Információ

Állandó vagy változó számú chiasma a rekombináció során?

Állandó vagy változó számú chiasma a rekombináció során?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

A rekombináció során konzisztens-e a chiasmaták száma az egyes ivarsejtekben, és konzisztensek-e a chiasmata régiók egyetlen szervezeten belül?


A chiasma vagy crossing over (CO-k) eloszlása ​​és száma nagymértékben változik. A chiasma sejtenkénti összszáma ugyanazon organizmuson belül változhat. Ahol a chiasma a kromoszóma mentén fordul elő, szintén nem következetes a sejtről sejtre. A hotspotok 1-2 kb méretű régiók, amelyek magasabb rekombinációt tapasztalnak a szomszédos genomi régiókhoz képest. A CO-k megoszlását úgy képzelhetjük el, hogy a rekombináció ~80%-a olyan hotspotokban történik, amelyek a genom ~10%-át teszik ki.

A rekombináció a kromatin kontextusától függ, ezért a chiasmák ritkán fordulnak elő a centroméra közelében, és a pozitív interferencia azt eredményezi, hogy a chiasma a kromoszóma mentén eloszlik. A sejtenkénti teljes chiasmata szám jó előrejelzése kromoszómánként legalább 1. Egyes kutatók azzal érvelnek, hogy kromoszómakaronként egy CO pontosabb.

Az alábbiakban egy link egy jó cikkre mutat, amely bemutatja, hogy a rekombináció hogyan változik az emberekben. http://www.nature.com/nrg/journal/v8/n1/abs/nrg1947.html


A Chiasmata és a Dam1 kinetochore komponens kulcsfontosságú a hibás kromoszóma-csatlakozások és a centromer oszcilláció kiküszöbölésében az I. meiózisban

Az orsóhoz való megfelelő kromoszóma-csatlakozások kialakítása megköveteli a hibás kapcsolódások kiküszöbölését, de ennek a folyamatnak a mechanizmusa nem teljesen ismert. Az I. meiózis során a testvérkromatidák ugyanahhoz az orsópólushoz kapcsolódnak (mono-orientált kapcsolódás), míg a homológ kromoszómák az ellenkező pólusokhoz kapcsolódnak (bi-orientált kapcsolódás), ami homológ kromoszóma-szegregációt eredményez. Itt megmutatjuk, hogy a homológ kromoszómákat és a Dam1 kinetochore komponenst összekapcsoló chiasmák döntő fontosságúak a hasadási élesztőben az I. meiózisban lévő orsó pólusai közötti hibás kapcsolódások és centromerek oszcillációjának kiküszöbölésében. A chiasma-képző sejtekben a Mad2 és Aurora B kináz, amely időt biztosít a kötődés korrekciójára és destabilizálja a hibás kapcsolódásokat, a testvérkromatidák bi-orientált kötődésének megszüntetését okozta, míg a chiasma-hiányos sejtekben a mono-orientált mellékleteket. A chiasma-képző sejtekben emellett a homológ centromer oszcillációt is koordinálták. Ezenkívül a Dam1 hozzájárult a kötődés megszüntetéséhez mind a chiasma-képző, mind a chiasma-hiányos sejtekben, és elősegítette a centromer oszcillációját. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a chiasmata megváltoztatja a kötődési korrekciós mintákat azáltal, hogy lehetővé teszi a hibajavító tényezőket a testvérkromatidák bi-orientált kötődésének kiküszöbölésére, és arra utalnak, hogy a Dam1 indukálja a hibás kötődések megszüntetését. A chiasmata és a Dam1 egybeeső hozzájárulása a centromer oszcillációjához szintén potenciális kapcsolatra utal a centromer oszcillációja és a kötődés megszüntetése között.

1. Bemutatkozás

A kromoszómák hűséges szegregációja a sejtosztódás során elengedhetetlen a genom integritásához. A szomatikus sejt osztódása (mitózis) során a megkettőződött kromoszómák (testvérkromatidák) mikrotubulusokon (MT) keresztül kapcsolódnak az orsó ellentétes pólusaihoz (bi-orientált kapcsolódás), és elkülönülnek egymástól (egyenlet szerinti szegregáció). Egy ilyen osztódás két genetikailag azonos leánysejtet hoz létre (1a, mitózis) [2]. Ezzel szemben a csírasejt két egymást követő osztódása közül az első (meiózis) során a homológ kromoszómák az ellentétes pólusokhoz kapcsolódnak, és elkülönülnek, ami az eredeti kromoszómák számának felét tartalmazó ivarsejtek keletkezéséhez vezet (1.a, meiosis I).

1. ábra: A hibajavítási károsodás hatása a testvérkromatid szegregációra az I. meiózisban.a) A kromoszómák szerveződését, orsós kötődését és szegregációját mutatjuk be mitózisban és meiózisban I. (b) Hipotézis a hibajavító mechanizmus szerepére vonatkozóan a testvérkromatidák orsós kapcsolódásában chiasma jelenlétében és hiányában. Pontozott körök, hibajavító mechanizmussal javított mellékletek. (c) A testvérkromatidák GFP-vel vizualizált centromereinek szegregációs mintázata zigótákban és pat1 haploid sejtek. (d,e) Egyenlet szerinti szegregációs frekvenciák az I meiózisban rec12 + (d) és rec12Δ sejtek (e). (f) A 2. kromoszóma egyenlet szerinti szegregációja az I. meiózisban pat1 haploid sejtek. Az pat1 A haploid sejteket a párosodó feromon jelátviteli útvonal aktiválásával, majd a Pat1 kináz restrikciós hőmérsékleten történő inaktiválásával kényszerítették a meiózisba, mindkettőre szükség van a testvérkromatidák redukciószerű szegregációjának indukálásához haploid sejtekben [1]. Ban ben (df), a kromoszóma szegregációt több mint 50 sejtben elemezték, és az oszlopok több mint három független kísérlet átlagait mutatják. cen1, 1. kromoszóma cen2, kromoszóma 2 +, nincs más mutáció. Szaggatott vonalak (d,e) megkülönbözteti a következőre vonatkozó eredményeket cen1 és cen2. A hibasávok standard hibákat mutatnak. *p < 0,05**p < 0,005 (Diák t-teszt). A hibajavításban jártas (+) és a hibajavításban hibás (mad2Δ és bárka1-úgy) sgo1Δ cellák láthatók.

A megfelelő kötődések dinamikus folyamaton keresztül jönnek létre [3–6]. A kromoszómák véletlenszerűen kapcsolódnak az orsóhoz a kinetokorokon keresztül, amelyek fehérjekomplexek, amelyek centromereken állnak össze [7–9]. A kinetokorok kezdetben az orsó MT-jéhez kapcsolódnak az oldalsó oldalukon, majd a végükön. A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az Ndc80 és a Dam1/DASH komplexek (gerincesekben a Ska-komplexusok) végződéseket képeznek, és az MT szétszerelését a centromer mozgásához kapcsolják. A kezdeti kötődés véletlenszerű természete miatt a testvérkromatidák vagy homológ kromoszómák gyakran tévesen kapcsolódnak ugyanahhoz a pólushoz (monoorientált kötődés) a mitózisban, illetve az I. meiózisban. Ezek a hibás mono-orientált kötődések instabilok, és végül megszűnnek a kromoszómákból, majd megismétlik a kapcsolódási és leválási folyamatokat, amíg megfelelően nem tapadnak az orsóhoz. Ezenkívül a csatlakozás létrejötte során a centromerek folyamatosan oda-vissza mozognak az orsó pólusai között, az MT szétszerelése által a kinetochorekban generált erők hatására [4–6,10]. Továbbra sem világos azonban, hogy a centromerek oszcillációja során hogyan küszöbölhetők ki szelektíven a hibás kapcsolódások.

Széles körben elterjedt az a vélemény, hogy a megfelelő kötődés a feszültség révén jön létre [11,12]. A mitózis során a bi-orientált testvérkromatidák az ellentétes pólusok felé húzódnak, és a húzóerők feszültséget keltenek, mivel a testvéreket a cohesin nevű fehérjekomplex tartja össze [13]. A jelenlegi modellben ez a feszültség stabilizálja a bi-orientált rögzítést, míg a feszítés nélküli mono-orientált rögzítés instabil és kiküszöbölhető. Hasonlóképpen, az I. meiózisban, mivel a homológ kromoszómákat rekombinációs termékek, az úgynevezett chiasmata kötik össze, bi-orientált kötődésük feszültséget generál, amiről azt gondolják, hogy stabilizálja a kötődéseket [2,11,12].

Számos tényezőt azonosítottak a hibás csatolásokat kijavító mechanizmus összetevőiként. Az orsó összeállítási ellenőrzőpont (SAC) faktorai gátolják az anafázis kialakulását, időt biztosítva a hibás kapcsolódások kijavítására (pl. [14]), az Aurora B kináz pedig destabilizálja a hibás kapcsolódásokat azáltal, hogy foszforilálja a kinetochore komponenseket, beleértve az Ndc80-at és a Dam1-et [3,15–17]. . Következetesen az SAC útvonal vagy az Aurora B kináz károsodása növeli a hibás kapcsolódások gyakoriságát mind a mitózisban, mind a meiosis I-ben [18–26]. Az Aurora B kináz feldúsulása a belső centromer régióban, a külső kinetokor alatt azt sugallja, hogy a külső kinetokorok feszültségfüggő térbeli elválasztása a belső centromertől akadályozza az Aurora-függő külső kinetokor foszforilációt, ezáltal stabilizálja a kötődéseket,27 ].

