gént tartalmaz, a PDE3A-t és a PDE3B-t. Mindkettő doménszerveződése meglehetősen hasonló, és tartalmaz egy konzervált katalitikus domént, egy divergens N-terminális régiót a membrán asszociációs doménjével és egy C-terminális hidrofil véget (1. ábra). A PDE3A és a PDE3B a legtöbb homológiát a katalitikus doménben osztja meg, beleértve az egyedülálló 44 aminosavból álló inszerciót, amely nem található meg más családból származó PDE-k katalitikus doménjében. Ezek az izoformák azonban nagymértékben különböznek mind az N-terminális, mind a C-terminális végükön. 65 Különböző csonkolt PDE3 formák vizsgálata során kiderült, hogy az N-terminális vég nem szükséges a teljes katalitikus aktivitás és a PDE3 specifikus inhibitorokkal szembeni érzékenység fenntartásához, bár a lokalizáció szempontjából fontos lehet. 65

A két PDE3 izoforma eltérően expresszálódik. A PDE3A vaszkuláris simaizomzatban, vérlemezkékben, szívsejtekben és oocitákban expresszálódik. Patkány és humán vaszkuláris simaizomban mind a PDE3A, mind a PDE3B expresszálódik, de eltérő szubcelluláris lokalizációval rendelkeznek. 55,66 PDE3A-t leginkább az oldható frakcióban találtunk, míg a PDE3B-t a szemcsés frakciókban találtuk. A PDE3B erősen expresszálódik zsírsejtekben, hepatocitákban és spermatocitákban is. 67

Általában úgy gondolják, hogy a PDE3 főként cAMP által szabályozott folyamatokat közvetít, mint például a szívösszehúzódás, a vérlemezke-aggregáció, a simaizom relaxáció és a hormonális szabályozás. 67 Sokkal kevesebbet tudunk arról, hogy a PDE3 részt vesz a cGMP jelátvitel szabályozásában. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a cGMP-emelő szerek a PDE3 aktivitás gátlásával növelhetik a cAMP-szintet. Például a nyúl vérlemezke-aggregációjának NO által kiváltott gátlását részben a PDE3 gátlás eredményeként felhalmozódott cAMP okozta. 68 Azt is feltételezték, hogy humán pitvari myocytákban a NO-donorok stimuláló hatása a szív kalciumáramára a PDE3 aktivitásának cGMP gátlásának tulajdonítható. 69 A PDE3-ról a vese érrendszerére gyakorolt ​​NO-hatások fontos meghatározójaként is utaltak. 70

A PKG I-hiányos egereken végzett legújabb vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a NO-donorok nagy koncentrációja képes elegendő cGMP-t termelni ahhoz, hogy közvetlen PKA-aktivációt érjen el, míg az alacsony koncentrációjú cGMP simaizom-relaxációt indukált kizárólag a cGMP jelátviteli útvonalon keresztül. Ezért további vizsgálatokra van szükség annak meghatározására, hogy a cGMP milyen körülmények között fokozza a PKA aktivitását direkt aktiválással, szemben a PDE3 gátláson keresztüli közvetetten keresztül.

PDE3 és szív- és érrendszeri gyógyszerfejlesztés

A PDE3 inhibitorok első generációjáról (milrinon, vesnarinone, enoximon) jelentős értágító és inotróp hatást találtak in vitro és állatkísérletek során. 53 A kezdeti klinikai vizsgálatok során úgy vélték, hogy ezek az inhibitorok pozitív hatást fejtenek ki a krónikus pangásos szívelégtelenség kezelésében. 72 A milrinon orális adagolásának hosszú távú hatásai azonban a súlyos krónikus szívelégtelenségben szenvedő betegek morbiditásának és mortalitásának növekedését mutatták ki. 73 Bár nem ismert, hogy a megfelelő adagokat alkalmazták-e, vagy még csak a PDE3-gátlásnak köszönhető-e a kardiotoxikus hatás, ez a sikertelen klinikai vizsgálat további kihívást jelentett a PDE3-inhibitorok kifejlesztésében. Ezen eredmények ellenére a milrinon rövid távú klinikai alkalmazását jóváhagyták akut dekompenzált szívelégtelenségben szenvedő betegek kezelésére. 74 A milrinon-laktát intravénás injekciója (Primacor, Sanofi-Synthelabo Inc) jelentős, de időben erősen korlátozott klinikai hatást biztosít (legfeljebb 48 óra), és ezen betegek elektrokardiográfiás paramétereinek alapos megfigyelését igényli.

Egy másik PDE3-inhibitor, a cilostazol (Pletal, Otsuka America Pharmaceutical, Inc/Pharmacia Corporation) engedélyt kapott az intermittáló claudicatio kezelésére, amely érbetegség, amelyet lábfájdalom jellemez. 75 Ez a gyógyszer ismét ellenjavallt pangásos szívelégtelenségben szenvedő betegek számára. A PDE3-specifikus inhibitorok újabb generációinak valószínűleg szövet- vagy izoforma-specifitást kell bizonyítaniuk, aminek minimálisra kell csökkentenie a szívszövetre gyakorolt ​​​​hatásokat, hogy megfeleljenek a jóváhagyásnak.

Következtetések és perspektíva

Várhatóan a következő években sokkal többet megtudhatunk arról, hogy az egyes PDE izoenzimek milyen konkrét szerepet játszanak a simaizom működésében. Azt is meg kell tudnunk azonosítani, hogyan szabályozzák ezeknek a PDE-knek a transzkripcióját, milyen szerepet játszhatnak az újonnan felfedezett PDE-k (pl. PDE9), és különösen azt, hogy a különböző fajok hogyan használják a PDE-k különböző kombinációit saját maguk szabályozására. ciklikus nukleotid függő folyamatok. Teljesen lehetségesnek tűnik, hogy a „hagyományos” simaizom-PDE-gátlók, például a Viagra új felhasználási módjait azonosítják, és talán új gyógyszereket fejlesztenek ki, amelyek a PDE5 más helyeire vagy az érrendszeri simaizomzatban kifejeződő egyéb PDE-k aktív helyeire hatnak.

Eredeti átvétel: 2003. május 6., verzió átvétel: 2003. július 7., elfogadva 2003. július 8.

Ezt a munkát részben az American Heart Association washingtoni leányvállalata és az NIH HL62887 számú támogatása támogatta Karin E. Bornfeldtnek, az NIH DK21723 és HL44948 támogatást nyújtott Joseph A. Beavo-nak, valamint az American Heart Association 0030302T támogatása Chen Yannak. .


A Parkinson-kórral kapcsolatos klinikai vizsgálatok alatt álló gyógyszer erősíti az állatok szívösszehúzódásait

A Johns Hopkins Medicine kutatóinak korai állatkísérleteinek eredményei szerint a Parkinson-kór tüneteinek kezelésére jelenleg klinikai vizsgálatok alatt álló gyógyszer egy nap hasznos lehet a szívelégtelenség kezelésében.

A gyógyszer, amely a foszfodiészteráz (PDE) I-es típusú gátlók néven ismert vegyületcsoport tagja, ígéretes hatást fejt ki a kutya- és nyúlszívekre, valamint az izolált nyúlszívsejtekre, különösen a szívizom összehúzódásainak erejében. , mondják a kutatók.

Az emberi szívelégtelenség krónikus állapot, amelyet gyakran a szívizom gyengülése és az azt követő elégtelen vér pumpálása jellemez. Jelenleg több tucat gyógyszer áll rendelkezésre a szívelégtelenség tüneteinek kezelésére vagy kezelésére, de a szívizom összehúzódásainak erősségét javító gyógyszerek, mint például a dobutamin, veszélyes szövődmények, például szabálytalan szívverés kockázatával járnak.

A folyóiratban megjelent jelentésben leírt tanulmányukban azonban Keringés július 20-án a Johns Hopkins kutatói kimutatták, hogy az új vegyület a jelenlegi gyógyszerektől eltérően működik, ami arra utal, hogy használata biztonságosabb módja lehet a szív összehúzódási erejének növelésének.

A szívelégtelenség körülbelül 5,7 millió USA-t érint.A Centers for Disease Control and Prevention adatai szerint felnőtteknél, és becslések szerint kilencből egy halálesethez járul hozzá. A standard kezelés olyan diuretikumokat tartalmaz, amelyek növelik a vizelettermelést, hogy megakadályozzák a szív megnagyobbodását, angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) gátlók, amelyek csökkentik a vérnyomást és csökkentik a szív terhelését, valamint béta-blokkolók, amelyek megvédik a szívkárosodást az adrenalin stresszhormon magas szintjétől. amelyek gyakoriak a szívelégtelenségben, és segítenek csökkenteni a szív terhelését. Nincs gyógymód.

"Eredményeink azért érdekesek, mert ez idáig nagyrészt felderítetlen terület volt, hogy olyan módszert találjunk ki a kontraktilitás növelésére, amely végül nem okoz fájdalmat a betegeknek" - mondja David Kass, MD, Abraham és Virginia Weiss kardiológiai professzor a Johns Hopkins Egyetemen. Orvostudományi Iskola és a tanulmány vezető kutatója.

Az új tanulmányban feltárt gyógyszer, az ITI-214 gátolja a PDE1 enzimet, amely a több mint 100 ilyen fehérjét tartalmazó foszfodiészteráz (PDE) család része. Minden PDE úgy működik, hogy két molekula egyikét vagy mindkettőt lebontja: a cAMP-t és a cGMP-t, amelyek mindegyike molekuláris hírvivőként szolgál a sejtekben. Mindegyik PDE nagyon specifikus tulajdonságokkal rendelkezik, beleértve a cella típusát és a cellán belüli elhelyezkedését, lehetővé téve számukra a cAMP és/vagy cGMP nagyon precíz beállítását.

A PDE-inhibitorok a cAMP és a cGMP lebomlásának leállításával fejtik ki hatásukat, aminek következtében ezek a molekulák felhalmozódnak, így befolyásolhatják a fehérjéket a sejt megváltoztatására. Szívbetegségben a PDE aktivitás korlátozhatja a cAMP vagy cGMP jótékony hatásait, így az inhibitorok terápiaként is hathatnak.

Kass megjegyzi, hogy egereknél a PDE1-gátlókról beszámoltak arról, hogy a magas vérnyomás miatt abnormálisan vastag szívizmot zsugorítanak, és kitágítják az ereket. Az egerek szívében azonban többnyire más a PDE1 enzim, mint az emberben, ezért a PDE1 inhibitorok valószínűleg másképp hatnak az egerekre, mint az emberekre.

Kass szerint a kutyák és a nyulak, amelyekre ez a kutatás összpontosított, PDE1 összetétele jobban hasonlít az emberhez.

