Információ

A származási vonal szelekciója a plazmid evolúciójában

A származási vonal szelekciója a plazmid evolúciójában


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Végigolvastam Paulssont (2002), és nem vagyok benne biztos, hogy mit ért a másodiktól az utolsóig terjedő részben a "származási ág kiválasztása" alatt. A cikk a plazmidreplikációval foglalkozik, és leginkább a szelekció két szintjéből származó kontrasztos nyomásokra koncentrál:

  1. sejten belüli szelekció - verseny a plazmidok között egyetlen sejtben. Egy plazmid cisz-mutáción eshet át és túlreplikálódhat, ami magasabb intracelluláris fittséget eredményez, mint a fokális plazmid. A plazmidok szaporodnak.
  2. sejtközi kiválasztás - verseny a sejtek között. A nagyobb plazmidterhelésű sejtek szaporodása hosszabb ideig tart, és a nagy terhelést termelő plazmidok sejtközi alkalmassága alacsonyabb lesz. A plazmidokat tartalmazó sejtek szaporodnak.

Ebben az összefüggésben, mit jelent a szelekció harmadik szintje -- a leszármazási kiválasztás --? Mi szaporodik? Hogyan válnak szét vagy lépnek kölcsönhatásba a vonalak?

Szerintem

Vajon a leszármazási szelekció egyszerűen csoportszelekciót jelent különálló sejttelepeken? Ebben az esetben hogyan jönnek létre az új vonalak? Azt várnám, hogy ez a csoportszint a plazmidok nulla szintjét választja ki (mivel nem terhelik a sejteket, így ezek a sejtcsoportok nőnek a leggyorsabban), de Paulsson (2002) ennek az ellenkezőjét javasolja:

a vonal szelekciója előnyben részesítheti azokat a plazmidtulajdonságokat, amelyek segítik a plazmidot tartalmazó sejtek populációját a plazmidmentes sejtek elleni küzdelemben.

Létezik-e erről részletesebb tárgyalás, mint Paulsson (2002) egyetlen szakasza? Sem a szelekció egysége, sem az evolúciós vagy genetikai származású Wikipédia-cikkek nem foglalkoznak a kérdésemmel. Az első csak futólag említi a származást, a második kettő pedig nem tárgyalja a kiválasztási modelleket.


Hivatkozások

Paulsson, J. (2002). Többszintű szelekció a plazmid replikációján. Genetika, 161(4): 1373-1384.


A származás szerinti szelekciót olyan tulajdonságok szelekciójaként határozza meg, amelyek növelik egy plazmidcsoport alkalmasságát, nem pedig egy egyedi plazmidot egy sejtben vagy egy adott sejtben, amely plazmidokat tartalmaz. Azt mondja, hogy a szelekció egysége a "plazmid-gazda kládok": más szóval a szelekció egysége a szorosan kapcsolódó plazmidok csoportja különálló sejtekben. Ez egy példa a rokonok kiválasztására, bár nem láttam széles körben a konkrét terminológiát. Valószínűleg nem alkalmaz rokonszelekciót, mert a plazmidoknak nincsenek jól meghatározott utódai, ezért tágabb kifejezést használ a rokonság kifejezésére. Lehet, hogy jobban szerettem volna a kládválasztást, de ennek a kifejezésnek megvan a maga poggyásza. Nem vagyok biztos benne (és Paulsson sem az), hogy a rokonok szelekciójára szükség van-e a „rosszul alacsony veszteség” magyarázatára, mivel a sejten belüli és a sejtközi szelekció egyaránt az alacsonyabb veszteségarányokat részesíti előnyben.


A kromoszómális vonalkódolás E. coli populációk nagy felbontás mellett feltárja a leszármazási diverzitás dinamikáját