Bár a feszültségtől függő stabilizálás jelenleg a kötődés kiválasztásának széles körben elfogadott modellje, nem tudja könnyen figyelembe venni a kötődés kiválasztását a meiózis során. Az I. meiózisban a homológ kromoszómák az ellentétes pólusokhoz, míg a testvérkromatidák ugyanahhoz a pólushoz kapcsolódnak. A testvérkromatidák mono-orientált kapcsolódása szintén kulcsfontosságú a homológ kromoszóma szegregáció szempontjából. A hasadó élesztőben Schizosaccharomyces pombe, a testvér centromerek gyakran bi-orientáltak, és átmeneti hasadáson mennek keresztül [28]. Bár ezek a kötődések feszültséget keltenek, végül megszűnnek. Ezen túlmenően az egér petesejtekben a megfelelő kötődések kialakulása nem korrelál a kinetokoroknál keletkező feszültséggel, sőt, úgy tűnik, hogy a feszültség nem okozza a kinetokorok térbeli elkülönülését az Aurorával dúsított régiótól [20]. Így a kötődés kiválasztása az I. meiózisban még mindig rejtélyes.

Az I. meiózisban a chiasma döntő fontosságú a homológ kromoszómák bi-orientált kapcsolódásában. Korábban azonban beszámoltunk arról, hogy ben S. pombe, a chiasma a testvérkromatidák mono-orientált kötődéséhez is hozzájárul azáltal, hogy megakadályozza bi-orientált kötődésüket [28]. Továbbra sem világos, hogy a chiasma hogyan akadályozza meg a testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódását. Itt részletesebben megvizsgáltuk a bi-orientált kötődés chiasma-függő megelőzését, és azt találtuk, hogy a chiasma lehetővé tette a hibajavító tényezőket a testvérkromatidák bi-orientált kötődésének és a koordinált homológ centromer oszcillációnak a kiküszöbölésére. Ezenkívül azt találtuk, hogy a Dam1 kinetochore fehérje hozzájárult a kötődés korrekciójához, és elengedhetetlen volt a centromer oszcillációjához. Ezek az eredmények demonstrálják a kromoszóma szerveződésének és a kinetochore aktivitásának fontosságát a hibás kötődések kiküszöbölésében, és feltárják a centromer oszcillációja és a kötődés eliminációja közötti lehetséges kapcsolatot.

2. Eredmények

2.1. A Chiasmata megváltoztatja a hibajavító mechanizmus hatásait a testvérkromatid szegregációra

Korábban beszámoltunk arról, hogy a testvérkromatidák gyakran kapcsolódnak az orsó ellentétes pólusaihoz, és a chiasma megakadályozza ezeket a kapcsolódásokat [28]. Feltételeztük, hogy a chiasma megváltoztatja a hibajavító mechanizmus által kiküszöbölhető kötődési típusokat úgy, hogy chiasma jelenlétében a mechanizmus szelektíven kiküszöböli a testvérkromatidák bi-orientált kötődését, ezáltal megtartja a mono-orientált kötődést, ellentétben a mitózis helyzetével. (1.ábrab, chiasmatával). Ha igen, a hibajavító mechanizmus károsodása növeli a bi-orientált kötődés gyakoriságát a chiasma-képző sejtekben a hibás elimináció miatt. Ezzel szemben azokban a sejtekben, amelyekben nincs chiasma, a hibajavító mechanizmus szelektíven kiküszöböli a testvérkromatidák mono-orientált kötődését, mint a mitózisban (1.b, chiasmata nélkül), és a hibajavítási károsodás növeli mono-orientált kötődésüket.

Ennek az ötletnek a teszteléséhez veszélyeztettük a hibajavító mechanizmust, és kiértékeltük a testvérkromatidák orsó-csatlakozását chiasma-képző és chiasma-hiányos sejtekben. A hibajavító mechanizmus veszélyeztetése érdekében bevezettük a mad2Δ mutáció vagy a bárka1-úgy mutáció, amely elnyomja a meiotikus expressziót bárka1 gén, amely a hasadó élesztő Aurora B kinázát kódolja [25]. Az mad2Δ úgy gondolják, hogy a mutáció csökkenti a helytelen kapcsolódások kijavítására rendelkezésre álló időt azáltal, hogy veszélyezteti a SAC útvonalat, míg a bárka1-úgy a mutáció rontja a kötődés eliminációját és megakadályozza a SAC aktiválódását. A kötődések értékeléséhez megvizsgáltuk a testvérkromatid szegregációt az 1. kromoszóma egyik homológjának centromer-proximális lokuszának megjelenítésével (cen1) vagy 2 (cen2) a lacI/lacO felismerő rendszer segítségével (1. ábrac) [1,29]. Ebben az elemzésben töröltük a sgo1 gén, amely a hasadó élesztő két Shugoshin fehérje egyikét kódolja, amelyek specifikusan centromer kohézióvédőként működnek a meiózis során, és megakadályozzák az ellentétes pólusokhoz kapcsolódó testvérkromatidák elválasztását [28, 30–33].

A testvérkromatidák ellentétes pólusokhoz való szegregációja (egyenlet szerinti szegregáció) nagyon ritka volt minden sejttípusban. sgo1 + háttér (1. ábrad), megerősítve, hogy az Sgo1 megakadályozza a testvérkromatidok szétválását [28, 31, 32]. Ezzel szemben a sgo1Δ háttérben, bár az egyenlet szerinti szegregáció ritka volt a chiasma-képző sejtekben (1d), nagyon gyakori volt diploidban rec12Δ sejtek [28], amelyek nem képeznek chiasmát a Rec12 (hasadási élesztőben lévő Spo11 homológ) hiánya miatt, amely faktor a DNS kettős szálú törések kialakulásához szükséges (1. ábra).e, +) [34]. A gyakori egyenlet szerinti szegregációt nem a Rec12 funkciók elvesztése okozta, amint azt az a megfigyelés bizonyítja, hogy az egyenlet szerinti szegregáció gyakori volt a haploid meiotikus sejtekben is, amelyek nem képeznek chiasmát (1. ábra).c és f, +) [28]. Fontos, hogy a sgo1Δ háttér, bemutatása a mad2Δ vagy bárka1-úgy mutáció szignifikánsan növelte az egyenlet szerinti szegregáció százalékos arányát chiasma-képző diploid sejtekben (1. ábrad), de csökkentette a szegregációs százalékot a chiasma-hiányos diploidban rec12Δ (1.ábrae) vagy haploid meiotikus sejtek (1f). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a hibajavító mechanizmus csökkenti a testvérkromatidák bi-orientált kötődését chiasma jelenlétében, de fordítva, növeli a bi-orientált kötődést (ezáltal csökkenti a mono-orientált kötődést) chiasma hiányában. Korábbi vizsgálatunkban az egyenlet szerinti szegregációs gyakoriságokat cen1 valamivel magasabbak voltak a rec12Δ háttér [28], bár ennek oka ismeretlen. Azonban a mad2Δ mutáció hasonlóan csökkentette az egyenlet szerinti szegregációt, ami összhangban van jelenlegi eredményeinkkel.

2.2. A Chiasmata megváltoztatja a hibajavító mechanizmus hatásait a metafázis testvér-centromer felosztására

Ezt követően a testvérkromatidák bi-orientált kötődését próbáltuk közvetlenebb módon felmérni a testvérkromatidák tranziens hasadásának vizsgálatával, ami a bi-orientált kötődésük valószínű eredménye, amely gyakran a chiasma kialakulásától függetlenül előfordul [28]. A testvércentromerek metafázis alatti felhasadásának pontos értékeléséhez vizualizálással meghatároztuk a metafázis szakaszát S. pombe securin Cut2, az anafázis előtti szakasz biokémiai markere, amely a prometa/metafázis orsónál lokalizálódik (2. ábraa) [35]. Ezenkívül a finom centromer dinamika követése érdekében meghatároztuk a háromdimenziós pozíciókat cen2 az orsón nagy időbeli felbontással képek beszerzésével cen2 és az orsó pólusteste (SPB, a gomba centroszóma) több különböző fókuszsíkban körülbelül 3 másodpercenként (2. ábrab). Az SPB-t egy GFP-vel jelölt SPB komponens, a Sid4 (Sid4-GFP) [36] segítségével vizualizáltuk, de a Sid4 egy példányát címkézetlenül hagytuk a diploid sejtekben, mert élő sejtelemzéseinkben a GFP-vel jelölt Sid4 két példányát tartalmazó sejtek magas értéket mutattak. a testvérkromatidák egyenlet szerinti szegregációjának gyakorisága még a sgo1 + háttérben (az adatok nem láthatók), ami valószínűleg a Sid4 funkciójának károsodásából fakadt az anafázis kilépés szabályozásában [37,38]. A címkézetlen Sid4 egy példányának elhagyása nagyrészt megszüntette a szegregációs rendellenességeket, amint azt a testvérkromatid szegregációs minták mutatják a címkézetlen Sid4 egy példányát tartalmazó sejtekben, amelyek hasonlóak voltak a Sid4 jelölés nélküli sejtekben megfigyeltekhez (elektronikus kiegészítő anyag, S1 ábra).