Kísérleteik során a kutatók hat kutyát használtak, akiket sebészi úton érzékelőkkel és szívritmus-szabályozóval szereltek fel, és tesztelték az ITI-214 hatásait a szívelégtelenség előidézése előtt és után a pacemaker gyors működtetésével körülbelül három hétig. A gyógyszert különböző dózisokban tesztelték, mind orálisan, mind intravénásan. A kutyáknak legalább egy napot adtak a vizsgálatok között.

Mogyoróvajjal bevont tablettán keresztül minden kilogrammonként 10 milligrammos orális adagban az ITI-214 az egészséges szívekben 50%-kal, a gyengélkedő szívekben pedig 32%-kal növelte a szív által percenként kipumpált vér mennyiségét. . Kass szerint ezt úgy tette, hogy csaknem 30 százalékkal növelte a szív összehúzódásainak erejét, és kitágította az ereket. A gyógyszer intravénás beadása hasonló, de gyorsabb hatásokat eredményezett.

"Eléggé agnosztikusak voltunk azzal kapcsolatban, hogy mit fogunk találni, és nem feltétlenül vártunk semmit ettől a regénytől" - mondja Kass. "Tudomásom szerint korábban egyetlen tanulmány sem számolt be a PDE1-gátlás következtében megnövekedett szívösszehúzódási erősségről. De akkor az összes korábbi tanulmányban, ahol ezt tesztelhették volna, egereket használtak, és tudtuk, hogy a nagyobb emlősökben más PDE1 formát találtak. és az emberek. Szóval csak ki kellett próbálnunk, és az eredmények nagyon érdekesek voltak."

Kass arra figyelmeztet, hogy egészséges kutyáknál a gyógyszer átlagosan körülbelül 40 ütéssel emelte meg a pulzusukat, ami veszélyes lehet a szívelégtelenségben szenvedő betegek számára. Mindazonáltal a szívelégtelenségben szenvedő kutyáknál nem volt szignifikáns különbség a szívverésben a gyógyszer beadása előtt és után.

Még ezeknél az ígéretes eredményeknél is komoly aggodalomra ad okot. A szívösszehúzódások erősítésére tervezett egyéb szívelégtelenség-gyógyszerek potenciálisan végzetes szövődményeket okozhatnak, például vadul szabálytalan szívverést. A másik PDE, a PDE3 gátlói, köztük az amrinon és a milrinon, különösen hírhedtek erről.

„Ez volt a gazember a szobában” – mondja Kass. "Az új gyógyszer ugyanazokat a szív- és artériás elváltozásokat idézte elő, mint a PDE3-gátlók, ezért természetesen aggódtunk, hogy hasonló módon működik-e, és esetleg szövődményei is lehetnek. Ezért egymás mellett teszteltük őket."

Amikor összehasonlították az ITI-214 és a PDE3 gátló hatását 13 nyúlszívből izolált izomsejtekben, a két gyógyszer hatásmódja eltérőnek tűnt.

A PDE3-gátlók hatásának egyik fő módja az, hogy növelik a kalcium mennyiségét az izomsejtben, ami arra készteti a kulcsfontosságú fehérjéket, hogy nagyobb erőt fejtsenek ki a sejten, és a sejt erősebben összehúzódik.

Ahogy az várható volt, amikor a kutatók PDE3 inhibitort alkalmaztak a szívsejteken, a kalciumszint megemelkedett, és a sejtek erősebben összehúzódtak, mint az inhibitor nélkül.

A PDE1 gátlása önmagában nem volt hatással az izomsejtekre, de a kutatók úgy gondolták, hogy ennek az az oka, hogy a PDE1 aktivitása túl alacsony egy nyugvó sejtben. Ezért egy gyógyszert használtak a cAMP-szint enyhe növelésére, és ez eléggé megnövelte a PDE1 aktivitást ahhoz, hogy megfigyelhessék az ITI-214 hatásait.

A hozzáadott gyógyszerrel az ITI-214 hatására a sejt erősebben összehúzódott. A sejt kalciumszintje azonban nem emelkedett, ami határozottan azt jelzi, hogy az ITI-214 más mechanizmuson keresztül fokozza az izomösszehúzódásokat, mint a PDE3 inhibitorok.

"Eredményeink azt mutatják, hogy a PDE1 gátlása más változásokat eredményez, mint a PDE3 gátlása, ezért reméljük, hogy meg tudjuk kerülni a kalcium által közvetített és potenciálisan halálos aritmiákat, amelyek a PDE3 inhibitorokat sújtják" - mondja Grace Kim, a vezető társszerző és posztdoktori ösztöndíjas. Kass laborjában. "Hasonló pozitív előnyökre számítunk a szívműködésben, de sokkal kisebb toxicitás mellett."

Kass szerint úgy tűnik, hogy az ITI-214 másként működik, mint a dobutamin, amely erősíti a szívösszehúzódásokat szívelégtelenségben szenvedőkben, de halálos szívritmuszavarokat is okozhat. A dobutamin a béta-adrenerg rendszer stimulálásával fejti ki hatását, ugyanazt a rendszert, amelyet az adrenalin aktivál. A dobutamin ugyanarra a hírvivő molekulára hat, amelyek növelik a PDE3 által lebontott cAMP-t, így szívre gyakorolt ​​hatása hasonló a PDE3 inhibitorokéhoz.

Amikor a kutatók blokkolták a béta-adrenerg receptorokat 11 egészséges, érzéstelenített nyúlban, majd az ITI-214-et alkalmazták, minden hatás – kivéve a pulzusszámra gyakorolt ​​hatását – megmaradt. Ha az ITI-214 a béta-adrenerg rendszeren keresztül hatna, a receptorok blokkolása blokkolnia kellett volna a hatását.

Ehelyett úgy tűnik, hogy a gyógyszer egy másik, adenozint használó jelzőrendszer által generált cAMP-n működik. Amikor a kutatók egy gyógyszert használtak az adenozinrendszer receptorainak blokkolására hét altatott nyúlból álló különálló csoportban, a gyógyszer összes hatása, beleértve a megnövekedett pulzusszámot is, megszűnt.

Más tanulmányok kimutatták, hogy az adenozin útvonalnak védő hatása lehet a szívre, mondja Kass. A Circulation ugyanebben a számában a Rochesteri Egyetem más kutatói azt is megállapították, hogy a PDE1 szabályozza az adenozin útvonalat, és a PDE1 gátlása megvédheti a szívet egyes rákgyógyszerek toxicitásától.

Az ITI-214 jelenleg korai klinikai vizsgálatok alatt áll, és szívelégtelenségben szenvedő betegeken tesztelik a Johns Hopkins Medicine és a Duke Egyetemen. Már átment az 1. fázisú biztonsági vizsgálatokon egészséges egyéneken.

A tanulmányban részt vett további kutatók: Toru Hashimoto, Richard Tunin, Tolulope Adesiyun, Steven Hsu, Ryo Nakagawa, Guangshuo Zhu és Dong Lee (Johns Hopkins), valamint Jennifer O'Brien, Joseph Hendrick, Robert Davis, Wei Yao, David Beard, Helen Hoxie és Lawrence Wennogle az intracelluláris terápiákról.

Ezt a munkát a National Heart, Lung and Blood Institute (HL135827-01, P01HL107153, HL119012), a Japanese Circulation Society Overseas Research Fellowship és az Uehara Memorial Foundation kutatási ösztöndíja, a T32 Training Program, az American Heart Association ösztöndíja és az Intra támogatta. -Cellular Therapies, amely biztosította a gyógyszert, valamint a kutatás finanszírozását.

A tanulmány finanszírozását és gyógyszereit az Intra-Cellular Therapies biztosította. Kass az intracelluláris terápiák fizetett tanácsadója. Ezt a megállapodást a The Johns Hopkins Egyetem az összeférhetetlenségi irányelveivel összhangban felülvizsgálta és jóváhagyta.


A cAMP–PKA–CREB jelátviteli útvonal szerepe daganatokban

A cAMP–PKA–CREB jelátvitelnek paradox hatásai vannak a daganatokban, tumorszuppresszorként vagy tumor-promoterként működik különböző daganattípusokban (1. táblázat). A cAMP-PKA-CREB jelátviteli útvonal szerepét májrákban és más daganatokban az alábbiakban ismertetjük.

Májrák

Míg egyes tanulmányok azt sugallják, hogy a növekvő cAMP szint gátolhatja a HCC sejtek növekedését [51, 52, 53], arról számoltak be, hogy a PKA több szubsztrát, például CIP4 foszforilálásával elősegíti a HCC inváziót és metasztázisokat [29]. A fibrolamelláris hepatocelluláris karcinóma (FL-HCC) egy elsődleges májrák, amely elsősorban gyermekeknél és fiatal felnőtteknél fordul elő. Az FL-HCC-s betegek 80%-100%-a rendelkezik DNAJB1–PRKACA génfúzióval, ami a 19. kromoszómán egy 400 kb-os génfragmens delécióját és egy kiméra fehérje termelődését eredményezi, amely megtartja a PKA kináz aktivitást [54]. A DNAJB1–PRKACA knock-in egerekben az FL-HCC-re jellemző daganatok alakulhatnak ki [55]. Ezenkívül a PRKACA a BAP1 gén (amely a BRCA1-asszociált protein 1-et kódoló) mutált HCC-ben körülbelül 80%-ban túlzottan expresszálódik, amelyek klinikai megnyilvánulásai és szövettani jellemzői hasonlóak, mint a DNAJB1–PRKACA fúzióval kapcsolatos FL-HCC [56]. A PKA útvonal diszfunkciója fontos szerepet játszik e két típusú HCC kialakulásában és progressziójában. A hepatitis B vírus (HBV) fertőzés a HCC kialakulásának fő kockázati tényezője. A HBV X fehérje fontos szerepet játszik a HBV-vel kapcsolatos HCC-ben. Mechanikailag a HBVx elősegítheti a májkarcinogenezist a CREB-miR-3188 és a ZHX2-Notch jelátviteli útvonalon [57], elősegítheti a HCC sejtnövekedést a CREB-YAP tengely aktiválásával [58], és elősegítheti a HBV-vel kapcsolatos HCC invázióját és metasztázisát. -szabályozza a FOXM1 expressziót az Erk-CREB útvonalon keresztül [59]. Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a PKA-CREB útvonal elősegítheti a HCC progresszióját. Valójában patkány HCC daganatok és páros normál májminták elemzése szignifikáns növekedést mutatott a CREB és CREB foszforiláció szintjében HCC-ben [60].