A nagy aszexuális populációk evolúciós dinamikáját erősen befolyásolja a több versengő jótékony vonal, amelyek többsége nagyon alacsony frekvencián szegregálódik. A baktériumpopulációkban előforduló nagyszámú ilyen ritka vonal nyomon követésének technikai akadályai azonban mindeddig megakadályozták az evolúciós dinamika részletes feltárását. Itt egy olyan kromoszómális vonalkódolási technika kifejlesztésével küzdjük le ezt az akadályt, amely lehetővé teszi körülbelül 450 000 különböző vonal egyidejű nyomon követését. Escherichia coli, amelyet arra használunk, hogy teszteljük a közönséges antibiotikumok szub-inhibitor koncentrációinak hatását az alacsony frekvenciájú leszármazási vonalak evolúciós dinamikájára. Azt találtuk, hogy a populációk az antibiotikum-kezelésüknek megfelelő eltérő sebességgel veszítik el a leszármazási diverzitást. Azt is megállapítottuk, hogy egyes leszármazási vonalaknak hasonló sorsa van független kísérletekben. A pálya dinamikájának elemzésével e leszármazási vonalak reprodukálható sorsát a már meglévő előnyös mutációk jelenlétének tulajdonítjuk, és bemutatjuk, hogy a már meglévő és de novo mutációk relatív hozzájárulása hogyan változik a gyógyszeres kezelések között. Végül szimulációkkal reprodukáljuk a megfigyelt leszármazási dinamikát. Összességében eredményeink értékes módszertant kínálnak a baktériumok evolúciójának tanulmányozásához, valamint betekintést nyújtanak az evolúcióba az antibiotikum szub-inhibitor szintjein.


Bevezetés

A plazmidok olyan járulékos genetikai elemek, amelyek képesek vízszintesen átvinni a baktériumok között. Olyan géneket hordoznak, amelyek segítik gazdájukat az új résekhez és stresszekhez való alkalmazkodásban, kulcsszerepet játszva a baktériumok evolúciójában. 1 A plazmidok gyakran kódolnak antibiotikum-rezisztencia géneket, amelyek felelősek az antibiotikum-rezisztencia és a multirezisztencia terjedéséért a patogén baktériumok között, ami jelenleg a közegészségügy szempontjából komoly gondot okoz. 2,3

A plazmidbiológiával kapcsolatos egyik központi kérdés az, hogy a plazmidok hogyan tarthatók fenn stabilan hosszú távon a baktériumpopulációkban. 4 Ezt nehéz megérteni a plazmidok túlélését akadályozó tényezők miatt. Pontosabban, (i) a plazmidok költséget okoznak a gazdabaktériumnak,5 versenyhátrányt okoznak, és (ii) a plazmidok elveszhetnek a sejtosztódás során (még akkor is, ha ez nagyon alacsony). 6 Összességében ezek a 2  faktorok előrevetítik a plazmidok gyakoriságának állandó csökkenését a populációban az idő múlásával. 7 Vannak azonban olyan tényezők, amelyek ellensúlyozzák a költségek és a szegregációs veszteség hatását, és hozzájárulnak a plazmidok fenntartásához a baktériumpopulációkban, mint például (i) a plazmid által kódolt tulajdonságok szelekciója, (ii) a plazmid vízszintes átvitele a baktériumok között (főleg konjugációval). ) és (iii) kompenzációs mutációk, amelyek csökkentik a plazmid által előállított költségeket. 4,8 Mindezen tényezők közötti egyensúly meghatározza egy adott plazmid sorsát egy baktériumpopulációban. 9

Korábbi elméleti tanulmányok azt állították, hogy a plazmidok csak akkor tarthatók fenn egy baktériumpopulációban, ha képesek konjugálni. 8,10,11 A genomszekvenálás legújabb eredményei azonban azt mutatták, hogy paradox módon a plazmidok nagy része úgy tűnik, hogy a szekvenciájának megfelelő konjugációval “non-transzmissziós”. 12 A nem átvihető plazmidok fennmaradását lehetővé tevő mechanizmusok kevéssé ismertek. Egy közelmúltban végzett tanulmányunkban matematikai modellezést, funkcionális genomikát és kísérleti evolúciót használtunk a probléma vizsgálatára. 13 Az opportunista kórokozó alapján modellrendszert dolgoztunk ki Pseudomonas aeruginosa PAO1, amely a kisméretű, nem konjugatív pNUK73 plazmidot hordozza, amely különösen nagy fitneszköltséget okoz ebben a törzsben (körülbelül 20%-os csökkenés a relatív fittségben). A pNUK73 rezisztenciát biztosít a neomicinnel szemben, ami a minimális gátló koncentrációt (MIC) körülbelül 60-szorosára növeli a PAO1-ben. 30 napi passzálást követően (300 generáció) a plazmidot hordozó szubpopuláció olyan kompenzációs mutációkat mutatott be, amelyek teljes mértékben kompenzálták a plazmid szállításának költségeit. Ezek a mutációk feltehetően 3 bizonyos kromoszómális gént inaktiváltak: egy helikázt, amely egy UvrD-szerű helikáz C-terminális domént (PA1372) hordoz, és két szomszédos feltételezett szerin/treonin protein kinázt (PA4673.15 és PA4673.16).