2. ábra Centromer és SPB dinamika az I. metafázisban.a) A GFP-vel vizualizált centromerek és SPB-k, valamint az RFP-vel vizualizált Cut2 lokalizációja az I. metafázisban (balra), valamint a centromerek és az SPB-k kinagyított képe (jobbra), a bal oldali képen látható fehér dobozban. Rúd, 2 µm. (b) Centromer és SPB dinamika az I. metafázisban vad típusú sejtekben. A centromerek és SPB-k körülbelül 3 másodpercenként készített maximális vetületi képei balról jobbra kerültek. A nyílhegyek a testvér-centromerek szétválását jelzik. Rúd, 2 µm. (c) Változások a centromer és SPB pozíciókban az I. metafázisban különböző sejtekben. A bal oldali képek a centromerek kimográfját mutatják (cen2) és az SPB-k és a jobb oldali grafikonok a centroméra–SPB és SPB–SPB távolság változásait mutatják. A kimográfok függőleges és vízszintes sávjai 2 µm-t, illetve 30 s-t mutatnak. A nyilak jelzik a centromerek és az SPB együttes lokalizációját. (d) A bootstrap módszerrel kapott centroméra-hasadás centromerenkénti átlagos megfigyelési gyakorisága. A grafikon a centromerenkénti átlagos frekvenciákat mutatja. A szaggatott vonal különbözteti meg az eredményeket rec12 + és rec12Δ sejteket. A grafikon tetején zárójelben lévő számok a vizsgált centromerek számát jelzik. A hibasávok 95%-os konfidencia intervallumot jeleznek. *p < 0,05**p < 0,01 (Studentized bootstrap elemzés). n.s., nem jelentős. p-a > 0,05 és 0,1-nél kisebb értékek zárójelben jelennek meg.

Az I. metafázis során a centromerek oszcilláltak az orsó pólusai között a chiasmaképző vad típusú és a chiasma hiányában egyaránt rec12Δ diploid sejtek, amint azt korábban közöltük (2c elektronikus kiegészítő anyagok, S1 és S2 filmek) [28]. Mindkét sejttípusban a testvér-centromerek gyakran átmeneti hasadáson mentek keresztül, ami megerősíti korábbi megállapításunkat, miszerint a testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódása a chiasma kialakulásától függetlenül megtörténik (2.időszámításunk előtt) [28]. A testvércentromer hasítási gyakoriságok változtak (elektronikus kiegészítő anyag, S2A ábra), de a bootstrap módszerrel kapott centromerenkénti átlagos hasadási frekvenciák szignifikánsan magasabbak voltak rec12Δ sejtekben, mint benn rec12 + sejtekben (a különbség a szokásosnál is szignifikáns volt t-teszt, p < 0,01 2. ábrad, +). Korábbi jelentésünkben az átlagos hasadási gyakoriságok nem különböztek szignifikánsan [28], ez az eltérés a Sid4 címkézetlen másolatának tudható be ebben a tanulmányban. A chiasma-hiányos sejtekben a testvér-centromer felosztásának megnövekedett gyakorisága megerősíti, hogy a chiasma megakadályozza a testvérkromatidák bi-orientált kötődését.

Ban ben ark1-so rec12 + sejtekben az átlagos hasadási gyakoriság szignifikánsan magasabb volt, mint a rec12 + sejtekben, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy a testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódása fokozódott ezekben a sejtekben (2.d). Ezen túlmenően, bár a különbségek nem voltak szignifikánsak más mad2Δ vagy bárka1-úgy cellákban az átlagos hasadási frekvenciák általában magasabbak voltak a rec12 + háttérben és alacsonyabb a rec12Δ háttér (2. ábrad elektronikus kiegészítő anyagok, filmek S3–S6). Ezek a tendenciák összhangban voltak azzal az elképzeléssel, hogy ha a hibajavító mechanizmus károsodik, a testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódása a chiasma-képző sejtekben fokozódik, míg a chiasma-hiányos sejtekben csökken. A centromer mozgását vezérlő mechanizmus érintetlen ezekben a mutáns sejtekben, amint azt az is bizonyítja, hogy nincsenek jelentős különbségek az átlagos centromersebességekben, a centromer pozíciók átlagos szórásaiban és a centromerek (elektronikus kiegészítő anyag) átlagos négyzetes elmozdulásában (MSD) , S2B–D ábra).

A testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódásának nagyobb gyakoriságát a hibajavításban hibás, chiasmaképző sejtekben a homológ centromer pozíciók elemzése támasztotta alá (3. ábra).a). A vad típusú sejtekben a homológ centromerek többnyire közel párhuzamosan helyezkedtek el az orsó tengellyel (az orsótengelyhez képest 10°-nál kisebb szögben), míg mad2Δ vagy bárka1-úgy cellák helyzete gyakran ferde volt és nem párhuzamos (10°-nál nagyobb vagy egyenlő 3. ábrab). Ezenkívül a homológ centromerek hajlamosak voltak közelebb helyezkedni, amint azt a homológ centromerek átlagos távolságának csökkenése mutatja (3.időszámításunk előtt). Nevezetesen, homológ centromer kolokalizációt figyeltek meg a teljes megfigyelési idő 9,2%-ában bárka1-úgy sejtekben, de soha nem figyelték meg a vad típusú sejtekben (3d elektronikus kiegészítő anyag, S1 táblázat). Ezek a fenotípusok a homológ centromerekre kifejtett ellentétes pólus irányú erők csökkenését jelzik, ami valószínűleg a testvérkromatidák bi-orientált kapcsolódási gyakoriságának növekedését tükrözi. Ezt a nézetet alátámasztva a homológ centromerek időnként megváltoztatták pozíciójukat az SPB-hez képest úgy, hogy egymástól függetlenül oszcillálnak. bárka1-úgy cellák (6 kapcsolás 1643 másodperces megfigyelési idő alatt) (3. ábrad elektronikus kiegészítő anyag, S1 táblázat), amely az ellentétes erők közvetlen kifejtését jelzi az egyes homológ centromerekre.

3. ábra: Homológ centromer szögek és távolságok, valamint szétváló testvércentromerszögek. (a) A homológ centromerek orsóhoz viszonyított szöge és a köztük lévő távolság. A képen a ferde homológ centromerek reprezentatív képe látható. A fotón a fehér és piros szaggatott vonalak az orsó, illetve a homológ centromerek tengelyeit mutatják. (b) A homológ centromer szögek eloszlása ​​az orsóhoz viszonyítva (felső grafikonok) és a homológ centromerek átlagos szögeinek és távolságainak 2D diagramja az egyes cellákban (alsó grafikonok). (c) A homológ centromerek közötti átlagos távolságok átlaga sejtenként. Az oszlopok az egyes cellákban lévő átlagos távolságok átlagát mutatják. A rajzok a kötődések és a homológ centromer távolság közötti előrejelzett kapcsolatot mutatják. A fekete nyilak a kromoszómákra kifejtett erőket jelzik. *p < 0,05 (diáké t-teszt). n.s., nem szignifikáns (a zárójelben lévő szám azt mutatja p-érték). A diagram tetején zárójelben lévő számok a vizsgált cellák számát mutatják. A hibasávok a szabványos hibákat jelzik. (d) Homológ centromerek kolokalizációja és helyzetváltása in bárka1-úgy sejteket. A fotókon homológ centromerek kimográfja látható (cen2) és az SPB-k. A bal oldali képen látható piros pontozott négyzet a centromerek kolokalizációját jelzi. A jobb oldali képen látható piros nyilak a homológ centromer pozíciók váltását mutatják az SPB-khez képest. Vízszintes rúd: 30 s függőleges sáv: 1 µm. Vegye figyelembe, hogy a jobb oldali képen az SPB#2 életlen volt a megfigyelés végén. (e) A testvércentromerek felosztásának szöge és a köztük lévő távolság. A képen a testvércentromerek (nyílhegyek) és az SPB-k felosztása látható. A szaggatott vonalak jelzik az orsó tengelyeit (fehér) és a hasadó centromereket (sárga és piros). Rúd, 1 µm. A felső rajz bemutatja a szétváló centromerek orsótengelyéhez viszonyított szögét, „θ'. Az alsó rajz a ferde hasadó testvércentromerek előre jelzett MT-csatlakozását mutatja. (f) A hasadó testvércentromerek szögeinek eloszlása. (g) A szétváló testvércentromerek fokozott dőlése bárka1-úgy sejteket. Zöld sávok: 0° ≤ θ < 20° barna sávok: 20° ≤ θ < 60° kék sávok: 60° ≤ θ ≤ 90°. +, nincs más mutáció. Hatvan, 58, 132, 169, 22 és 109 hasadó testvércentromert vizsgáltak vad típusban, mad2Δ, ark1-so, rec12Δ, mad2Δ rec12Δ és ark1-so rec12Δ sejtek, ill.