A cAMP szerepe a HCC-ben azonban kissé paradoxnak tűnik. Ahogy fentebb leírtuk, a cAMP-szintek PDE-inhibitorok általi növelése leállíthatja a HCC-sejtek növekedését. A HepG2 sejtek cAMP analógokkal történő kezelése jelentősen csökkenti a ciklin A transzkripcióját és fehérjeszintjét, és sejtciklus leállást idéz elő [61]. Ezenkívül a PDE4 inhibitor rolipram és a DC-TA-46 fokozza a p21, p27 és p53 expresszióját, és csökkenti a ciklin A expresszióját, ezáltal gátolja a HepG2 sejtek proliferációját és elősegíti az apoptózist [52]. Ezzel szemben a vazoaktív intestinalis peptid csökkentheti a cAMP koncentrációt, a CREB expressziót és a Ser 133 foszforilációját, valamint gátolja a Bcl-xL expressziót, ami Huh7 sejt apoptózishoz vezet [62]. A cAMP sokrétű szerepe a HCC-ben annak köszönhető, hogy sokféle célpontja van, és sokféle funkcióval rendelkezik. Ezért az, hogy a cAMP elősegíti vagy gátolja a HCC-t, kontextusfüggő lehet. A cAMP szint homeosztázis kritikus lehet a HCC progressziójában.

Agyrák

A CREB-aktiváló kináz PKA szerepe agydaganatokban szintén paradox. Számos tanulmány kimutatta, hogy a PKA tumorszuppresszív szerepet játszik az A-172 glioblasztóma sejtvonalban. A PKA aktiválása a cAMP szintjének növelésével vagy cAMP analógok (dcAMP és 8-Br-cAMP) ellátásával csökkentheti az A-172 sejtek proliferációs sebességét, elősegítheti a differenciálódást és apoptózist indukálhat [63]. Az intracelluláris cAMP-szint növelése a rolipram, egy PDE-inhibitor által, fokozhatja a p21 és p27 expresszióját, és aktiválhatja a PKA és Epac1-Rap1 jelátvitelt, ami az A-172 sejtnövekedés leállásához és apoptózishoz vezet [64, 65]. A cAMP útvonal medulloblasztómában is rákellenes szerepet játszik. Az agyalapi mirigy adenilil-cikláza gátolja a medulloblasztóma sejtek proliferációját a PKA-Gli1 útvonalon [66], a neurociliáris fehérjék pedig a PDE4D-PKA-Hedgehog útvonalon keresztül gátolják a medulloblasztóma növekedését [67]. Az ARHGAP36 fehérje, amely a RhoGAP család tagja, képes kötődni a PKA katalitikus alegységéhez és gátolni annak aktivitását, ezáltal aktiválja a Hedgehog útvonalat és elősegíti a medulloblasztóma növekedését [68]. A cAMP és PKA tumorszuppresszív hatásait inkább az Epac1, Rap1 és Gli1 közvetítheti, mint a CREB.

A CREB foszforilációját közvetlenül gátolhatja a PTEN, egy rákellenes protein-foszfatáz, amely gyakran mutációt mutat vagy inaktivál számos rákban, beleértve az agyrák legagresszívebb típusait, a glioblastoma multiformét és az asztrocitómát [69, 70]. A PTEN-hiány fokozhatja a CREB aktivitását és indukálhatja a PAX7 expresszióját, ezáltal elősegítve a humán idegi őssejtek átalakulását glioblasztóma őssejtekké [71]. Ezenkívül a CREB kölcsönösen le tudja szabályozni a PTEN-t. Tan és mtsai. beszámoltak arról, hogy a CREB erősen expresszálódik a glióma klinikai mintáiban és sejtvonalaiban, és a CREB gátolja a PTEN expressziót a miR-23-on keresztül, így elősegítve a glióma kialakulását [72]. Ezenkívül az EGFR aktiválhatja a CREB-t a MAPK-RSK2 útvonalon keresztül, majd elősegítheti a gliómasejtek növekedését és invázióját [73].

Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), az EGFRvIII mutáns és a vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) elősegítheti a glioblasztóma kialakulását és invázióját a PKA-Dock180 jelátviteli útvonalon keresztül [74, 75]. Ezenkívül a miR-33a fokozza a cAMP–PKA jelátvitelt azáltal, hogy gátolja a PDE8A expresszióját, így elősegíti a kezdeti glióma őssejtek növekedését és önmegújulását [76]. Az MGR3 humán glioblasztóma sejtvonalban a PKA aktiválása a GSTP1 foszforilációjának és aktivitásának jelentős növekedéséhez vezet, ami gyógyszerrezisztenciához és a kezelés sikertelenségéhez vezethet [77].

Tüdőrák

A nem-kissejtes tüdőrákban (NSCLC) a CREB expressziója és foszforilációja jelentős mértékben fokozódik a tumorszövetekben a szomszédos normál szövetekhez képest. A megnövekedett CREB expresszió korrelál a betegek rövid túlélési idejével [78]. A cAMP csökkentheti a SIRT6 expresszióját, és így csökkentheti az NSCLC sejtek sugárterápia által kiváltott apoptózisát [79]. Az erősen rosszindulatú kissejtes tüdőrákban (SCLC) a CREB fokozott aktivitása segít fenntartani neuroendokrin jellemzőit és proliferációját [80]. Az RGS17 a tüdőrákos szövetek 80%-ában megnövekedett a megfelelő normál tüdőszövethez képest, és elősegíti a sejtproliferációt a cAMP–PKA–CREB útvonalon keresztül [81]. Ezenkívül a PKA-Smurf1-PIPKIγ jelátvitel elősegíti a tüdőrák progresszióját in vivo [82]. A cAMP–PKA–CREB útvonal szabályozhatja a tüdőráksejtek hipoxia válaszát [83]. A PKA inhibitorok H-89 és PKACA knockdown antagonizálják a hipoxia által kiváltott epiteliális-mezenchimális transzformációt, sejtmigrációt és a tüdőráksejtek invázióját [84]. Ezenkívül az oxidatív stressz fontos szerepet játszik a tüdőbetegségek, köztük a tüdőfibrózis és a tüdőrák patogenezisében. A PKA, Erk1/2 és CREB közötti kölcsönhatások közvetítik a sejtek túlélését oxidatív stresszben [85].

Ellentétben a sugárterápia által kiváltott NSCLC sejtapoptózis cAMP-Sirt6 útvonal általi gátlásával [79], úgy tűnik, hogy a cAMP-PKA-CREB útvonal rákellenes szerepet játszik a sugárterápiában. A BALB/c egerek forskolinnal végzett előkezelése gátolhatja az ATM-et és az NF-κB-t a PKA-indukált PP2A foszforilációja révén, ami a sugárterápia által kiváltott apoptózis növekedését eredményezi [86]. A H1299 tüdőrák sejtvonalban a Gs fehérje elősegíti a Bak expresszióját a PKA-CREB-AP1 útvonalon keresztül, és fokozza a sugárterápia által kiváltott apoptózist [87]. Ezek a tanulmányok arra utalnak, hogy a cAMP-PKA-CREB útvonal ellentétes hatásokat is fejthet ki ugyanazon daganattípus különböző körülményei között.

Prosztata rák

A PKA alegység biomarker lehet a prosztatarák sugárkezelésre és kemoterápiára adott válaszának előrejelzésében. 456 klinikai prosztatarák minta elemzése azt találta, hogy a PKA RIα 80 esetben (17,5%) erősen expresszálódik, és a PKA RIα túlzott expressziója a sugárterápia és a rövid vagy hosszú távú androgénmegvonásos kezelés gyenge hatékonyságával, távoli metasztázisokkal és abnormális biokémiai adatokkal jár. index [88]. A prosztatarák sejtvonal PC3M sejtjeiben a vad típusú PKA RIIβ vagy a mutáns típusú PKA RIα-P (funkcionálisan hasonló a PKA RIIβ-hoz) túlzott expressziója növekedésgátláshoz és apoptózishoz vezet in vitro, és gátolja a tumor növekedését in vivo [89]. Az androgén receptor (AR) jelátvitel kritikus fontosságú a prosztata karcinogenezisében. A tesztoszteron közvetlenül stimulálja a GPR56-ot, majd aktiválja a cAMP/PKA útvonalat, ami elősegíti az AR jelátvitelt [90]. A PKA a HSP90-ben lévő Thr 89 maradékot is foszforilezi, ami az AR felszabadulásához vezet a HSP90-ből, és az AR kötődik a HSP27-hez, ami az AR-t a sejtmagba juttatja, hogy transzaktiválja a célpontjait [91]. Ezenkívül a PKA jelátviteli út részt vesz a prosztatarák neuroendokrin differenciálódásában, ami az androgénfüggetlenség kialakulásának korai markere [92, 93]. Ezenkívül az oszteokalcin és az ostesialin magas expressziója az androgénfüggetlen C4-2B prosztatarák sejtvonalban a cAMP-PKA jelátviteli útvonaltól függ [94]. A PAK4 aktiválható a cAMP–PKA-val, hogy fokozza a CREB transzkripciós aktivitását, függetlenül a Ser 133 oldallánc foszforilációjától, és a PAK4 leütése a PC-3 és DU145 sejtekben gátolja a tumor kialakulását meztelen egerekben [95]. Ezenkívül az RGS17 túlzottan expresszálódik a prosztatarák-mintákban, és a cAMP–PKA–CREB útvonalon keresztül elősegíti a sejtproliferációt [81]. Ezenkívül beszámoltak arról, hogy a depresszió és a viselkedési stressz felgyorsíthatja a prosztatarák progresszióját a PKA-kináz révén [30, 96].

Petefészekrák

A szöveti microarray-ben a hámból származó humán petefészektumorok körülbelül 54%-a mérsékelt vagy magas szintű CREB-expressziót mutat, míg a normál petefészekmintákban nem figyeltek meg expressziót. A CREB expresszió leállítása szignifikánsan csökkenti a petefészekrák sejtek proliferációját, de nem volt hatással az apoptózisra [97]. Az epiteliális petefészekrák az egyik leghalálosabb nőgyógyászati ​​rosszindulatú daganat. A PKA RIα erősen expresszálódik epiteliális petefészekrákban [98]. A SKOV3 epithelialis petefészekrák sejtvonal metasztatikus terjedése során az extracelluláris mátrix invázióhoz PKA aktivitásra és AKAP-horgonyra van szükség, a PKA aktivitás vagy a PKA RI és RII horgony gátlása pedig blokkolhatja a mátrix inváziót [99]. Ezenkívül a PKA a claudin-3 foszforilálásával csökkenti a szoros junction intenzitását az OVCA433 epiteliális petefészekrák sejtvonalban [100]. Ezenkívül a gonadotropin elősegíti az epiteliális petefészekráksejtek metasztázisát a PKA és PI3K útvonalakon keresztül [101].Míg a fent említett vizsgálatok azt sugallják, hogy a PKA-CREB tumorpromotáló szerepet játszik az epiteliális petefészekrákban, egy tanulmány azt sugallja, hogy a PKA képes foszforilálni az EZH2-t a Thr 372 aminosavnál, ami mitokondriális diszfunkcióhoz, az EZH2 kötődését a STAT3-hoz, majd gátolja a STAT3-at. foszforiláció és epiteliális petefészekrák sejtnövekedés [102].