Ugyanakkor a plazmidmentes szubpopuláció is alkalmazkodott a környezeti feltételekhez, így a szülői törzshöz képest a fittségük is megnőtt. Ennek oka a laboratóriumi körülményekhez való alkalmazkodáshoz általában előnyös mutációk megszerzése volt. Ezek a mutációk elsősorban a diguanilát cikláz gént célozták meg wspF (PA3703) kísérleti rendszerünkben. Így a plazmidot hordozó vonal tovább kihalt, bár lassabb ütemben. Ennek eredményeként a plazmidot hordozó törzs populációja túl kicsi volt ahhoz, hogy az általában előnyös mutációkat rögzíteni lehessen. A plazmidot hordozó populációk azonban megmenthetők antibiotikumok hozzáadásával. Ez a plazmidot hordozó sejtpopuláció méretének növekedéséhez vezetett, ami lehetővé tette az általában előnyös mutációk rögzítését. Ezért azt találtuk, hogy a pozitív szelekció és a kompenzációs adaptáció kölcsönhatásban stabilizálja a pNUK73-at: a pozitív szelekció növeli a kompenzációs adaptáció valószínűségét azáltal, hogy növeli a plazmidot hordozó törzsek populációjának méretét, ezáltal növelve az új adaptív mutációk esélyét a plazmidot hordozó sejtekben. A kompenzációs adaptáció viszont növeli a pozitív szelekció hatását a plazmid stabilitására azáltal, hogy lelassítja a plazmid elvesztésének sebességét a pozitív szelekciós epizódok között.

Korábbi eredményeink azt mutatják, hogy a kompenzáció és a pozitív szelekció néhány száz generáción keresztül segít stabilizálni a nem átvihető plazmidokat. Ezeknek a plazmidoknak a hosszú távú fenntartása azonban továbbra is kihívást jelent. 13 Ebben a kommentárban kibővítjük populációgenetikai modellünk eredményeit, hogy elemezzük a különböző szelekciós módok hatását, valamint a horizontális géntranszfer hatását e plazmidok hosszú távú stabilitására.


Eredmények

MODELL

Olyan sejtekből álló populációt tekintünk, amelyek kromoszómálisan rezisztensek vagy kromoszómára érzékenyek lehetnek ( vagy ), plazmid nélkül, rezisztens plazmiddal vagy érzékeny plazmiddal (, , vagy ). Ez hat lehetséges sejttípust eredményez: , , , , , és (az első betű a kromoszómát, a második betű a plazmidot jelöli).

Kezdjük e sejtek dinamikájának modelljének kidolgozásával (1. ábra), és jelöljük az egyes sejttípusok sűrűségét . A sejtek sebességgel replikálódnak . A sejtek közötti versenyt a sűrűségfüggő halálozási arány rögzíti , ahol a teljes sejtsűrűség (). A plazmidok sűrűségfüggő átvitel útján terjednek a sejtek között sebességgel és a sejtreplikáció során nagy valószínűséggel elvesznek (szegregációs veszteség). A plazmid szállítása fitneszköltséggel jár , ami csökkenti a replikációs sebességet tényezővel . Feltételezzük, hogy a sejteket egyszerre csak egy plazmiddal lehet megfertőzni. Ellenállás nélküli sejtek ( és ) további halálozási arányt tapasztal antibiotikum expozíciótól. Az ellenálláshoz fitneszköltség társul, ami a replikációs rátát egy faktorral csökkenti . Feltételezzük, hogy a rezisztencia gének ugyanolyan alkalmassági költséggel és azonos hatékonysággal rendelkeznek, függetlenül attól, hogy kromoszómális vagy plazmid-hordozók. A kromoszómális és a plazmid által terjesztett rezisztenciával rendelkező sejtek kettős alkalmassági költséggel járnak . E feltevések módosításának hatását az alátámasztó információk (2. szakasz) vizsgálják. Főbb eredményeink általában robusztusak, az érzékenységeket a fő szövegben kiemeljük.