Ezen eredmények mellett a hasadó testvér-centromerek helyzetének elemzése felvetette annak lehetőségét, hogy a testvérkromatidák mellett gyakran egyetlen kromatid is kapcsolódik mindkét pólushoz. Megfigyeltük, hogy a szétváló testvércentromerek gyakran különböző irányban dőltek el, néha majdnem merőlegesen az orsó tengelyére mindkét oldalon. rec12 + és rec12Δ cellák (3. ábrapéldául elektronikus kiegészítő anyag, S3 ábra), ami arra utal, hogy ezeknek a centromereknek az orsócsatlakozásai gyakran eltérnek az egyszerű bi-orientált rögzítéstől. Bevezetés a bárka1-úgy A mutáció növelte a szétváló testvércentromerek arányát, amelyek az orsó tengelyéhez képest merőleges szög felé dőltek mindkét esetben rec12 + és rec12Δ cellák (3. ábraf,g elektronikus kiegészítő anyag, S3 ábra), ami azt sugallja, hogy a hibajavító mechanizmus a chiasma kialakulásától függetlenül hozzájárul ezeknek a kötődéseknek a megszüntetéséhez. Tekintettel a homológ centromerek ferde helyzete és a testvér-centromerek bi-orientált kapcsolódása közötti összefüggésre, a felhasadozó testvércentromerek ferde helyzetei valószínűleg egyetlen centroméra bi-orientált kapcsolódásait tükrözték (merotelikus kötődés), valamint a testvér-centromerek bi-orientált kötődését tükrözték (ábra). 3e, alsó rajz).

Mindezeket az eredményeket együttesen figyelembe véve arra a következtetésre jutottunk, hogy a chiasmata megváltoztatja a kötődési korrekciós mintákat azáltal, hogy lehetővé teszi a hibajavító tényezőket, hogy kiküszöböljék a testvérkromatidák bi-orientált kötődését.

2.3. Chiasmata koordináta homológ centromer oszcilláció

Mivel úgy gondolják, hogy a hibajavító tényezők kiküszöbölik a feszültségmentes rögzítéseket, megpróbáltuk meghatározni, hogy a chiasma csökkenti-e a feszültséget a testvércentromerek között oly módon, hogy mérjük a testvérek közötti centroméra távolságokat az orsó tengelyére vetítve, ami valószínűleg a pólus irányú húzóerők által keltett feszültséget tükrözi (elektronikus kiegészítő). anyag, S3 és S4 ábra). A vad típusú sejtekben előrevetített távolságok két különálló eloszlási csoportot mutattak ki, amelyek különböző távolságtartományokat fedtek le, míg a távolságok rec12Δ A sejtek egyetlen eloszlási csoportot tártak fel (elektronikus kiegészítő anyag, S4C ábra). A vad típusú sejtekben a nagyobb távolsági tartományt lefedő eloszlási csoport többnyire a 2. ábrán látható egyetlen cella adatkészletéből származik (elektronikus kiegészítő anyag, S4C ábra, WT w/o). Ennek a konkrét adatkészletnek a meglététől vagy hiányától függetlenül azonban az átlagos vetített távolság a vad típusú sejtekben nem tért el szignifikánsan a rec12Δ cellák (elektronikus kiegészítő anyag, S4D ábra). Ezért nem tudtunk következtetést levonni arról, hogy a chiasmata megváltoztatja-e a testvér-centromerek közötti feszültséget.

Mivel elemzéseink során a feszültségváltozásokat nem tudtuk értékelni, a továbbiakban részletesebben megvizsgáltuk a centromer dinamikáját, hogy támpontot kapjunk a testvérkromatidák bi-orientált kötődésének chiasma-függő megszüntetésére. Megfigyeltük, hogy a chiasma-képző vad típusú sejtekben a homológ centromerek hajlamosak voltak ugyanabba az irányba és koordinált módon visszafordítani a mozgásokat, míg ez a tendencia nem volt nyilvánvaló a chiasma hiányában. rec12Δ sejteket. Valójában a homológ centromerek a megfigyelési idő 66,2%-ában és 46,7%-ában ugyanabba az irányba mozogtak vad típusú és rec12Δ cellák, illetve (4. ábraa) ez utóbbi százalék közel áll a véletlenszerű mozgás százalékához. Ezen kívül be bárka1-úgy sejtekben a centromerek gyakran elérték az SPB-t anélkül, hogy megfordították volna mozgásukat, és együtt lokalizálódtak vele (a megfigyelési idő 6,4%-ában volt megfigyelhető a kolokalizáció bárka1-úgy sejtekben, de soha nem vad típusú sejtekben 2. ábrac, bárka1-úgy, nyilak), jelezve, hogy a centromerek megfordítását befolyásolja az Aurora B aktivitásának csökkenése. Ezek a megfigyelések összefüggésre utalnak a centromer oszcilláció és a kötődés korrekciója között.

4. ábra: A homológ centromer mozgások és a centromer dinamikájának korrelációs elemzése az I. metafázisban.a) Homológ centromerek mozgási iránya. A kék és sárga sávok egy homológ centromerpár arányát jelzik, amelyek azonos, illetve ellentétes irányban mozognak. (b) A centromersebességek autokorrelációja (AC) és keresztkorrelációja (CC). Megjelenik a korrelációs értékek (AC vagy CC) és a centromer mozgások közötti kapcsolat. A kromoszómák feletti nyilak mutatják a centromer mozgásának irányát. (c) A centromersebességek ACF és CCF vad típusú és rec12Δ sejteket. A kék vonalak és a piros pontozott vonalak a bootstrap módszerrel kapott átlagos korrelációs értékeket és 95%-os konfidencia intervallumokat jelzik. (d) p-az ACF és CCF értékek értékei a jelzett időpontokban. (e) p-értékek között CCF értékek a vad típusú és rec12Δ cellákat a jelzett időpontokban. Csillagok a (d,e) jelentős eltéréseket jeleznek. A vizsgált sejtek száma és a teljes megfigyelési idő (zárójelben) a következő. Vad típusú: 14 sejt (1326,8 s) rec12Δ: 11 cella (1193,4 s).

A homológ centromer oszcilláció chiasma-függő koordinációjának megerősítésére kvantitatív módon jellemeztük a centromer mozgásokat a korrelációs függvény segítségével, amely hasznos a centromer oszcilláció jellemzésére (pl. [39–41]). Pontosabban, az összes megfigyelt sejtből kapott SPB-hez viszonyított centromer sebességeket gyűjtöttük, és kiszámítottuk a korrelációs együtthatókat a különböző késleltetési időkkel elválasztott sebességek között (4. ábra).b). A vad típusú sejtek autokorrelációs görbéje csökkent és negatív értéket ért el, bár kicsi, a negatív érték 35 másodperc körül volt statisztikailag szignifikáns (4. ábra).CD, WT). Ez azt jelzi, hogy a centromer mozgások körülbelül 35 másodperc alatt megfordulnak a chiasma-képző vad típusú sejtekben (4.b, jobb felső). Az automatikus korrelációs diagramok rec12Δ a sejtek is hasonló mintázatot mutattak, ami azt jelzi, hogy a centromerek oszcillálnak a chiasma hiányában rec12Δ cellákat hasonló módon (4. ábrac,d, rec12Δ). Így a centromerek a két SPB között gyenge, de jelentős periodicitással, chiasma-független módon oszcillálnak.

Ezt követően keresztkorrelációs analízissel megvizsgáltuk a homológ centromerek sebességei közötti összefüggést. A vad típusú sejtek keresztkorrelációs görbéje negatív értékről nőtt, és 35 másodperc körüli pozitív értéknél érte el a csúcsot (4.c), és mind a negatív, mind a pozitív értékek statisztikailag szignifikánsak voltak (4d, WT). Ez azt mutatja, hogy a homológ centromerek hajlamosak ugyanabba az irányba mozogni (4b, balra lent), és körülbelül 35 másodpercenként fordítsák meg mozgásukat (4b, jobb alsó). Így a homológ centromer oszcilláció koordinált. Ezzel szemben a cselekmény rec12Δ A sejtek szignifikánsan különböztek a vad típusú parcellától, és nem mutattak szignifikáns korrelációt egyetlen késleltetési időpontban sem (4.ce, rec12Δ). Ez az eredmény a koordináció hiányát jelzi a homológ centromer mozgásokban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a chiasmata koordinálja a homológ centromer oszcillációt.

Jellemeztük a centromer mozgásokat is bárka1-úgy sejteket. A keresztkorrelációs érték 0 s-nál negatív volt, mint a vad típusú sejteknél, jelezve, hogy a homológ centromerek ugyanabba az irányba mozogtak (elektronikus kiegészítő anyag, S5A, B ábra). Az auto- és keresztkorrelációs diagramok korrelációs értékeinek statisztikai szignifikanciája azonban 35 s körül veszett (elektronikus kiegészítő anyag, S5A–C ábra). Ez a megfigyelés a centromer oszcilláció gyengült periodicitását sugallja, és összhangban van a centromer megváltozott fordulatával. bárka1-úgy sejteket. Ezzel szemben ilyen változás nem volt megfigyelhető mad2Δ sejtek, amelyek fő hibája a korai anafázis kialakulásának SAC-függő gátlása (elektronikus kiegészítő anyag, S5D-F ábra). Az a tény, hogy a chiasmaták koordinálják a homológ centromer oszcillációt, és hogy az oszcilláció dinamikája megváltozik bárka1-úgy A sejtek felvetik annak lehetőségét, hogy a centromer oszcillációja összefügg a kötődés megszüntetésével.