Mellrák

Az R alegység, különösen a PKA RI túlexpressziója a normál emlő sejtproliferációjával, az emlőhámsejtek rosszindulatú átalakulásával, az emlőrák rossz prognózisával és az antiösztrogén terápia toleranciájával jár. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy az aktivált PKA nukleáris lokalizációja korrelál az emlőrák metasztázisával [103]. Az integrin α9 fenntartja a β-catenin stabilitását az ILK/PKA/GSK3 jelátvitel révén, és ezáltal elősegíti a tripla negatív emlőráksejtek növekedését és metasztázisát [104]. Ezenkívül a sikeres anti-ösztrogénterápia csökkent RI mRNS expresszióval jár, és az RI antiszensz oligonukleotidok csökkenthetik az emlőráksejtek növekedési sebességét [105]. Ösztrogénreceptor-pozitív emlőrákban a PKA által kiváltott ERα Ser 305 foszforiláció és a PAK1 összefüggésbe hozható a tamoxifen rezisztenciával és az emlőrák progressziójával [106, 107]. A Her-2 pozitív emlőráksejtekben a PKA aktiváció a trastuzumab rezisztenciával társul [108]. Emellett a cAMP-PKA-CREB útvonal az emlőrák metabolikus szabályozásában is fontos szerepet játszik. A szerotonin az AC-PKA útvonalon keresztül elősegíti a mitokondriális bioszintézist az emlőráksejtekben [109]. A citoplazmatikus G-protein-kapcsolt ösztrogén receptor elősegíti az aerob glikolízist a cAMP–PKA–CREB útvonalon keresztül [110]. A fenti tanulmányokkal ellentétben arról számoltak be, hogy az IL-24 az emlőráksejtek apoptózisát indukálja azáltal, hogy aktiválja a TP53-at és az endoplazmatikus retikulum stresszt a PKA-n keresztül [111]. Ezért a PKA-nak paradox szerepe lehet az emlőrákban a kontextustól függően.

Leukémia

A cAMP szerepe meglehetősen eltérő a limfóma különböző típusaiban. A PDE4-inhibitorok blokkolják az intracelluláris TLR jelátvitelt, és a cAMP-koncentráció növelésével elősegítik a krónikus limfocitás leukémia (CLL) sejtek apoptózisát [112, 113]. Érdekes módon a PDE4-inhibitorok apoptózist indukálnak B-sejtes CLL-ben, de nem T-sejt-CLL-ben vagy normál keringő hematopoietikus sejtekben, valószínűleg ennek köszönhető, hogy a PDE4-inhibitorok csak a glükokortikoid receptor és a cAMP szintjét növelik a B-sejt-CLL-ben [114, 115]. A cAMP–PKA elősegítheti az apoptózist mitokondriumfüggő útvonalakon keresztül, csökkentve a Bcl-2 és a survivin anti-apoptotikus fehérjék expresszióját, és növelve a pro-apoptotikus Bax fehérje expresszióját limfóma sejtekben [116,117,118]. A mikrokörnyezetből felszabaduló CXCR4 és CXCL12 kemokinek a CLL sejteken kötődhetnek Gai-konjugált GPCR-ekhez, csökkentve a cAMP szintézist és növelve a CLL sejtek túlélési arányát [119, 120]. A PDE7B túlzottan expresszálódik CLL-ben, és a PDE7 inhibitorai (BRL-50481 és IR-202) és a kettős PDE4/PDE7 inhibitor IR-284 fokozzák a CLL sejtek apoptózisát, amit a PKA gátlása gyengít [121].

A legtöbb leukémiás sejtvonal, valamint akut myeloid leukaemiában (AML) és akut limfoblasztos leukémiában (ALL) szenvedő betegek csontvelőjében a CREB túlzottan expresszálódik [122]. Korábbi tanulmányok azt is kimutatták, hogy a CREB erősen expresszálódik AML-betegek mieloid leukémiás sejtjeinek többségében, és rossz prognózishoz kapcsolódik [123]. A jmjd3/UTX inhibitor GSKJ4 elősegítheti a CREB lebomlását és gátolja az AML-sejtek növekedését [123]. A CREB túlzott expressziója elősegítheti az AML-sejtek proliferációját a ciklin A1 expressziójának fokozásával. Ezenkívül a CREB transzgenikus egerek myeloproliferatív betegségeket mutatnak, de leukémiát nem, ami arra utal, hogy a CREB részt vesz a leukémia fenotípusában a leukémia csírázása során, de nem elegendő ahhoz, hogy teljesen leukémiává alakuljon át [124]. Ezzel szemben a cAMP képes megvédeni az akut promielocitás leukémiás sejteket az arzén-trioxid és az antraciklinek által kiváltott apoptózistól [124]. Az IPC-81 AML sejtvonalban a cAMP apoptózist indukálhat a Bim CREB és CDK általi felszabályozása révén [125].

Egyéb daganatok

A PKA RIα és AKAP10 mRNS- és fehérjeszintje szignifikánsan megemelkedik a vastag- és végbélrákos szövetekben, ami összefüggésben áll az invázió mélységével, a differenciálódás mértékével és a rövid túléléssel [126]. Az I-es típusú inzulinszerű növekedési faktor receptor (IGF-IR) szorosan részt vesz a tumorigenezisben és a gyógyszerrezisztenciában [127]. Az IGF-IR jelátvitel ezrin foszforilációt indukál a Thr 567 aminosavnál, és ezáltal elősegíti a cAMP-függő PKA aktivációt és a vastag- és végbélrák sejtek túlélését [128]. A PKA RIα és AKAP10 túlzott expressziója számos vastagbélrák sejtvonalban közvetlenül korrelál a metasztázisokkal. Ezenkívül a vastag- és végbélráksejtek rezisztenciáját egy szelektív MEK1/2 gátló szelumetinibbel szemben a PKA aktiválása indukálja [129], a vastag- és végbélráksejtek metotrexáttal szembeni rezisztenciáját pedig cAMP jelátvitel indukálja [130]. A PKA antagonisták gátolhatják a β-catenin nukleáris transzlokációját, valamint a c-myc és COX2 expresszióját APC mutáns vastagbélrákban, ezáltal gátolják a tumor fejlődését [131].

Immunhisztokémiai kísérletek azt találták, hogy a normál melanociták nem expresszálnak PKA RIα fehérjéket, de humán melanoma mintákban és néhány melanoma sejtvonalban erősen expresszálódik. A RII aktiváció vagy az RIα-csend gátolhatja a proliferációt és fokozhatja a kaszpáz 3 által előidézett apoptózist [132]. A PKA elősegítheti a melanoma sejtek migrációját. Tanulmányok kimutatták, hogy a hipoxia indukálhatja az AKAP12 állványfehérje expresszióját melanomában, és a hipoxia során a PKA által szabályozott foszforiláció az AKAP12 jelenlététől függ. Az AKAP12 inaktiválása a tumornövekedés, a migráció és az invázió csökkenéséhez vezet melanoma egérmodellekben [133]. A PKA útvonal a melanin szintézisében is fontos szerepet játszik. A diethylstilbestrol elősegítheti a melanintermelést a tirozináz és MITF cAMP–PKA által közvetített fokozása révén a B16 egér melanoma sejtvonalban [134], a gingerol pedig a MAPK és a PKA leszabályozásával gátolja a melanintermelést [135].


ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Drosophila

Drosophila melanogaster A Meigeneket standard táptalajon, 25 °C-on, 12 óra:12 óra világos:sötét fényperiódussal és 55%-os relatív páratartalommal neveltük. A tanulmányban használt vonalak a következők voltak: vad típusú, Canton S fehér mutánsok: w 1118 (részleges törlés, funkcióvesztés: http://flybase.bio.indiana.edu/reports/FBal0018186.html) és w H (hipomorf allél) (Zachar és Bingham, 1982) tubulus fő sejtspecifikus GAL4 meghajtó, c42 (Broderick et al., 2004) transzgenikus w::eYFP D4, E5 és H8 vonalak (ehhez a tanulmányhoz generálva).

Mutáns w Drosophila (w 1118 és w H ). Az utódokat összegyűjtöttük és kereszteztük, hogy recesszíven fehér szemű utódokat hozzanak létre. Ezt a folyamatot ötször megismételtük, így a mutáns törzsek első izolálása óta felhalmozódott kompenzációs mutációk 97%-át eltávolítottuk.

A boncoláshoz a legyeket jégen történő hűtéssel érzéstelenítettük, majd lefejeztük, mielőtt a tubulusokat Schneider-féle tápközegben (Invitrogen Ltd., Paisley, Skócia) eltávolítottuk. Minden vegyszert és gyógyszert a Sigma cégtől szereztünk be (Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, Egyesült Királyság), hacsak másképp nem jelezzük.

Transzgénikus generáció Drosophila

A C-terminálison fokozott sárga fluoreszcens fehérjével (eYFP) megjelölt White-ot tartalmazó túlexpressziós vonalakat a következőképpen hoztuk létre:

Az eYFP (Clontech UK Ltd, Basingstoke, Hampshire, Egyesült Királyság) kódoló szekvenciáját olyan primerekkel amplifikáltuk, amelyekbe Nemén és KpnI helyek az 5′ és 3′ végén (GCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG/GGTACCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC). A kapott fragmentumot a Nemén és KpnI oldalak pP szabványos módszereket használva pP létrehozására. Az fehér nyitott leolvasási keretet, kivéve a stopkodont, PCR-rel amplifikáltuk a tubulus cDNS-templátról a következő primerekkel: AGATCTATGGGCCAAGAGGATCAGGAG/GCGGCCGCCTCCTTGCGTCGGGCCCGAAG, amelybe beépített EcoRI és NemI oldalak az 5′ és 3′ végén. Ezt a fragmentumot klónozták pP használni a EcoRI és NemI restrikciós helyeket a plazmid képzéséhez pP<w – eYFP-UAST>. Az inszertet szekvenáltuk, hogy ellenőrizzük a PCR-hibákat, és a plazmidot beinjektáljuk wDrosophila embriók (w 1118 ) standard technikákkal (Vanedis Drosophila injekciós szolgáltatás, www.vanedis.no). A transzformánsokat standard alkalmazásával választottuk ki és tartottuk fenn Drosophilagenetikai technikák.