A modellezett dinamika vázlata (1. egyenlet). Minden szürke kör egy sejttípust jelöl, a belső körök pedig a kromoszómát (nagy) és a plazmidot (kicsit), ellenállást jelölve és érzékenység. A nyilak modellezett folyamatokat jeleznek: sejtreplikáció (sötétkék), halál (lila), plazmidtranszmisszió (narancssárga) és szegregációs veszteség (világoskék). A címkék jelzik ezeknek a folyamatoknak a sebességét. egy sejttípus sűrűségét jelzi, tehát a teljes sejtsűrűség (), a rezisztens plazmiddal rendelkező sejtek teljes sűrűsége (), és az érzékeny plazmiddal rendelkező sejtek teljes sűrűsége (). a replikációs sebesség a sűrűségtől függő halálozási arány az antibiotikumokkal összefüggő halálozási arány a plazmid átviteli sebessége a szegregáció elvesztésének valószínűsége a plazmid szállításának költsége és a rezisztenciagén hordozásának költsége. (1)

A modell paramétereit az 1. táblázat foglalja össze. Várakozásaink szerint a paraméterértékek (azaz az arányok és a költségek) jelentősen eltérnek például a baktériumfajtól, a plazmid típusától, az antibiotikumtól és a környezettől függően. Célunk, hogy egy általánosított rendszer viselkedését minőségileg megértsük, ahelyett, hogy mennyiségi előrejelzéseket készítenénk egy konkrét rendszerről. Ezért a paraméterértékek széles skáláját vizsgáljuk meg (1. támogató információ, 1. rész), ahelyett, hogy egy adott rendszert tükröző paramétereket választanánk ki.

Paraméter Meghatározás Méretek Fő szöveg értéke (SI tartomány) Bistabilitás mikor
Replikációs sebesség Idő −1 1 (0.5, 2) Magas
Halálozási ráta Térfogatcellák −1 alkalommal −1 1 (0.5, 2) Alacsony
Az antibiotikumokkal összefüggő halálozási arány Idő −1 1 (0, 2) Alacsony
Az antibiotikum rezisztencia költsége Mérettelen 0.05 (0, 0.5) Magas
A plazmid szállításának költsége Mérettelen 0.075 (0, 0.5) Alacsony
Plazmid átviteli sebesség Térfogatcellák −1 alkalommal −1 0.2 (0, 0.25) Magas
Szegregációs veszteség Mérettelen 0.005 (0, 0.1) Alacsony
  • jegyzet: Pontosabban, az ötödik oszlop azt jelzi, hogy a bistabilitási régió (ahol a rezisztencia plazmid által terjesztett vagy kromoszómális lehet) magas vagy alacsony paraméterértékeknél fordul elő, összehasonlítva azzal a régióval, ahol csak a kromoszómális rezisztencia evolúciósan stabil (lásd a Támogató információk 1. szakaszát). . A paraméteregységek tetszőlegesek. A fő szövegértékeket úgy választottuk ki, hogy a legjobban illusztrálják az evolúciós stabil eredmények tartományát.

A PLAZMIDOTT ÉS A KROMOSZÓMÁLIS ELLENÁLLÁS EVOLÚCIÓS STABILITÁSA

Érdekel bennünket a kromoszómális és plazmid által hordozott rezisztencia evolúciós stabilitása, vagyis az, hogy a kialakult kromoszómális rezisztencia kiszorítható-e a plazmid által terjesztett rezisztenciával és fordítva. Lineáris stabilitáselemzéssel (lásd Módszerek) meghatározzuk azokat a paramétertartományokat, amelyekben az egyes ellenállástípusok stabilak (2. ábra, valamint S1 és S2). A rezisztenciát választó körülmények között három viselkedést figyelünk meg: a kromoszómális – de nem a plazmid által közvetített – rezisztencia evolúciós stabilitása, a plazmid által hordozott – de nem kromoszómális – rezisztencia evolúciós stabilitása és a rezisztencia mindkét formája evolúciós stabilitása. Ebben a harmadik régióban a rezisztencia vagy a plazmidon, vagy a kromoszómán fordul elő, de nem mindkettőn: a kromoszómális és a plazmid által terjesztett rezisztencia megnöveli a rezisztencia költségeit, miközben nem jár további előnyökkel.