2.4. Dam1 szükséges a chiasma-függő csatoláskorrekcióhoz

A kötődés eliminációja és a centromer oszcilláció közötti kapcsolat további feltárása érdekében ezután olyan kinetochore mutánsokat kerestünk, amelyek hibásak a chiasma-függő kötődés eliminációjában. A kinetochore fehérjék közül azt gyanítottuk, hogy a Dam1 hozzájárulhat a kötődés korrekciójához és a centromer oszcillációjához, mivel a Dam1 egy Aurora B szubsztrát és a Dam1/DASH komplex komponense, amelyről úgy gondolják, hogy az MT lerövidülését kinetochore mozgásokkal kapcsolja össze [42–50 ] azt találtuk, hogy a chiasma-függő kötődés eliminációja károsodott azokban a sejtekben, amelyek a gát1 törlés (gát1Δ).

gát1Δ cells exhibited largely normal spore formation and only a slight decrease in spore viability (electronic supplementary material, figure S6A,B). This observation indicates that meiotic chromosome segregation is not severely impaired in dam1Δ cells, being consistent with the fact that Dam1 is not essential for chromosome segregation in mitosis [51]. In addition, both crossover and non-crossover recombination occurred at a wild-type level in dam1Δ cells (electronic supplementary material, figure S6c), indicating that recombination-dependent chiasma formation is normal in dam1Δ sejteket.

Fontos, hogy a dam1Δ mutation impaired disjunction of homologous chromosomes (figure 5a), as seen in mad2Δ és ark1-so mutants [25,52]. Továbbá a dam1Δ mutation increased equational segregation of sister chromatids in rec12 + cells (figure 5b, left) but it decreased equational segregation in sgo1Δ rec12Δ or haploid meiotic sgo1Δ cells (figure 5b,c). Consistent with the equational segregation frequencies, the mean splitting frequencies of sister centromeres decreased in dam1Δ rec12Δ cells, and although the difference was not significant, the mean splitting frequencies tended to be higher in dam1Δ cells (figure 5d,e electronic supplementary material, figure S2A). In addition, opposing forces exerted on homologous centromeres decreased, as demonstrated by the increase in tilted, non-parallel positioning of homologous centromeres and the reduction in their distances (figure 5f,g). These phenotypes mirror those of error correction-defective mad2Δ és ark1-so mutants (figure 3b,c). Furthermore, as seen in ark1-so cells, the proportion of splitting sister centromeres that were tilted towards a perpendicular direction increased irrespective of chiasma formation (figure 5h,i electronic supplementary material, figure S3). These similarities to error correction-defective mutants strongly suggest that attachment correction is defective in dam1Δ sejteket. Az dam1Δ mutation significantly shortened the mean projected distances (electronic supplementary material, figure S4C,D), suggesting a reduction in opposing forces exerted on sister centromeres.

Figure 5. Effects of the dam1Δ mutation on chromosome attachment to the spindle at meiosis I. (a) Frequencies of non-disjunction of homologous chromosomes (cen2). (időszámításunk előtt) Equational segregation frequencies of sister chromatids (cen2) in diploid (b) és pat1 haploid cells (c) at meiosis I. In (a–c), chromosome segregation was analysed in more than 50 cells, and bars show averages of more than three independent experiments. Error bars show standard errors. *p < 0.01 **p < 0.005 ***p < 0.0001 (Student's t-test). (d) Separated sister centromeres in dam1Δ sejteket. Maximum projection images of centromeres and SPBs taken every approximately 3 s were arranged from left to right. Arrowheads show separated sister centromeres. Bar, 2 µm. (e) Observation frequencies of centromere splitting obtained by the bootstrap method. Graph shows the mean frequencies per centromere. *p < 0.05 **p < 0.01 n.s., not significant (p-value is shown in parentheses). Error bars show 95% confidence intervals. Numbers in parentheses at the top of the graph indicate the numbers of centromeres examined. +, no other mutations. Means of wild-type and rec12Δ cells were adopted from figure 2. Dotted line distinguishes results of rec12 + és rec12Δ sejteket. (f) Distribution of angles of homologous centromeres relative to the spindle (upper graph), and 2D plots of the mean angles and distances of homologous centromeres in each cell (lower graph). (g) Distances between homologous centromeres. Graph shows means of the mean distances in each cell. Drawings show the predicted relationship between attachments and homologous centromere distances. Black arrows indicate forces exerted on chromosomes. Numbers in parentheses indicate the number of cells examined. *p < 0.001 (Student's t-test). Error bars indicate standard errors. (h) Distribution of angles of splitting sister centromeres. Dotted red lines show the distributions of wild-type and rec12Δ sejteket. (én) Increased tilting of splitting sister centromeres in dam1Δ sejteket. Green bars: 0° ≤ θ < 20° brown bars: 20̊ ≤ θ < 60° blue bars: 60° ≤ θ ≤ 90°. +, no other mutations. Eighty-three and 56 splitting sister centromeres were examined for dam1Δ és dam1Δ rec12Δ cells, respectively.

The attachment changes did not result from premature anaphase onset or impaired Aurora B localization, as dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset (metaphase duration: 11.4 ± 0.7 min in wild-type cells (n = 10) and 31.5 ± 2.3 min in dam1Δ cells (n = 6)) and Aurora B localization patterns similar to those seen in wild-type cells (pre-anaphase punctate localization adjacent to kinetochores and anaphase spindle localization electronic supplementary material, figure S7A,B).

2.5. Dam1 is required for metaphase centromere oscillation and anaphase A

We also found that centromere oscillation was abolished in dam1Δ sejteket. At metaphase I in both dam1Δ és dam1Δ rec12Δ cells, spindle length tended to increase (electronic supplementary material, figure S8A), perhaps reflecting the loss of inward pulling forces generate by kMT depolymerization [53], and although centromeres were on the spindle, as in wild-type cells, they remained largely still without undergoing oscillation (figure 6a,b electronic supplementary material, Movies S7–S11). Accordingly, centromere velocities and the standard deviation of centromere positions decreased markedly, and the MSD plots shifted downward (figure 6c electronic supplementary material, figure S8B,C). The auto- and cross-correlation plots exhibited different patterns from those in wild-type and rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S8D–F).

Figure 6. Centromere and spindle dynamics at meiosis I in dam1Δ sejteket. (a) Behaviour of centromeres (cen2) and the spindle at meiosis I. Green indicates cen2 and SPB, and magenta indicates the spindle. Numbers indicate time (in minutes). Arrows and arrowheads indicate the SPB and cen2, ill. White lines indicate cell outlines. Bar, 5 µm. (b) Changes in centromere and SPB positions at metaphase I in dam1Δ és dam1Δ rec12Δ sejteket. Left images show kymograph of centromeres (cen2) and SPBs and right graphs show changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances. Vertical and horizontal bars of kymographs show 2 µm and 30 s, respectively. (c) Mean centromere velocities. Dotted lines distinguish results of rec12 + and rec12Δ sejteket. (d) Changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances during anaphase I. (e) Loss of anaphase A centromere movements in dam1Δ sejteket. Photos show changes in centromere positions during anaphase I. Numbers show time in minutes from the start of anaphase. Dotted lines and arrowheads in photos show positions of SPB and cen2, ill. Bar, 2 µm. Graph shows the mean centromere–SPB distances during metaphase I (Meta) and anaphase I (Ana). Numbers of centromeres examined are shown in parentheses. A dotted line in graph distinguishes results of wild-type and dam1Δ sejteket. Error bars show standard error. *p < 0.05 **p < 0.01 ***p < 0.0005 n.s., not significant (Student's t-test).

In addition to centromere oscillation, anaphase poleward centromere movements were impaired in dam1Δ sejteket. Upon anaphase onset, homologous centromeres normally separate from each other by poleward movements (anaphase A), and then by spindle elongation (anaphase B) (figure 6a,d,e, WT) [23]. Ban ben dam1Δ cells, however, anaphase poleward centromere movements rarely occurred, and their distances from the nearest SPBs were largely unchanged (figure 6a,d,e electronic supplementary material, figure S8G,H). Nonetheless, homologous centromeres successfully separated from each other as the spindle elongated (figure 6a,d), indicating that homologous centromeres undergo anaphase B without undergoing anaphase A. Notably in this regard, anaphase A movements were impaired in rec12Δ cells due to bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S8H) [28]. The lack of centromere oscillation and anaphase A are consistent with previously reported dam1Δ phenotypes: kinetochores remain at the MT ends for a long time (more than 20 min) and inhibit MT disassembly after kinetochore attachment to the MT ends [43,54], and chromosomes frequently fail to reach the SPB during mitotic anaphase [51,55]. The coincidental impairment of centromere oscillation, together with the attachment correction defect, provides further support for a link between attachment correction and centromere oscillation.

3. Discussion

3.1. Roles of chiasmata and Dam1 in attachment correction

In this study, we investigated whether chiasmata cause elimination of bi-oriented attachment via the error correction mechanism by analysing the attachments in mad2Δ vagy ark1-so cells forming or lacking chiasmata. Analysis of sister chromatid segregation, transient sister centromere splitting and homologous centromere positioning collectively revealed that in the mad2Δ és ark1-so backgrounds, bi-oriented attachment of sister chromatids increased in chiasma-forming cells, but mono-oriented attachment increased in chiasma-lacking cells. Presumably, sister chromatids are initially frequently bi-oriented irrespectively of chiasma formation, but the error correction mechanism eliminates bi-oriented attachment specifically in chiasma-forming cells. Less prominent impacts of the mad2Δ mutation on attachments than those of the ark1-so mutation probably resulted from distinct mutation-dependent defects. Az mad2Δ mutation decreases the time available for correction but does not compromise attachment elimination unlike the ark1-so mutáció benne mad2Δ cells, despite attachment elimination, the shortage of the correction time probably resulted in incomplete attachment correction. Together, these observations indicate that chiasmata enable error correction factors to eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids that are otherwise not eliminated.