Folyadéktranszport vizsgálatok

A folyadéktranszport vizsgálatokat a korábban leírtak szerint (Dow és mtsai, 1994b) végezték el Canton S ép tubulusain, w 1118 és kantonizált w 1118 7 napos felnőtt legyek. A folyadéktranszport alapsebességét 30 percig határoztuk meg, majd 100 μmol l –1 cGMP-t adtunk a tubulusokhoz, és további 60 percig mértük a folyadéktranszport sebességét. Az adatok átlagos folyadékszállítási sebességként ± s.e.m. N=7.

Ciklikus nukleotid transzport vizsgálatok

A cGMP-re és cAMP-re vonatkozó transzportvizsgálatok módosított folyadéktranszport-vizsgálaton alapultak. A transzport sebesség a bazális és az apikális egyirányú fluxus lineáris mértékét adja, míg a szekretált:fürdőzés arány >gt1 azt jelzi, hogy a transzport szubsztrátot a tubulusok koncentrálják (Maddrell és munkatársai, 1974). A cGMP és cAMP transzport maximális sebessége 100 μmol l –1-nél volt (Evans, 2007), így minden transzport vizsgálatot 100 μmol l –1 ciklikus nukleotid végső koncentrációjával végeztünk. A cAMP transzportjának maximális sebessége szignifikánsan magasabb, mint a cGMP-é: a transzportarány ~5 100 μmol l –1 cAMP mellett, vs ~3 cGMP esetén 100 μmol l –1 cGMP esetén.

A tubulusokat sóoldatba bontottuk (Dow et al., 1994a), és 30 percig hagytuk helyreállni, mielőtt ciklikus nukleotidokat adtunk hozzá: „hideg” cGMP-t vagy cAMP-t 100 μmol l –1-nél, és triciált cGMP-t vagy cAMP-t adtunk hozzá nyomjelzőként (Amersham). Pharmacia, Biotech UK Ltd, Amersham, Bucks, Egyesült Királyság). Ahol versenytársakat vagy gyógyszereket tartalmaztak, ezeket 30 perccel a radioaktívan jelölt szubsztrát előtt adtuk hozzá. Ahol az aminosavak és a citrát eltávolítását vizsgálták, ott minimális Drosophila sóoldatot használtak (Linton és O'Donnell, 1999), amelyhez a hiányzó összetevőket Drosophila fiziológiás sóoldatot (Dow és mtsai, 1994a) a szokásosan használt koncentrációkban vezették be újra.

Az összes transzport vizsgálatban a transzport arányát és sebességét 1 órával a radioaktívan jelölt ciklikus nukleotid hozzáadása után mérték (Evans, 2007). A tubulusokat 1 órán keresztül hagytuk kiválasztódni, mielőtt a kiválasztott cseppet megmértük, és szcintillációs folyadékot tartalmazó Eppendorf csövekbe (Fisher Scientific, Loughborough, UK) eltávolítottuk. Minden egyes tartálycseppből 1 μl-es mintát vettünk, és a radioaktivitást a szcintillációs számlálóban mértük (Beckman, High Wycombe, Egyesült Királyság).

CGMP-függő kináz bioassay a szekretált cGMP-re

Annak megállapítására, hogy a változatlan cGMP a tubuluson keresztül a fürdőcseppből a lumenbe kerül-e, a szekretált folyadékot megvizsgáltuk a cGMP-dependens protein kináz (cGK) aktivitásának stimulálására. in vitro. A szekréciós vizsgálatot 80 tubulussal végeztük a standard fürdető cseppecskékben Drosophila sóoldat/Schneiders táptalaj (kontroll) vagy sóoldat/Schneiders táptalaj 100 μmol l –1 cGMP-vel. Miután a tubulusokat 1 órán át hagytuk kiválasztódni, a kiválasztott cseppeket összegyűjtöttük (összesen körülbelül 2 ml), eltávolítottuk a szekréciós vizsgálati edényből, és egy Eppendorf-csőbe helyeztük. A szekréciós vizsgálatból származó maradék ásványi olaj eltávolítására a mintákat centrifugáltuk, és az olajat (felső réteg) eldobtuk. Ezután cGK vizsgálatot végeztünk a Drosophila cGK, DG2 (MacPherson és mtsai, 2004), amely S2 sejtekben expresszálódott a DG2 forrásaként, és így a cGK aktivitásaként (MacPherson és mtsai, 2004). A standard kinázreakciókat 44 μl össztérfogatban állítottuk be 5 μl DG2 fehérjemintával, 39 μl kináz vizsgálati pufferrel (MacPherson et al., 2004) és vagy 1 μl kontrollmintákból kiválasztott folyadékkal vagy 1 μl szekretált. 100 μmol l –1 cGMP-ben inkubált tubulusokból származó folyadék. A pozitív kontrollokat úgy állítottuk be, hogy 1 μl 100 μmol l –1 cGMP-t (végső koncentráció 2,2 mmol l –1 ) adtunk a vizsgálati keverékhez a fent leírtak szerint. Három külön kísérletet végeztünk minden egyes állapotra, és az eredményeket pmol ATP min –1 mg –1 proteinben fejeztük ki (átlag ±s.e.m.).

Valós idejű kvantitatív PCR (Q-PCR)

A Q-PCR-t a korábban leírtak szerint végeztük (McGettigan et al., 2005), 7 napos felnőtt tubulusaiból előállított mRNS felhasználásával. Drosophila. Ahol a cGMP génexpresszióra gyakorolt ​​hatását vizsgálták, a tubulusokat 100 μmol l –1 cGMP-vel vagy anélkül inkubáltuk Schneider-féle tápközegben 3 órán keresztül, mielőtt az mRNS-t kivonták volna. A reverz transzkripciót Superscript II (Invitrogen) alkalmazásával végeztük oligo(dT) primerek felhasználásával. Minden mintánál 500 ng cDNS-t adtunk 25 μl SYBR Green reakciókeverékhez (Finnzyme, Oy Espoo, Finnország) a primerek megfelelő koncentrációjával – WhiteF: GCCACCAAAAAATCTGGAGAAGC/WhiteR:CACCACTTGCGTGAGTTGTTG. A reakciókat egy Opticon 2 thermocyclerben (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) hajtottuk végre. A riboszómális rp49(rpl32) gént (rp49F primerek: TGACCATCCGCCCAGCATAC/rp49R:TTCTTGGAGGAGGACGCCGTG) használtuk referencia standardként minden kísérletben (McGettigan et al., 2005).

Immuncitokémia

Az ép Malpighian tubulusok immuncitokémiáját a korábban leírtak szerint végeztük (MacPherson et al., 2001). Egy egér monoklonális primer anti-GFP antitest, amely felismeri a GFP variánsokat (Zymed, Invitrogen Ltd), 1:1000 arányban hígítva PAT-ban [0,05% (v/v) Triton X-100 és 0,5% (w/v) BSA PBS-ben, 14 mmol l - 1 NaCl, 0,2 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 Na2HPO4 és 0,2 mmol l –1 KH2PO4, pH 7,4] alkalmaztuk, majd másodlagos antitest, Alexa Fluor® 568-mal jelölt anti-egér IgG (Molecular Probes, Invitrogen Ltd.) hozzáadása, 1:500 arányban PAT-ban hígítva. A 4',6-diamidino-2-fenil-indol-dihidroklorid (DAPI) sejtmagfestéket 1 percig 500 ng ml-1 koncentrációban PBS-ben vittük fel a tubulusokra. A mintákat Zeiss 510 Meta konfokális rendszerrel néztük meg, a képeket pedig LMS képalkotó szoftverrel dolgoztuk fel. Minden kép azonos erősítéssel és expozícióval készült.


Mi az a cAMP Boost?

A Nutraville a cAMP Boostot biztonságos és erőteljes zsírégető formulaként írja le, amely a rendelkezésre álló legerősebb PDE-4 inhibitorokat használja. Ezek az inhibitorok eltávolítják a zsírvesztést gátló enzimeket, miközben fokozzák a cAMP molekulák által küldött zsírégető üzeneteket. Ezeken a mechanizmusokon keresztül a cAMP Boost állítólag elmondhatja a sejteknek, hogy óráról órára, megállás nélkül égessenek zsírt.&rdquo

A cAMP Boost üvegenként 67 dollárba kerül, és 365 napos pénzvisszafizetési garanciával. Minden üvegnek egy hónapig kell tartania. A cég azonban az adag megduplázását javasolja, hogy maximalizálja a képlet zsírégető hatékonyságát.

Hogyan működik a cAMP Boost?

A cAMP Boost hat hatóanyagot használ a fogyás elősegítésére, beleértve a grapefruit kivonatot, a guarana mag kivonatot, a paradicsomszemek kivonatát és a fekete bors kivonatot.

A gyártó azt javasolja, hogy vegyen be egy kapszulát naponta kétszer (reggel és napközben), hogy elősegítse a jelentős súlycsökkenést. A gyártó az adag megduplázását is javasolja, hogy maximalizálja a tápszer zsírégető hatását.

Íme, hogyan írja le a Nutraville, a cAMP Boost gyártója a cAMP Boost hatásait:

Az &ldquocAMP Boost egy erőteljes zsírcsökkentő formula, amely a vizsgálatokban kimutatott összetevőket használja a zsírsejtek ciklikus erősítő jeleinek fokozására. Azok a ciklikus erősítők figyelmeztetik a sejteket, hogy zsírt szabadítsanak fel és égessenek el, így könnyedén fogyhat óráról órára.&rdquo

Mindannyiunk szervezetében van egy PDE-4 nevű enzim. Ez az enzim megakadályozza, hogy a szervezet zsírégető jeleket küldjön a ciklikus adenozin-monofoszfátnak (cAMP). A cAMP a legfontosabb hírvivő, amely jeleket küld a sejteknek a zsírégetés érdekében. Ha a PDE-4 jelen van a szervezetben, akkor megakadályozza, hogy maximalizálja a zsírégetést.

Íme, hogyan magyarázza el a c-AMP Boost webhely a cAMP és a PDE-4 hatását a fogyásodra:

&ldquoVan egy bizonyos &ldquosigning molekula&rdquo a szervezetben, amit cAMP…-nak neveznek, és ez a jelzőmolekula üzeneteket küld a sejtjeidnek, hogy zsírt égessenek. A szervezetben azonban van egy &ldquosignal-muting enzim&rdquo, PDE-4…, amely megcélozza és blokkolja a cAMP-molekulák által küldött zsírégető jeleket.&rdquo

Amikor a PDE-4 blokkolja a cAMP jeleket, megnehezíti a zsírégetést, még akkor is, ha helyesen táplálkozik és edz.