A plazmid- és kromoszómális rezisztencia evolúciós stabilitása. A színek jelzik, hogy a rezisztencia melyik formája evolúciósan stabil: csak kromoszómális rezisztencia (narancssárga), csak plazmid által hordozott rezisztencia (kék) vagy bármelyik (lila). Ha a rezisztencia kromoszómális, az érzékeny plazmid jelen lehet, vagy hiányozhat a populációból (sötét vs világos narancs). A bal oldali panel fehér mezőjében a rezisztencia egyik formája sem stabil (a populáció antibiotikum-érzékeny). A paraméterek értékei: , , . Bal oldali panelhez = 0,075 és . Jobb oldali panelhez és . Az S1 és S2 ábrák több paraméterezés eredményeit mutatják. Ne feledje, hogy abban a paramétertérben, ahol az ellenállás előnyös, vagy elengedhetetlen (: az antibiotikumokra érzékeny sejtek nem életképesek, még a rezisztens sejtekkel való versengés hiányában sem) vagy nem esszenciálisak. Ez a megkülönböztetés nem befolyásolja eredményeink (S1 és S2 ábra).

Csak kromoszómális rezisztencia

Ha csak a kromoszómális rezisztencia evolúciósan stabil, a rezisztencia gének mindig a kromoszómán kötnek ki egy evolúciós időskálán keresztül. A plazmid vagy érzékeny lesz, vagy hiányzik a populációból. Általánosságban (1. táblázat és S1. és S2. ábra) a kromoszómális rezisztencia az egyetlen evolúciós szempontból stabil eredmény, ha a rezisztencia előnyei magasak (magas az antibiotikumokkal kapcsolatos mortalitás, alacsony rezisztencia költség), ha a plazmid alkalmassága alacsony (alacsony). plazmid transzmissziós sebesség, nagy szegregációs veszteség, magas plazmidköltség) és ha a teljes sejtsűrűség alacsony (magas halálozási arány, alacsony replikációs ráta).

Csak plazmidon keresztüli rezisztencia

Ha a plazmid által hordozott rezisztencia evolúciósan stabil, a rezisztencia gének mindig a plazmidon kötnek ki. Megjegyzendő, hogy ebben a régióban a kromoszómális rezisztencia egyáltalán nem stabil (S12. ábra): olyan régiót jelent, amelyben a rezisztencia gének csak vízszintes átvitel esetén maradhatnak fenn (van Dijk et al. 2020). Ez az eredmény csak nagyon specifikus körülmények között jelentkezik (kis paramétertér, amikor a rezisztencia csak csekély fitnesz-előnyt eredményez 2. ábra), és jelenléte érzékeny a modell szerkezetére (pl. az antibiotikum hatás modellezése, lásd S7. ábra). Ezért nem tartjuk ezt ökológiailag elfogadható magyarázatnak arra, hogy miért vannak rezisztencia gének a plazmidokon.

Bistabilitás

Ha mindkét egyensúly evolúciósan stabil, a rezisztencia a kezdeti körülményektől függően kromoszómális vagy plazmid-eredetű lehet. Ha az ellenállás egyik formája kialakult, azt már nem tudja kiszorítani a másik.

A kezdeti feltételektől való függés további vizsgálatához numerikusan szimuláljuk a rendszert, különböző kezdeti sejtsűrűségtől kezdve (lásd Módszerek). Egy olyan forgatókönyvet veszünk figyelembe, amelyben a kezdeti populáció rezisztens sejtekből és érzékeny sejtekből áll (3. ábra). Változtatjuk (i) az érzékeny plazmid kezdeti gyakoriságát az érzékeny populációban (ii) a kromoszómális versus plazmid által hordozott rezisztencia kezdeti gyakoriságát a rezisztens populációban, és (iii) hogy a kromoszómálisan rezisztens sejtek hordozzák-e az érzékeny plazmidot. E szimulációk eredményei (3. és S3. és S4. ábra) betekintést nyújtanak az evolúciós nyomásokba, amelyek háromféleképpen határozzák meg a rezisztencia gének elhelyezkedését.

A kezdeti feltételeknek a rezisztenciagén egyensúlyi helyzetére gyakorolt ​​hatása, amely az evolúciós kimenetet mutatja, mind a plazmid- és kromoszómális rezisztencia kezdeti gyakoriságától, mind az érzékeny plazmid kezdeti gyakoriságától függ. A bal oldali panelek a kezdeti feltételek változásait mutatják be. A jobb oldali panelek azt mutatják, hogy egyensúlyi állapotban plazmid-eredetű (kék) vagy kromoszómális rezisztencia (narancs) figyelhető-e meg. Az x-tengely jelzi az érzékeny plazmid gyakoriságát a kezdeti érzékeny populációban . Az y-tengely a plazmid által hordozott rezisztencia gyakoriságát jelzi a kezdeti rezisztens populációban az A panelhez, a B panel esetében. A plazmidok által terjesztett rezisztencia tipikusabb eredmény a B panelen, mint az A panelen, mivel az érzékeny plazmid jelen van az A panel kezdeti kromoszómálisan rezisztens populációjában. A kezdeti érzékeny és rezisztens populációk összsűrűsége egyaránt 1. (Az ellenállás és az érzékenység kezdeti arányának változtatása nem befolyásolja a minőségi eredményeket – S3. ábra). A paraméterek értékei a következők: , , , = 0.075, , , és .