A previous study reported that mad2 és ark1 mutations increased bi-oriented attachment of sister chromatids in the absence of chiasmata [31], contradicting the results of this study. Az ark1-as mutation and a different centromere marker used in that previous study may have affected attachments. In addition, it is important to note that pairing of homologous centromeres, which occurs during meiotic prophase, may affect the initial kinetochore–MT interaction. However, the contribution of centromere pairing to the observed differences between chiasma-forming and chiasma-lacking cells is probably negligible because centromere pairing occurs at a largely normal level in rec12Δ cells [56] and equational segregation frequencies in haploid meiotic cells, which lack pairing, were almost the same as those in rec12Δ cells (figure 1e,f).

In addition to bi-oriented attachment of sister chromatids, our analysis of sister centromere tilting suggested frequent occurrence of merotelic attachment and its elimination by the error correction mechanism, irrespective of chiasma formation. Indeed, merotelic attachment is frequently observed in chiasma-forming meiotic cells as well as in chiasma-lacking mitotic cells [57,58]. Tilted centromere positioning may have resulted from only one of the sister centromeres interacting with MT (monotelic attachment) or from detachment of sister centromeres from MTs after separation. However, given the active mobilities of splitting sister centromeres (electronic supplementary material, figure S2B–D) and the stable end-on attachment seen in dam1Δ cells [43,54], these events are likely to be rare. It is also possible that both sister centromeres interact with MTs extending from the same pole (syntelic attachment), one laterally and the other at the ends, as in vertebrate cells [59], and that bi-directional lateral sliding of one of the centromeres causes tilted positioning. However, the consistency of the frequencies of sister centromere splitting with those of equational segregation suggests that syntelic attachment is probably transient, if it occurs at all.

We also found that the dam1Δ mutation increased bi-oriented attachment of sister chromatids in chiasma-forming cells and increased mono-oriented attachment in chiasma-lacking cells. This suggests that Dam1 plays a crucial role in the attachment correction. The increased tilting of splitting sister centromeres seen in rec12 + dam1Δ cells further supports this notion. Mivel dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset, Dam1 must contribute to attachment elimination via an SAC-independent pathway. Given that Dam1 plays a crucial role in kinetochore–MT interaction and is a substrate of Aurora B [42,51,60], we speculate that the Dam1 complex is directly involved in the attachment elimination process as a component of the Aurora B regulatory pathway.

3.2. Functions of chiasmata and Dam1 in centromere oscillation

Using the correlation functions, we showed that centromeres oscillated irrespectively of chiasma formation and that chiasmata coordinated homologous centromere oscillation. Various experimental- and/or simulation-based studies demonstrated that coordinated oscillation of sister chromatids depends on the tension generated by sister centromere cohesion [10,61–71]. Given this notion, it is likely that coordinated homologous centromere oscillation similarly depends on tension generated by chiasmata. During oscillation of mitotic sister centromeres, kinetochore-interacting MT bundles (kMTs) extending forward of the moving centromeres (leading kMTs) drive centromere movements by their disassembly, whereas those extending rearward (trailing kMTs) assemble (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [4–6,10], and switching of either the leading or trailing kMTs induces reversal of centromere movements (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [72]. In fission yeast, Kinesin-8 motors, Klp5 and Klp6, that promote disassembly of longer kMTs induce kMT switching in the proximity of the equator [41,71,73,74]. The kMT switching causes transient centromere relaxation or stretching (electronic supplementary material, figure S9A, mitosis, transition state), which likely induces coordinated assembly/disassembly switching of the other kMTs through force-dependent changes in MT dynamics [75–78]. During homologous centromere oscillation, the kMTs probably undergo assembly and disassembly in a similar manner, and the chiasma-dependent link generates a temporal tensile change that coordinates assembly/disassembly switching of the kMTs (electronic supplementary material, figure S9A, meiosis I).

We also found that Dam1 was essential for centromere oscillation and anaphase A poleward centromere movements. This finding indicates that centromere oscillation and anaphase A depend on the same mechanism. The Dam1 complex probably drives centromere movements by coupling MT disassembly to centromere movement [49,50]. It may also promote MT disassembly, as kMT shortening is inhibited after kinetochore capture in dam1Δ cells [43,54,79]. Despite the lack of centromere oscillation and anaphase A, kinetochore–MT interactions were not eliminated in dam1Δ cells, as demonstrated by sister centromere splitting and anaphase B centromere movements. Therefore, a factor(s) in addition to Dam1 may cooperatively drive centromere movement. The factors that are likely to mediate kinetochore–MT interaction in dam1Δ cells include the Ndc80 complex, a distinct kinetochore–MT interface factor and the Klp5/Klp6 complex, which can couple MT disassembly to cargo movement like the Dam1 complex and play crucial roles in centromere oscillation and/or chromosome segregation [71,73,74,80–87]. Indeed, kinesin-8 motors are essential in dam1Δ cells [51] and contribute to stable kinetochore–MT interaction during centromere oscillation [73].

3.3. Functions of chiasma and Dam1 in attachment elimination

The precise mechanism of chiasma-dependent attachment elimination and the mechanism of Dam1-dependent attachment elimination itself remain unclear. It was previously proposed that chiasmata eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids by generating a chromosome configuration that arranges sister kinetochores outward and the Aurora B-enriched region inward [31,88]. In this model, poleward pulling brings improper attachment sites close to the Aurora B-enriched region, leading to the elimination of the attachments. However, this configuration requires firm association of sister centromeres. When sister centromeres separate as seen in our study, improper attachment sites would barely approach the Aurora B-enriched region (electronic supplementary material, figure S9B). Therefore, the validity of this model remains debatable.

It is possible that chiasmata eliminate bi-oriented attachments by reducing tension across sister centromeres. Indeed, although we could not observe significant difference between projected inter-sister centromere distances of rec12 + és rec12Δ cells, a subset of the distances in the rec12 + cells covered a slightly shorter distance range than those covered in rec12Δ cells, suggesting a reduction in tension. However, in a rec12 + cell shown in figure 2, the projected centromere distances were comparable to or greater than those in rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S4C), suggesting that at least in this particular cell, tension was probably not reduced. Nonetheless, the bi-oriented attachment was eliminated as demonstrated by re-association of the splitting sister centromeres (figure 2b,c, WT). Therefore, we speculate that chiasma-dependent attachment elimination is not solely dependent on the reduction in overall tension.

Our finding that both chiasmata and Dam1 contribute to centromere oscillation raises the possibility that attachment elimination is coupled to centromere oscillation. This possibility is supported by our finding that homologous centromere oscillation dynamics are altered in the error correction-defective ark1-so mutant. One possible explanation is that centromere oscillation causes elimination of erroneous attachments. In chiasma-forming cells, when improperly attached homologous centromeres undergo oscillation via coordinated disassembly and assembly of the leading and the trailing kMTs (electronic supplementary material, figure S9C, Meiosis I), stochastic and/or length-dependent initiation of assembly/disassembly MT switching may give assembling kMT ends a chance to experience a chiasma-dependent minus end-directed load at improper attachment sites. The minus end-directed load applied to the assembling kMT ends may bring attachment sites close to the inner centromere region, inducing Aurora kinase-dependent kMT detachment. Alternatively, the minus end-directed load may cause kMT detachment due to the intrinsically weak resistance of the interaction between assembling MTs and the kinetochore to a minus end-directed load. Indeed, attachment of Stu2, a XMAP215/Dis1 family kinetochore component in budding yeast, to assembling MT ends can withstand a tensile force of approximately 4 pN under plus end-directed load [89], whereas attachment of Xenopus XMAP215 can withstand a force of only approximately 1 pN force under minus end-directed load [90]. In this model, chromosome oscillation actively eliminates improper attachments by applying a load to the improper attachment sites, and the lack of chiasmata or centromere oscillation impairs attachment elimination.

An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that attachment elimination requires an attachment property that enables centromere oscillation. We found that centromere oscillation is impaired in ark1-so sejteket. In addition, expression of mutant forms of the kinetochore component Ndc80 that cannot be phosphorylated by Aurora B inhibits centromere oscillation [81,83]. These observations indicate that centromere oscillation requires Aurora B-dependent kinetochore phosphorylation. In addition, variants of Dam1 or Ndc80 bearing Aurora B-phosphomimetic mutations form diffusible attachment to the MT lattice and exhibit diffusion-like movements on the MT [44,46,91]. Therefore, centromere oscillation probably depends on Aurora B-dependent diffusible attachment. Because diffusion activities of kinetochore components increase as their MT affinities decrease, only diffusible attachments may allow attachment elimination. In the absence of Dam1, attachment may become non-diffusible and non-eliminable, resulting in impairment of both centromere oscillation and elimination of erroneous attachments. Further close investigation of the effects of the phospho-mutant forms of Dam1/Ndc80 on attachment correction and centromere oscillation would be important to verify this possibility.