Sajnos, ahogy öregszünk, a szervezet több PDE-4-et termel, ami az életkor előrehaladtával a nem kívánt súlygyarapodás egyik oka. A Nutraville azt állítja, hogy a cAMP Boost leállítja a PDE-4-et, gátolja az enzimet, és felszabadítja a hatékony fogyást.

Hogyan állítja le a cAMP Boost a PDE-4-et?

A cAMP Boost PDE-4 gátlóként működik, segíti a zsírégető képességeid felszabadítását.

A PDE-4 blokkolása érdekében a cAMP Boost a Sinetrol-t természetes összetevőkkel kombinálja. A cAMP Boostban található Sinetrol deaktiválja a PDE-4 enzimeket, és fokozza a zsírégető cAMP jeleket a zsírsejtek felé.

A cAMP Boost bioperint is tartalmaz, egy feketebors kivonatot, amelyről kimutatták, hogy javítja az összetevők felszívódását.

  • Fogyj biztonságosan és gyorsan
  • Lapítsd le a hasad
  • Kalóriát égetni
  • Változtassa a csúnya fehér testzsírt zsírégető barna zsírrá
  • Segítse sejtjeit a zsírégetésben óráról órára, megállás nélkül

A Nutraville azt állítja, hogy a formulájukban lévő összetevők „a rendelkezésre álló legerősebb PDE-4 inhibitorokként” hatnak, és eltávolítják a zsírvesztés gátlásáért felelős enzimeket. Ezek az összetevők fokozzák a cAMP-molekulák által küldött zsírégető üzeneteket is, és arra utasítják sejtjeit, hogy óráról órára, megállás nélkül égessenek zsírt.

A barna zsír jelentősége

A cAMP Boost a barna zsírt is megcélozza a testedben, és a fehér testzsírt zsírégető barna zsírrá alakítja. Igen, van különbség a testben lévő zsírok között. Egyes zsírfajták jobbak, mint mások.

A fehér zsír például csak egy vagy két mitokondriumot tartalmaz. A barna zsír eközben egy tucat mitokondriumot tartalmaz, így zsírégető erőmű.

Ha növeli a barna zsír aktivitását a szervezetben, akkor könnyebbé teheti a fogyást. Minél több barna zsírod van, annál több kalóriát éget el a szervezeted.

A cAMP Boost egy afrikai fűszert tartalmaz, amely állítólag felerősíti a fehér zsírszövetet a szervezetben. Itt megtudhatja, hogyan magyarázza a Nutraville az összetevő hatásait:

&ldquoSzeretnék úgy gondolni rá, mint egy mályvacukrot sütni ropogó tűzön, mert van benne egy bizonyos forró afrikai fűszer, amely &ldquooo&rdquo&rdquo fehér zsírszövetet… És mi&rsquove ezt hozzáadtuk a Camp Boost formulánkhoz, hogy szó szerint segítsen a makacs testzsírt karcsúsító zsírrá alakítani. amely átformálja az alakját és rengeteg energiát ad.&rdquo

Ez az összetevő és a cAMP Boost egyéb összetevői állítólag újraaktiválhatják ezt a zsírégető barna zsírt, megkönnyítve a fogyást.

Mennyit fogyhatsz a cAMP Boost segítségével?

Nutraville szerint minden reggel karcsúbbnak, fiatalabbnak és szexisnek ébredhetsz a tükörben. Ahelyett, hogy minden napot csalódottan kezdene a fogyás előrehaladása miatt, motiváltnak ébredhet.

Itt megtudhatja, mennyit fogyhat le a c-AMPBoost.com webhely szerint:

&ldquoHirtelen leadsz 10, 20, akár 30 fontot vagy még többet nehéz, csúnya testzsírból, és ámulatba ejted a családodat egy észbontó átalakulással, ami valójában baromi egyszerű volt…Húzd fel kedvenc farmered a combod mellett újra… és nézd meg zsákmányszerző (szexi módon).&rdquo

A cAMP Boost értékesítési oldalon szereplő egyéb súlycsökkentő állítások a következők:

Egy, a cAMP Boost egyik összetevőjére vonatkozó vizsgálatban a résztvevők akár 677%-kal több testzsírt veszítettek el, mint a placebo csoport – pusztán azáltal, hogy PDE-4 gátlót szedtek.

Egy másik tanulmányban a résztvevők hatszor gyorsabban veszítették el a zsírt, mint a placebót szedő csoportban, miközben testzsírjuk 5,53%-át veszítették el mindössze 4 hét után, és összesen 15,6%-kal csökkentették testzsírjukat 12 hét után. mint PDE-4 inhibitor

Egy másik tanulmányban a kutatók azt találták, hogy a résztvevők plusz 180 kalóriát égettek el, szó szerint erőfeszítés nélkül, miután a cAMP Boost egyik összetevőjét bevették a résztvevők zsírtömegük 63%-át 4 hónap alatt.

Egy nő, akit a c-AMPBoost.com webhelyen mutattak be, azt állítja, hogy a cAMP Boost szedése alatt 8 hét után 22 font testzsírt fogyott, vagyis körülbelül heti 2,5-3,5 fontot

Egyes fogyókúrás tabletták irreális fogyókúrás kijelentéseket tesznek, ami azt sugallja, hogy egy hónap alatt 50 fontot fogyhat le fogyókúra vagy edzés nélkül. A cAMP Boost webhely valósághűbb, tudományos tanulmányokra, lektorált kutatásokra és valós vásárlói tapasztalatokra hivatkozik. Más diétás tablettákhoz hasonlóan a cAMP Boostnak is ki kell egészítenie az egészséges táplálkozási és testmozgási szokásokat, és nem helyettesítheti azokat.

CAMP Boost összetevők

A cAMP Boost Sinetrolt és más összetevőket használ a fogyás elősegítésére. Ezen összetevők némelyike ​​gátolja a PDE-4-et. Más összetevők fokozzák a cAMP jelátvitelt. Ezek a hatások együttesen segíthetnek több zsírt égetni a nap 24 órájában.

Íme a cAMP Boost összetevői és működésük a Nutraville szerint:

Sinetrol

A Sinetrol egy szabadalmaztatott formula, amely a makacs hasi zsír kiváltó okát célozza meg: a PDE-4 nevű enzimet. Ez az enzim gátolja a cAMP zsírégető tevékenységét, ami megnehezíti a fogyást. A Sinetrol súlycsökkentési előnyeit vizsgálták, és számos tanulmány kimutatta, hogy a Sinetrol erőteljes hatással lehet a fogyásra.

Paradicsom szemcséi

A Paradicsomszemek Etiópia déli részén honos gyógynövény. Ez a fenti barna zsír részben említett &lsquohot afrikai fűszer&rsquo. Nutraville szerint a paradicsomszemek aktiválhatják a barna zsírt a testedben. A barna zsír több energiát éget el, mint a fehér zsír. Ha a fehér zsírt barna zsírrá alakítja, a paradicsomszemek állítólag erőteljes hatással lehetnek a fogyásra. A paradicsomszemeket szedő résztvevők napi 100 kalóriával többet égettek el, mint egy placebocsoport egy vizsgálatban.

Guarana mag

A cAMP Boost guarana magot is tartalmaz, egy természetes kivonatot, amely több tanulmányban is összefüggésbe hozható a fogyással. Egy tanulmányban a guarana magot szedő résztvevők 16,3 fontot és testzsíruk 5,1%-át fogytak 8 hét alatt. Úgy tűnik, hogy a guarana több kalóriát éget el, ami biztonságos és gyors zsírvesztéshez vezet, a Nutraville szerint.

Grapefruit kivonat

A cAMP Boost grapefruit kivonatot tartalmaz, egy savanyú szupergyümölcsöt, amely népszerű a fogyásban. Dr. Oz nemrég méltatta a grapefruit és rsquos súlycsökkentő előnyeit, és azt állította, hogy ez az összetevő visszatért a fogyáshoz, és jobb, mint valaha. Nutraville szerint a grapefruit kivonat segít a testsúly szabályozásában azáltal, hogy növeli a sejtekhez küldött cAMP jeleket, biztonságos és gyors zsírt hozva létre. veszteség. Egy tanulmányban a grapefruit kivonatot szedő résztvevők 333%-kal többet fogytak, mint a placebo csoport.

Bioperine

A cAMP Boost végső összetevője a Bioperine, egy speciális feketebors-kivonat. A Nutraville hozzáadta ezt az összetevőt, hogy javítsa a cAMP Boost egyéb összetevőinek felszívódását és biológiai hozzáférhetőségét. A Nutraville szerint a Bioperine pajzsként működik minden összetevő körül, és segít minden összetevőnek a maximális hasznot hozni a szervezet számára.

The Story Behind cAMP Boost

A cAMP Boost Carly Johnson, feleség és anya hozta létre, aki csalódott volt a súlygyarapodás miatt. Carly&rsquos férje elhagyta őt egy soványabb nőért. Az a nő később kinevette Carly súlyát, és megtanította a fiát, hogy kövérnek nevezze Carlyt.

Carly megalázottan és bosszúsan úgy döntött, hogy intézkedik. Elkezdte kutatni a fogyás természetes gyógymódjait. Úgy érezte, mindent jól csinált, beleértve a diétát és az edzést is, mégsem fogyott.

Végül Carly ráakadt a PDE-4 inhibitorokra és a fenti összetevőkre. Barátjával, Johnnal összefogott, hogy elkészítsék az összetevőket kiegészítő formában. A tápszer bevétele után Carly 8 hét alatt 22 fontot fogyott.

A fogyás sikere motiválta, Carly úgy döntött, hogy a cAMP Boost formájában online értékesíti a kiegészítőt.

Carly gondosan elmagyarázza, hogy nem orvos vagy táplálkozási szakértő: ő csak egy hétköznapi nő, aki úgy döntött, hogy létrehoz egy fogyókúrás kiegészítőt. Ma már bárki megvásárolhatja a cAMP Boost online a hivatalos weboldalon keresztül, és potenciálisan hasonló fogyási eredményeket érhet el, mint Carly.

CAMP Boost Ingredients címke

A Nutraville előzetesen közzéteszi az összetevők és az adagok teljes listáját, megkönnyítve a kiegészítő tudományos tanulmányokkal való összehasonlítását és a fogyás segítőinek versenyét.