Először is, a pozitív frekvenciafüggő szelekció jelenléte: a plazmid által hordozott rezisztencia tipikusabb eredmény, ha a plazmid által terjesztett rezisztencia kezdeti gyakorisága magas a kromoszómális rezisztencia gyakoriságához képest. Hasonlóképpen, a kromoszómális rezisztencia magas kezdeti gyakorisága a plazmid által terjesztett rezisztenciához képest kromoszómális rezisztenciához vezet, mint az evolúciós eredmény. Az egyik típusú rezisztencia alkalmassága tehát pozitívan korrelál a gyakoriságával. Ez a frekvenciafüggés abból adódik, hogy a kettősen rezisztens sejtek kevésbé illeszkednek, mint az egyetlen rezisztenciával rendelkező sejtek: a kettős ellenállás többletköltséggel jár, de nem jár további fitneszelőnnyel.Minél nagyobb a kromoszómális rezisztencia gyakorisága, annál nagyobb a valószínűsége annak, hogy egy rezisztens plazmid megfertőz egy kromoszómálisan rezisztens (nem kromoszómálisan érzékeny) sejtet. Ez hátrányosan érinti a rezisztens plazmidot. Hasonlóképpen, minél nagyobb a rezisztens plazmid gyakorisága, annál nagyobb a valószínűsége annak, hogy egy kromoszómálisan rezisztens sejt megfertőződik a rezisztens plazmiddal. Ez hátrányosan érinti a rezisztens kromoszómát. Így minél gyakoribb az ellenállási forma, annál nagyobb az alkalmassága a másik formához képest.

Másodszor, az evolúció eredménye az érzékeny plazmid gyakoriságától is függ. A plazmid által hordozott rezisztencia előnyös, ha az érzékeny plazmid ritka: a plazmid által hordozott rezisztencia tipikusabb eredmény, ha a kezdeti kromoszómálisan rezisztens populáció nem hordozza az érzékeny plazmidot, és ha a plazmid gyakorisága az érzékeny populációban alacsony. Ennek az az oka, hogy az érzékeny plazmid alacsony kezdeti gyakorisága azt jelenti, hogy a plazmid által hordozott rezisztencia vertikálisan (sejtreplikáció) és horizontálisan (plazmidtranszmisszió) is terjedhet, lehetővé téve a frekvencia gyorsabb növekedését, mint a kromoszómális rezisztencia.

Harmadszor, összességében a kromoszómális rezisztencia tipikusabb eredmény ezekben a szimulációkban, mint a plazmid által hordozott rezisztencia. Ennek az az oka, hogy a plazmid által terjesztett rezisztencia a kromoszómális rezisztenciával ellentétben szegregációs veszteséggel jár: nem mindig öröklődik a sejtreplikáció során. Valójában a szegregációs veszteség valószínűségének növelése kedvez a kromoszómális rezisztenciának (S4. ábra).

AZ EREDMÉNYEK ROBUSTUSSÁGA

Ezeknek az eredményeknek a robusztusságát teszteljük a modell szerkezetére vonatkozó számos feltételezés alapján (lásd a Módszerek és támogató információk 2. szakaszát). Az általános eredmény az, hogy a bistabilitás jelenléte robusztus, bár a bistabilitási régió mérete változhat. Az egyetlen döntő feltevés a pozitív frekvenciafüggéshez, hogy a kettős ellenállás kevésbé előnyös, mint az egyetlen ellenállás (S5 és S6 ábra). Más szavakkal, a kettős ellenállásból származó többletköltség megszüntetése, vagy a kettős ellenállás előnyeinek olyannyira növelése, hogy az meghaladja ezt a többletköltséget, megszünteti a bistabilitási régiót. Ilyen körülmények között a kettős rezisztencia dominál (azaz a populáció egy kromoszómálisan rezisztens populációban keringő rezisztens plazmidból áll majd).