The chromosome oscillation-dependent mechanism can also account for the elimination of merotelic attachment of a single chromatid in a chiasma-independent manner and in both mitosis and meiosis. Perhaps, cohesin-dependent coordinated oscillation of sister chromatids eliminates merotelic attachment in the same way that coordinated homologous chromosome oscillation eliminates bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S9C, mitosis). Consistently, a loss of sister chromatid cohesion causes merotelic attachment in mitosis [92,93], and in dam1Δ cells, impaired centromere oscillation was accompanied by increased sister centromere tilting, a probable outcome of merotelic attachment, irrespectively of chiasma formation (figure 5én). Furthermore, the oscillation-dependent mechanisms likely contribute to attachment elimination in vertebrates, although the mechanisms are not completely the same, as demonstrated by additional contribution of Aurora A kinase to centromere oscillation and attachment correction [94,95].

The oscillation-dependent mechanism does not deny the importance of overall tension across sister centromeres in attachment elimination. It is clear that as the number of properly attached kMTs increases, tension across sister centromeres increases. Gradual elevation of tension may incrementally decrease kinetochore phosphorylation levels, resulting in an incremental increase in MT binding affinity of kinetochores, as in the case of Ndc80 phosphorylation [91]. An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that tension greater than some threshold alters the kinetochore phosphorylation state. Kinetochore phosphorylation is regulated by phosphatases in addition to Aurora B [96], and the antagonistic actions of these enzymes may robustly maintain the kinetochore phosphorylation state during metaphase, as suggested for antagonistic regulatory systems [97]. However, once tension exceeds the threshold, the kinetochores may be completely dephosphorylated by the kinetochore regulatory system [96,98,99]. In either case, tension converts the metaphase-type diffusible, correctable attachments to the anaphase-type non-diffusible, non-correctable attachments, linking establishment of proper attachments with the metaphase-to-anaphase transition. This scenario is consistent with the well-established relationship between tension and loss of Aurora-dependent phosphorylation and attachment stabilization (e.g. [12,27,100, 101]). In addition, in this scenario, a reduction in tension leads to an increase in kinetochore phosphorylation, making the kinetochore state preferable for attachment correction this can account for correction of merotelic attachment induced by reduced tension [102].

In this study, we showed that chiasmata and Dam1 differentially contribute to the elimination of erroneous attachments and centromere oscillation. These findings raise the possibility that attachment elimination is coupled with centromere oscillation. The precise mechanisms of chiasma-dependent or Dam1-dependent attachment elimination, as well as the relationship between centromere oscillation with attachment elimination, remain to be elucidated. However, our findings and the suggested relationship will undoubtedly shed new light on understanding of the mechanisms of attachment correction and centromere oscillation. Because chromosome missegregation is associated with various diseases or disorders, including tumorigenesis and birth-related Down's syndrome, our findings may be of clinical importance.

4. Material and methods

4.1. Yeast strains, media and basic genetical methods

Strains used in this study are shown in electronic supplementary material, tables S2 and S3. Media and basic genetical methods used in this study were described previously [103]. Az dam1 deletion strain was generated by replacing the entire dam1 gene with the G418-resistance gene by a PCR-based method [104,105].


Bevezetés

Although the number of reciprocal recombination events at meiosis is similar for organisms with widely different genome sizes such as the mouse and lily (which have between 20 and 50 events), the number of DNA-DNA interactions that are recognized by RAD51/DMC1p immunocytology at prophase of meiosis is much higher (250 for the mouse and more than 2000 for lily)(Anderson et al., 2001). It follows that most or all of these early interactions do not necessarily function in the formation of reciprocal events. Conceivably, the numbers relate to genome size, 3.3 pg for the mouse and 141 pg for lily. However, the genome sizes differ by a factor of 43, whereas the number of RAD51/DMC1 foci in the mouse differs only by a factor of 10 from the lily. A better correlate appears to be the length of paired prophase chromosomes, as measured by the total length per nucleus of the synaptonemal complexes, SCs, which are the axes of the bivalents (about 200 μm for the mouse and about 3000 μm for lily). The tentative conclusion is that these foci, which are associated with the chromosome cores and SCs, function in SC formation(Anderson et al., 2001). Synaptic failure in the absence of RAD51/DMC1 foci in SPO11 -/- mice also suggests a role for early nodules in synapsis(Baudat et al., 2000Romanienko and Camerini-Otero,2000).

Molecular models for the resolution of DNA-DNA interactions without reciprocal recombination have been discussed by Gilbertson and Stahl(Gilbertson and Stahl, 1996)and involve helicase-topoisomerase activity to resolve joint molecules. The acquisition of replication protein A, RPA and Bloom mutated protein, BLM, at the RAD51/DMC1 sites might be the physical manifestation of the models —RPA may stimulate BLM-RecQ helicase activity(Brosh et al., 2000) in concert with topoisomerase IIIa (Johnson et al., 2000) to resolve the early DNA-DNA interactions at the RAD51/DMC1 sites.

The development of reciprocal genetic exchange events at meiosis in many fungi, plants and animals can be monitored at several levels: (1) at the chromosomal level by chiasmata, which are the sites of reciprocal recombination (Jones, 1987)(2) by the recombination nodules, RNs, which correlate with genetic and cytological patterns of recombination(Carpenter, 1975Carpenter, 1979Albini and Jones, 1988) and(3) by the MLH1p sites, which are associated with crossover sites(Anderson et al., 1999)

Nodules are SC-associated, electron-microscope-defined structures that have been reported in the meiocytes of protists, fungi, plants and animals. In early meiotic prophase, `nodules' refer to the several hundreds of small dense bodies about 100 nm in diameter that are associated with chromosome cores and SCs and contain the RAD51/DMC1 proteins in lily(Anderson et al., 1997), mouse and human (Haaf et al., 1995Moens et al., 1997Barlow et al., 1997). Since the correlation of these structures with reciprocal recombination is tenuous, they are usually referred to as `early nodules', EN. The late RNs, as originally defined by Carpenter (Carpenter,1975) in Drosophila melanogaster oocyte SCs, correspond in number and location to reciprocal recombinant events in normal and mutant D. melanogaster. In the rat, `late RNs' are well defined electron-dense bodies of variable shape and size, 100 to 200 nm, located on the mature SC at pachytene stage VII of the spermatogenic pathway but not in earlier pachytene stages I to V (Clermont,1972 Moens,1978). Cross-sectioned SCs and whole-mount, shadow-cast EM preparations show that RNs are located on the surface of the SC either along the central element or obliquely across the SC(Fig. 7). The reported number of late RNs (19 to 22 per nucleus) in complete EM-reconstructed rat-pachytene nuclei, their non-random distribution and their association with MLH1 (Mut L homolog) protein in rat and mouse (this report), agree with their proposed function in reciprocal recombination by Carpenter(Carpenter, 1975Carpenter, 1979). A number of publications have assigned various proteins to RNs but the assignments have not previously been verified by EM demonstration of these proteins on the RNs.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

We report the events in individual mouse and rat spermatocyte nuclei from early to late meiotic prophase in terms of chromosome core behavior and associated protein complexes. The immunofluorescence observations are refined and detailed by immunoelectron microscopy of the recombination-related proteins and by EM visualization of RNs. These observations are interpreted in the context of the chromosome synapsis and reciprocal recombination and discussed in relation to reports by others on these events.


Perspectives and Future Aims

The mechanisms behind inverted meiosis in holocentric organisms are currently unknown. The occurrence of inverted meiosis demands modification in the conserved mechanisms of meiotic cohesion and chromosome segregation. New adaptations and differential regulation of meiotic cohesions such as REC8 and centromere cohesion guardians such as shugoshins are expected to have happened. Additionally, modification of the spindle attachment machinery also should be expected due to an alternative centromeric organization. Furthermore, the observed chiasmata formation between holocentric chromosomes demands adaptations of the mechanisms that prevent recombination at or around centromeres. The limited knowledge of holocentromeres and close relatives of Cyperaceae limits us to speculate about what to expect in terms of adaptations of the meiotic recombination machinery to holocentricity. Future studies aiming the molecular characterization of such mechanisms will be of interest for evolutionary and comparative biology studies.


Affiliations

Division of Evolutionary Biology, LMU Munich, Planegg-Martinsried, Germany

Joshua V. Peñalba & Jochen B. W. Wolf

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

Contributions

J.V.P. írta a kéziratot. J.B.W.W. edited the manuscript before submission. Both authors researched data for the article and substantially contributed to the discussion of content.

Corresponding authors


Variability of Chiasma Frequencies in Different Tomato Species

This article presents the results of comparative studies of the frequency and distribution of chiasmata in pollen mother cells (PMCs) in five diploid tomato species, Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. habrochaites, és S. neorickii, and one autotetraploid species, S. pimpinellifolium. It was established that under the same growing conditions, the total chiasma frequency in the cell depended on the species. At the same time, the green-fruited species S. peruvianum, S. neorickii, és S. habrochaites differed in distal chiasma frequency, while the red-fruited species S. lycopersicum és S. pimpinellifolium differed in interstitial chiasma frequency. It was shown that the total chiasma frequency in PMCs of plants of one species is a stable index of recombination potential that does not depend on the growing conditions. The redistribution between distal and interstitial chiasmata was found to be more variable, depending on the species, year, geographic growth conditions. In autotetraploid, the chiasma frequency per bivalent was lower than that in diploid S. pimpinellifolium plants, primarily due to interstitial chiasmata, the frequency of which remained at the level characteristic for diploid plants. It was concluded that the recombination plasticity of the tomato genomes was due to the redistribution of chiasmata along bivalents, and not to the change in their number in the cell.