  • 450 mg grapefruit kivonat, guarana mag kivonat, citrus Sinensis kivonat és vérnarancs koncentrátum (Sinetrol Xpur formájában)
  • 40 mg paradicsomszem kivonat (CaloriBurn formájában)
  • 5 mg fekete bors kivonat (Bioperine formájában)
  • Egyéb összetevők, beleértve a növényi cellulózt, titán-dioxidot, rizsport, magnézium-sztearátot és szilícium-dioxidot

A cAMP Boost tudományos bizonyítékai

A Nutraville azt állítja, hogy a cAMP Boost minden összetevője biztonságosnak és hatékonynak bizonyult. A cég a c-AMPBoost.com webhelyen több tucat tanulmányra hivatkozik, amelyek alátámasztják hirdetett előnyeit.

Ebben a 2006-os tanulmányban például a kutatók a foszfodiészteráz (PDE) gátlók hatásait vitatták meg. A foszfodiészterázok egy változatos enzimcsalád, amelyek kulcsszerepet játszanak a cAMP és cGMP másodlagos hírvivő sejten belüli szintjének szabályozásában, így a PDE-k kulcsfontosságúak a sejtműködésben. A PDE-gátlóknak három fő típusa van, köztük a PDE-3-gátlók (pangásos szívelégtelenség kezelésére), a PDE-4-gátlók (gyulladásos légúti betegségek kezelésére) és a PDE-5-gátlók (merevedési zavarok kezelésére).

Az is igaz, hogy a PDE-4 aktivitása az életkorral csökken. Ebben a 2016-os tanulmányban a kutatók életkorral összefüggő különbségeket figyeltek meg a PDE aktivitásában, ami észrevehető változásokhoz vezetett a sejtjelátvitelben. A kutatók ennek a PDE-4 aktivitásnak a szív- és érrendszeri egészségre gyakorolt ​​hatásait elemezték, és nem a fogyás hatásait. Azonban igaz, hogy a PDE-4 aktivitása az életkorral változik.

A cAMP Boost egyik legnagyobb összetevője a Sinetrol. A Sinetrol a citruskivonatok szabadalmaztatott keveréke, amelyet több klinikai vizsgálat is alátámaszt. A Sinetrol.com-on elmondottak szerint a vegyületről három klinikai vizsgálatban bebizonyosodott, hogy javítja a testösszetételt és a zsírvesztést. Egy tanulmányban, amelyben 77 túlsúlyos és elhízott alany vett részt, az alanyok átlagosan 63%-kal csökkentették túlsúlyos testtömegüket. és napi 180 kalóriát égetett el a Sinetrol bevétele után. Az alanyok szintén jelentősen megnövelték a sovány tömeget, ami egészségesebb testösszetételhez vezetett.

Az is igaz, hogy a barna zsír metabolikusan aktívabb, mint a fehér zsír, így valószínűleg több kalóriát éget el nyugalomban. Amint azt ebben a 2009-ben publikált tanulmány kifejti Cukorbetegség, a metabolikusan aktív barna zsírszövet (barna zsír) hozzájárul az energiafelhasználáshoz. Valójában a barna zsír egy túlélési mechanizmus. Az energiát hőként oszlatja el, és befolyásolja a napi energiafelhasználást, így értékes a fogyás szempontjából.

A cAMP Boost a paradicsomszemek szabadalmaztatott formáját tartalmazza, a CaloriBurn nevet. Ahogy a nevéből sejthető, a CaloriBurn kifejezetten a paradicsomszemek zsírégető hatásának fokozására készült. Ebben a 2014-es tanulmányban a kutatók négy hétig paradicsomszemeket adtak a résztvevőknek. Bár a kutatók nem figyeltek meg jelentős súlycsökkenést a placebóhoz képest, a kutatók azt tapasztalták, hogy a paradicsomszemek növelik az egész test energiafelhasználását. Ezen eredmények alapján a kutatók arra a következtetésre jutottak, hogy a paradicsomszem kivonat hatékony és biztonságos eszköz lehet a testzsír csökkentésére. A résztvevők 30 mg paradicsomszem kivonatot vettek be naponta, ami valamivel kevesebb, mint a paradicsomszemek 40 mg-os kivonata mindegyikben. cAMP Boost kapszula.

Összességében a cAMP Boost olyan összetevőket és adagokat tartalmaz, amelyek bizonyítottan segítik a fogyást. Bár a Nutraville nem fejezte be kifejezetten a cAMP Boost klinikai vizsgálatait, a cég számos tanulmányt kapcsolt be, amelyek bizonyítják, hogy a cAMP Boost összetevői segíthetnek a fogyásban.

CAMP Boost Pricing

A cAMP Boost palackonként 67 dollárba kerül, bár több egység rendelése esetén az ár 41 dollárra esik.

  • 1 palack: 67 USD + 9,95 USD szállítás
  • 3 palack: 171 USD + ingyenes szállítás
  • 6 palack: 246 USD + ingyenes szállítás

Minden üveg 30 napos készletet tartalmaz (60 kapszula). Naponta kétszer vegyen be egy kapszulát a PDE-4 gátlására, a cAMP aktiválására és a fogyásra.

CAMP Boost visszatérítési szabályzat

Az eredeti vásárlás dátumától számított 365 napon belül kérheti a vásárlás teljes visszatérítését (az eredeti szállítási költségek nélkül).

Ha nem fogyott jelentős mértékben a cAMP Boost szedése közben, vagy bármilyen okból elégedetlen a kiegészítés eredményeivel, akkor kérdés és probléma nélkül kérheti a teljes visszatérítést.

A Nutraville-ről

A cAMP Boost a Nutraville nevű táplálék-kiegészítő cég gyártja. A Nutraville székhelye a kaliforniai Valenciában található. A cég három kiegészítőt gyárt, köztük az Amyl Guard, a Gluta Raise és a cAMP Boost.


Anyagok és metódusok

Fehérje expressziója és tisztítása

A humán PKG Iβ-t (92�) kódoló DNS-szekvenciát pQTEV-be klónoztunk [33]. A fehérjét a BL21-ben (DE3) termelték E. coli amelyeket 37ଌ-on termesztettek OD-ig600 0,6, majd 0,4 mM IPTG-vel indukáltuk. A tenyészeteket további 18 órán át 18°000°C-on növesztettük. A sejteket 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7,9) oldatban szuszpendáltuk, és sejtroncsoló (Constant Systems) alkalmazásával lizáltuk. A His-címkével ellátott PKG Iβ-t (92�) BioRad IMAC gyantával tisztítottuk Bio-Rad Profinia™ tisztítórendszeren. A fehérjét 250 mM imidazolt tartalmazó sejtszuszpenziós pufferrel eluáltuk. A mintát 1,0 mg/ml TEV proteázzal inkubáltuk 4°C-on 48 órán át, hogy eltávolítsuk a His-címkét. A fehérjét tovább tisztítottuk Q Sepharose HP-vel, majd gélszűréssel Hi-load 16/60 Superdex-75 oszlopon (GE Healthcare) 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM és 1 mM TCEP-HCl elegyben.

Kristályosodás

A részleges apo-kristályok kristályosításához a fehérjemintát 20 mg/ml-re koncentráltuk 10 kDa cut-off Amicon Ultra (Millipore) alkalmazásával. A részleges apo kristályokat gőzdiffúziós módszerrel állítottuk elő 1,4 M nátrium/kálium-foszfátban (pH 5,6) 22°C-on. A kristályoptimalizálást Orxy6™ robottal (Douglas Instruments LTD) végeztük. A bipiramidális kristályok 1,4 M nátrium/kálium-foszfát oldatban (pH 8,1) 22°000°C-on 2 nap alatt megjelentek. A cGMP-vel való együttkristályosítást úgy végeztük el, hogy cGMP-t (Aral Biosynthetics) adtunk 5 mM végkoncentrációig a tisztított fehérjemintához, amelyet azután 33 mg/ml-re töményítettünk 10 kDa-os küszöbértékű Amicon Ultra (Millipore) alkalmazásával. A PKG Iβ:cGMP komplex kristályait gőzdiffúziós módszerrel állítottuk elő 0,1 M nátrium-malonátban (pH 5,0), 12% PEG 3350-ben 4°000°C-on. Hasonlóképpen, a cAMP-vel való együttkristályosítást úgy hajtjuk végre, hogy a fehérjemintához 5 mM végső koncentrációban cAMP-t adunk, amelyet 10 kDa-os Amicon Ultra (Millipore) határértékkel 17 mg/ml-re koncentrálunk. A PKG Iβ:cAMP komplex kristályait gőzdiffúziós módszerrel állítottuk elő 1,4 M nátrium/kálium-foszfátban (pH 5,6) 4°C-on.

Az összes kristályt krioprotektáns oldatba (25% glicerin) vittük át, és folyékony nitrogénben gyorshűtöttük. A röntgendiffrakciós adatokat a 8.2.1 sugárvonalon gyűjtöttük (Advanced Light Source, Berkeley, CA, USA). A diffrakciós adatokat a HKL2000 segítségével dolgoztuk fel és skáláztuk, így elfogadható adatsort kaptunk kielégítő összesített statisztikákkal (1. táblázat).

A PKG Iβ (92�):cAMP kristályszerkezetét molekuláris helyettesítéssel határozták meg a PKA RIα (91�) (PDB: 1RGS) csonka modelljének felhasználásával molekuláris helyettesítő szondaként [8]. Az ezt követő fázisozást, sűrűségmódosítást és modellépítést a phenix.autosol-lal végeztük [34]. Az eredményül kapott modellt manuálisan kiegészítették Cootban [35], és a TLS finomítást megvalósító visszafogott szerkezet-finomítás [36] cAMP modellt eredményezett R-vel.munka és Ringyenes 20.6% és 23.0%. A 2.9-es Å PKG Iβ(92�):cGMP komplex finomítását PHENIX (dev-403) [10]-ben végeztük, a nagyobb felbontású cAMP komplexből származó referencia-diéder korlátozások felhasználásával, a következő részben leírtak szerint. . A nagyobb felbontású referenciamodell finomításban való használata javította az R és R-mentes értékeket, valamint a MolProbity validálási kritériumokat, így a végső modell R-vel készült.munka és Ringyenes 20.4% és 26.0% [37]. Az összes Fo-Fc Az ábrákon látható kihagyási térképeket szimulált annealing kihagyási térképeket hoztunk létre, kihagyva minden ligandum körül egy 2 Å határú régiót, ahogy azt Terwilliger és mtsai [38] leírták.

Referenciamodell-finomítás a phenix.refine-ben

A finomítási stabilitás és a kapcsolódó modellminőség javítása érdekében kis felbontású finomításban a cGMP és a részleges apo struktúrákat finomítottuk phenix.finomítani a nagyobb felbontású PKG Iβ:cAMP struktúrából nyert diéderes korlátozások felhasználásával. Ha az abszolút szögeltérés egy felhasználó által meghatározott küszöbértéken belülre esett, akkor a referenciamodellből kapott diéderes korlátozásokat alkalmaztuk a munkamodellre. Ehhez a finomításhoz 15° küszöbértéket használtunk. Ezek a korlátozások a modell általános topológiájának irányítását szolgálták, miközben elkerülték a nagy felbontású modell indokolatlan torzítását. A finomítási séma koncepciójában hasonló a SHELXL-ben elfogadott nem-kristályos szimmetria-korlátozásokhoz és a következő hivatkozásban bevezetett deformálható rugalmas hálózati megközelítéshez [39].

Izotermikus titrálásos kalorimetria

A maradék cAMP eltávolítása érdekében az összes mintát denaturáltuk 6 M guanidin-HCl-ben 24 órán át 4°000°C-on végzett inkubálással, majd lépésenkénti dialízissel renaturáltuk először 2 M, majd 0,5 M guanidin HCl-lel szemben 48 órán keresztül. A mintákat ezután 10 mM Tris (pH 8,0) és 150 mM NaCl oldatban tisztítottuk Hi-load 16/60 Superdex 75 oszlopon (GE Healthcare). A cAMP és a cGMP PKG Iβ (92�) kötődésének kalorimetriás mérését VP-ITC kaloriméterrel (MicroCal LLC, Northampton, MA) végeztük. A fehérjét a minta cellába helyeztük 15 x 000 b5 M koncentrációban az oszloppufferben. Ciklikus nukleotidokat helyeztünk az injekciós fecskendőbe 250 x 000 b5 M koncentrációban. Az injekció térfogata 5 x003 bcl volt. Az adatokat az Origin szoftverrel dolgozták fel, a gyártó által biztosított egyedi kiegészítés ITC alrutinnal. A közölt eredményeket legalább kétszer megismételték.

Protein adatbank csatlakozási kódok

Az itt leírt struktúrák koordinátáit a Protein Data Bankban helyeztük el 3OD0, 3OCP és 3OGJ hozzáférési kódok alatt a PKG Iβ:cGMP, PKG Iβ:cAMP, illetve a részleges apo struktúrákhoz.


A második hírvivők szerepe és funkciói | Farmakodinamika

A cikk elolvasása után megismerheti a másodlagos hírnökök szerepét és funkcióit.

Számos hormon, neurotranszmitter, autacoid és gyógyszer specifikus membránreceptorokra hat, aminek közvetlen következménye a receptor citoplazmatikus komponensének aktiválódása, amely lehet egy enzim, például adenilát-cikláz, guanilát-cikláz, vagy egy transzportrendszer aktiválódása vagy a receptor megnyitása. egy ion-csatorna.

Ezeket a citoplazmatikus komponenseket, amelyek továbbítják a receptorok ingerét, másodlagos hírvivőknek nevezzük, az első hírvivő pedig maga a receptor. Másodlagos hírvivők például a cAMP, cGMP, ca 2+, G-proteinek, IP3, DAG stb.

A cAMP második hírvivő szerepét először Sutherland munkája tárta fel az 1950-es évek végén. Ez a felfedezés lebontotta a biokémia és a farmakológia között fennálló korlátokat. A cAMP egy nukleotid, amelyet a sejtben ATP-ből szintetizálnak az adenilát-cikláz hatására, válaszul számos receptor aktiválására. A foszfodiészteráz enzim hatására 5′-AMP-vé történő hidrolízissel inaktiválódik.

A cAMP változatos szabályozó hatást fejt ki a sejtfunkciókra, például az energiaanyagcserére, a sejtosztódásra és a sejtdifferenciálódásra, az iontranszportra, az ioncsatorna funkcióra, a simaizom kontraktilitására stb. Ezeket a változatos hatásokat egy közös mechanizmus, nevezetesen a sejtek aktiválása idézi elő. különböző protein kinázok cAMP segítségével.

Számos különböző gyógyszer, a neurotranszmitterek hormonja fejti ki hatását az adenilát-cikláz katalitikus aktivitásának növelésével vagy csökkentésével, és ezáltal csökkenti vagy emeli a cAMP koncentrációját a sejten belül. A sejt cAMP szintje a foszfodiészteráz metabolizáló enzim gátlásával is megemelhető.

A ciklikus guanozin-monofoszfát egy másik intercelluláris hírvivő, amelyet a guanilát-cikláz enzim szintetizál a GTP-ből. Szívsejtekben, hörgő simaizomsejtekben és más szövetekben azonosították. A legtöbb előidézett hatás esetében úgy tűnik, hogy a cAMP stimuláló, míg a cGMP gátló jellegű.

Ha a cAMP és a cGMP rendszerek is jelen vannak egyetlen sejtben vagy szövetben, akkor receptorokhoz kapcsolódnak, amelyeken keresztül a gyógyszerek ellentétes hatást fejtenek ki. Például a szívszövet sejtjeiben a β-adrenoceptorok növelik a kontrakció gyakoriságát és erejét a cAMP-szint növelésével, míg a kolinerg receptorok ellentétes hatást fejtenek ki a cGMP-szint növelésével.

Az IP3 és a DAG rendszer egy másik fontos intracelluláris másodlagos hírvivő rendszer, amelyet először Michell azonosított 1975-ben. Mindkettő a membránfoszfolipidek lebomlási terméke egy foszfolipáz C enzim által. IP3 nagyon hatékonyan felszabadítja a kalciumot az intracelluláris raktárakból.Erről a Ca 2+-ról ismert, hogy szabályozza a különböző enzimek, kontraktilis fehérjék és ioncsatornák működését.

A DAG közvetlenül aktiválja a protein kináz C-t és szabályozza számos intracelluláris fehérje ammósavainak foszforilációját. Ez hormonok felszabadulását okozza az endokrin mirigyekből, vagy modulálja a neuro- és shytranszmitter felszabadulását, vagy modulálja a simaizom összehúzódási képességét vagy a gyulladásos válaszokat vagy az iontranszportot vagy a tumor promócióját stb. Legalább hat különböző típusú PKC létezik, amelyek egyenlőtlenül oszlanak el a különböző sejtekben.

Más enzimek, a foszfolipáz A aktiválása2 arachidonsav termelődéséhez vezet a membrán foszfolipideiből, amelyek tovább bomlanak prosztaglandinokká, leukotriénekké, tromboxánokká stb.

Jól ismertek lokális hormonként betöltött szerepükről, de érdekes, hogy magáról az arachidonsavról és metabolitjairól a közelmúltban kimutatták, hogy intracelluláris, hírvivőként működnek, szabályozva a káliumcsatorna működését bizonyos neuronokban.

A kalciumionok nagy jelentőséggel bírnak sok más intracelluláris másodlagos hírvivő között. Számos szabályozó hatást az intracelluláris szabályozó fehérjéhez, a kalmodulinhoz kötődő Ca 2+ közvetít. A Ca 2+ ionok az aktivált foszfolipázok által a membrán foszfolipidekből történő arachidonsav felszabadulásában is részt vesznek, és így beindítják a prosztaglandinok és leukotriének szintézisét. Kimutatták, hogy a PKC-vel szinergizmusban lévő Ca 2+ aktiválja a sejtfunkciókat, például a hepatocita glikogenolízist, az inzulin felszabadulását a hasnyálmirigyből. A Ca 2+ a test váz- és simaizomzatának összehúzódásában és relaxációjában is fontos szerepet játszik.

A G-fehérjék a sejtszervezet középvezetői szintjét képviselik, és képesek kommunikálni a receptorok és az effektor enzimek vagy ioncsatornák között. A guanin nukleotidokkal, a GTP-vel és a GDP-vel való kölcsönhatásuk miatt G-fehérjéknek nevezték őket.

A G-fehérjék a plazmamembrán citoplazmatikus felületéhez kötődnek. Ezek heterotrimer molekulák, amelyek 3 α, β és γ alegységből állnak (3.10. ábra). Stimulálóként vagy gátlóként való besorolásuk az eltérő α alegységük azonosságán alapul.

A β és γ alegységek β γ komplexként kapcsolódnak a membrán citoplazmatikus felületéhez, amikor a rendszer inaktív vagy nyugalmi állapotban van, a GDP az α alegységhez kötődik.

Amikor egy agonista kölcsönhatásba lép a receptorral, ez megkönnyíti a GTP kötődését az α alegységhez, és elősegíti a GDP disszociációját a helyéről. A GTP kötődése aktiválja az α alegységet, és az α-GTP ezután úgy gondolja, hogy disszociál a β-tól, és kölcsönhatásba lép egy membránhoz kötött effektorral.

A folyamat akkor fejeződik be, amikor a GTP hidrolízise GDP-vé történik az α-alegység GTpáz aktivitásán keresztül. A kapott α-GDP ezután disszociál az effektorból, és újra egyesül a β γ-val, befejezve a válaszciklust. Az alegység effektormolekulához való kapcsolódása valójában növeli annak GTpáz aktivitását, ennek a növekedésnek a mértéke a különböző típusú effektorok esetében eltérő.

Az ilyen típusú mechanizmusok általában amplifikációt eredményeznek, mivel egyetlen agonista receptor komplex több G-protein molekulát képes aktiválni egymás után, és ezek mindegyike elég hosszú ideig kapcsolódhat az effektor enzimhez ahhoz, hogy sok molekula terméket hozzon létre.

A termék gyakran egy második hírvivő, és további amplifikáció következik be, mielőtt a végső sejtválasz létrejön. Ez egy szervezet biológiai adaptációja transzmitter anyagainak megfontolt felhasználásához.

A G-fehérjék nem mindegyike azonos, különösen az α-alegység mutat változékonyságot. Úgy gondolják, hogy a G-proteinnek három fő fajtája van, ti. Gs, Gén és Gq. Gs a Gi pedig stimulálja, illetve gátolja az effektor rendszert (3.11. ábra). Nem szokatlan, hogy egy egyedi sejtben több receptor aktivál egyetlen G-fehérjét és egyetlen receptort, amely egynél több G-fehérjét szabályoz.


Nézd meg a videót: 9 gyakori Hólyag probléma + a megoldásuk (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Lany

    You just visited brilliant idea

  2. Lamandre

    Ma sokat olvastam erről a kérdésről.

  3. Vasile

    Elnézést kérek a beavatkozásért, szeretnék egy másik megoldást javasolni.

  4. Fagan

    Megtörténik. Kommunikálhatunk ezen a témán. Itt vagy PM -nél.

  5. Leopoldo

    What would we do without your excellent phrase

  6. Beacan

    Gratulálok, a gondolkodásod egyszerűen kiváló

  7. Kagazshura

    This post really helps me make a very important decision for myself. For which special thanks to the creator. I look forward to new posts from you!



Írj egy üzenetet