Bevezetés

Historically, chromosomal rearrangements have long been recognized as a major driving force promoting divergence (White, 1978), but it was only recently that the role of rearrangements as recombination modifiers has been recognized and formalized in the recombination suppression models of chromosomal speciation (Noor et al., 2001 Rieseberg, 2001 Navarro and Barton, 2003 Ayala and Coluzzi, 2005). Thus, the emphasis is no longer on the decrease in fitness of chromosomal hybrids, but on the suppression of recombination between the rearranged chromosomes, resulting in a partial barrier to gene flow between populations. The association with speciation events lies in the tight linkage between the rearrangements and reproductive isolation or locally adaptive genes owing to the suppression of recombination in chromosomal heterozygotes. Thus, rearrangements can contribute to the persistence of reproductive isolation genes in the face of gene flow for a longer time than if they were absent (Noor et al., 2001), and extend the action of linked isolation genes over larger genomic regions than if no rearrangements were present (Rieseberg, 2001 Butlin, 2005). The emergence of the recombination suppression models stimulated a considerable amount of both empirical (for example, Lowry and Willis, 2010 Ayala et al., 2011 MacGaugh and Noor, 2012 Farré et al., 2013) and theoretical (for example, Kirkpatrick and Barton, 2006 Feder and Nosil, 2009 Faria and Navarro, 2010) studies exploring the operational conditions, mechanisms and processes involved. Most, if not all, of these analyses have focused on inversions and reciprocal translocations, whereas the most widespread rearrangement, Robertsonian (Rb) fusion/fission, has received considerably less attention (King, 1993).

The aim of the present study is to assess the effect of heterozygosity for Rb fusions on recombination patterns. These rearrangements consist of the joining of two nonhomologous acrocentric chromosomes by the centromere to form one biarmed chromosome. The house mouse, Mus musculus domesticus, was chosen as the biological model for several reasons. First, extensive chromosomal diversity through fixation of Rb fusions occurs throughout its distribution and all chromosomes, except the sex pair, are involved in Rb fusions in wild populations (Piálek et al., 2005). Second, underdominance levels of simple Rb heterozygotes, that is, carrying trivalents formed by the pairing of Rb fusions with the two homologous acrocentrics, are well documented in this subspecies. In particular, the data indicate that heterozygosity for a single-Rb fusion has a limited effect on hybrid fitness (Hauffe and Searle, 1998 Sans-Fuentes et al., 2010) in this case, there will be almost no constraint on its fixation probability, but conversely, its contribution to postmating isolation will be extremely reduced unless it is associated with changes in recombination pattern. Finally, several studies have indicated a reduction in crossover rates in wild homozygous Rb vs standard mice in the proximal centromeric regions (Bidau et al., 2001, Castiglia and Capanna, 2002 Dumas and Britton-Davidian, 2002 Merico et al., 2003, 2013). Analyses of recombination rates in wild Rb heterozygotes have also been assessed but involve, in most cases, polymorphic individuals, that is, carrying variable numbers of Rb bivalents and trivalents, making it difficult to disentangle the effect of each meiotic type of configuration (Wallace et al., 1992 Bidau et al., 2001 Castiglia and Capanna, 2002 Capilla et al., 2014). In contrast, extensive analyses of recombination patterns in single-Rb heterozygotes have been performed by genetic assays in crosses between different laboratory strains (Davisson and Akeson, 1993). Recombination suppression was recorded in almost all of the Rb fusions tested, but the extent of the suppression varied between chromosomes and crosses, suggesting an influence of the genetic background on this trait. The present analysis is performed on male and female laboratory-bred F1 hybrids (2n=31) between two chromosomal races of the house mouse (2n=40 and 2n=22) from Tunisia, as well as wild-caught mice spanning the hybrid zone between two North Italian races (2n=40 and 2n=22). In both cases, structural genomic differences exist between races, as all chromosomes except two pairs (a small acrocentric pair and the sex chromosomes) are involved in Rb fusions. The Tunisian F1 hybrids exhibit a homogeneous meiotic architecture in which all Rb chromosomes are present as trivalents, whereas the number of Rb fusions (heterozygous and homozygous) was variable in the Italian mice. Although recent cytogenetic estimates of recombination rely on the analysis of MLH1 foci (mismatch repair protein) on synaptonemal complexes (Anderson et al., 1999), recombination was assessed in the present study by meiotic chiasma analyses permitting direct comparisons with previously published data (Dumas and Britton-Davidian, 2002). The effects of Rb heterozygosity on recombination patterns were identified by comparing the chiasma-based assessment of the Tunisian F1 mice with those previously recorded for the Tunisian parental standard and Rb races from which they originated (Dumas and Britton-Davidian, 2002). An estimate of variation in recombination rates was approached by comparison with the data from the Italian samples. From this, we infer the extent and genomic distribution of the barrier to gene flow between chromosomal races and discuss the relevance of Rb rearrangements to reproductive isolation and divergence processes.


Genome and Gene Structure∗

4.2.4 Meiotic Recombination

Meiotic recombination [1] refers to the reciprocal physical exchange of chromosomal DNA between the parental chromosomes and occurs at meiosis during spermatogenesis and oogenesis, serving to ensure proper chromosome segregation. During the four-strand stage of meiosis, two duplex DNA molecules (one from each parent) form a hybrid, and a single strand of one duplex is paired with its complement from the other duplex. Single-stranded DNA is exchanged between the homologous chromosomes, and the process involves DNA strand breakage and resealing, resulting in the precise recombination and exchange of DNA sequences between the two homologous chromosomes. This process is highly efficient and does not usually result in mutations at the sites of recombination. Recombination thus shuffles genetic material between homologous chromosomes, generating much of the genetic diversity that characterizes differences between individuals, even within the same family.

The frequency of recombination between two loci along a chromosome is proportional to the physical distance between them, and historically, this provided the basis for defining the genetic distance between loci, allowing genetic maps to be constructed. The genetic proximity of two loci is measured by the percentage of recombination between them a map distance of 1 centimorgan (cM) indicates 1% recombination frequency between the two loci. The human genome sequence has made it possible to compare genetic and physical distances and to analyze variations in recombination frequency in different chromosomal regions. On average, 1 million bp (1 Mb) correspond to 1 cM (1% recombination frequency). However, there is a tremendous local variation between individual chromosomes and among particular chromosomal regions. For example, the average recombination rate is higher in the short arms of chromosomes and at the distal segments of the arms but overall is suppressed near the centromeres. There is also a significant variation in the recombination rates between the sexes, with 1.6-fold more recombination on average in females relative to males. On average, female recombination is higher at the centromeres and male recombination is higher at the telomeres [2] .


Antitest variáció

A B-sejtekben a könnyűlánc gén variábilis régiója 40 variábilis (V) és öt csatlakozó (J) szegmensből áll. A DNS-rekombináz nevű enzim véletlenszerűen kivágja ezeknek a szegmenseknek a többségét a génből, egy V szegmenst egy J szegmensre illesztve. Az RNS-feldolgozás során egy V és J szegmens kivételével az összes kioldódik. A rekombináció és az összeillesztés több mint 10 6 lehetséges VJ kombinációt eredményezhet. Ennek eredményeként az emberi szervezetben minden differenciált B-sejtnek jellemzően egyedi változó lánca van. A konstans domén, amely nem kötődik egy antitesthez, minden antitest esetében azonos. Az antitestek szerkezetének nagy változatossága az antigének sokféleségét jelenti, amelyeket az antitestek képesek megkötni és felismerni.

A TCR-ekhez (T-sejt-receptorokhoz) és a BCR-ekhez (B-sejt-receptorokhoz) hasonlóan az antitest-diverzitás körülbelül 300 különböző génszegmens mutációjával és rekombinációjával jön létre, amelyek a B-sejtekké váló prekurzorsejtek könnyű és nehéz lánc variábilis doménjét kódolják. A nehéz és könnyű láncok variábilis doménjei kölcsönhatásba lépnek, és kialakítják azt a kötőhelyet, amelyen keresztül az antitest egy specifikus epitóphoz tud kötődni egy antigénen. Az ismétlődő konstans domének száma az Ig-osztályokban (lásd alább) azonos minden, egy adott osztálynak megfelelő antitest esetében. Az antitestek szerkezetileg hasonlóak a BCR-ek extracelluláris komponenséhez. A B-sejtek plazmasejtekké való érése akkor következik be, amikor a sejtek képesek lesznek nagy mennyiségben kiválasztani a BCR antitest részét.


$ left(egin (1-2 szöveg

) (alpha (gamma -sigma (1- ext) (gamma +(-gamma alpha -alpha +1) kappa +1))-2 ext sigma +sigma) & sigma ext

(1-szöveg

) left(-kappa (gamma +1) alpha^<2>+(gamma +kappa +1) alpha -2 ight) sigma ext (1-szöveg) (-(1-alpha) kappa alpha -alpha +2) & sigma (1-2 ext) ( ext

(-kappa (1-alpha) alpha -alpha +2)+alpha kappa -1) end jobb), . $

A belső fix pontban ((h^<*>_<1>,p^<*>_<1>)) a mátrixot a (J(h^<*>_<1>, p^<*>_<1>)=)



Hozzászólások:

  1. Barrie

    Ennek nincs értelme.

  2. Moogubar

    It here if I am not mistaken.

  3. Oluwatosin

    the phrase Excellent

  4. Goodwine

    It's okay, it's the entertaining piece



Írj egy üzenetet