Különösen két érzékenységi elemzés eredményeit érdemes kiemelni. Először is, eredményeink robusztusak a plazmid és a kromoszóma közötti génáramlás (például a rezisztenciagén transzpozíciója) beépítésére. A génáramlás lehetővé teszi, hogy az egyébként kizárt rezisztenciaforma alacsony frekvencián is fennmaradjon (a mutáció-szelekciós egyensúlyhoz hasonlóan), és növeli a kromoszómális rezisztenciához vezető kezdeti feltételek tartományát (S8. ábra). Ezek a hatások azonban csak irreálisan magas átültetési arány esetén válnak jelentőssé (Támogató információk, 2.4. szakasz) (Sousa et al. 2013). Másodszor, a bistabilitás jelenléte robusztus az állandó antibiotikum nyomás helyett ingadozó modellezéshez. Időszakától függően a fluktuáció kedvezhet a plazmid által hordozott rezisztenciának, növelve annak a paramétertérnek a méretét, amelyben csak a plazmid által hordozott rezisztencia evolúciósan stabil (S10. ábra).

KAPCSOLAT A KORÁBBI MODELLEZÉSI EREDMÉNYEKHEZ

Ezután újra áttekintünk néhány korábbi modellezési eredményt. Amint azt a bevezetőben tárgyaltuk, a korábbi modellezések azt jósolják, hogy a lokálisan előnyös tulajdonságok inkább a plazmidon keresztül, mint a kromoszómálisan származnak, így komplementer hipotézist adnak arra vonatkozóan, hogy bizonyos gének miért telepednek meg a plazmidokon (Bergstrom et al. 2000). Azonban a modell, amelyből ez az előrejelzés származik, feltételezi, hogy a plazmid hiányzik a helyi réseken kívül. Ezért azt kérdezzük, hogy a lokális adaptáció kedvez-e a plazmid által hordozott rezisztenciának, ha az érzékeny plazmid a helyi résen kívül is fennmarad. Módosítjuk a modellünket, hogy az érzékeny sejtek beáramlását tartalmazza, és változtatjuk az érzékeny plazmid gyakoriságát ezekben a bejövő sejtekben (Támogató információk, 3. szakasz). Ez egy olyan forgatókönyvnek felel meg, amelyben az ellenállás lokálisan előnyös a modellezett környezetben, de máshol nincs kiválasztva. Ahogy a 4. ábrán látható, az érzékeny sejtek beáramlása érzékeny plazmid nélkül valóban kedvez a plazmid által terjesztett rezisztenciának, amint azt korábban javasolták (Bergstrom és mtsai, 2000). Az érzékeny sejtek beáramlása azonban az érzékeny plazmiddal elősegíti a kromoszómális rezisztenciát. Ennek a hatásnak az erőssége az érzékeny sejtek beáramlási sebességétől függ. Így a lokális adaptáció csak akkor kedvez a plazmid által hordozott rezisztenciának, ha az érzékeny plazmid gyakorisága alacsony a lokális résen kívül.

A lokálisan előnyös rezisztenciagén elhelyezkedése (kromoszómális vagy plazmid által hordozott) az érzékeny plazmid jelenlététől függ a bevándorló sejtekben. A kezdeti populáció teljesen rezisztens (a 3. ábra A paneljének megfelelő, érzékeny plazmidot hordozó kromoszómálisan rezisztens sejtekkel), y-tengely jelzi a plazmid által terjesztett rezisztencia gyakoriságát ebben a kezdeti populációban . Az x-tengely jelzi az érzékeny plazmid gyakoriságát a bevándorló sejtekben. A plazmid jelenléte ezekben a bevándorló sejtekben elősegíti a kromoszómális rezisztenciát. A magas beáramlási arány az , az alacsony beáramlási arány az . A többi paraméter értéke: , , , = 0.075, , , és .

Másodszor, újra megvizsgáljuk a plazmidperzisztenciával kapcsolatos eredményeket. A korábbi modellezési munkák azt sugallták, hogy ha a plazmid alkalmassága túl alacsony ahhoz, hogy a plazmidok tiszta parazitaként fennmaradjanak (azaz anélkül, hogy a gazdasejt számára előnyös géneket hordoznának), a hasznos gének mindig a kromoszómán helyezkednek el, nem pedig a plazmidon (helyi adaptáció hiányában, Bergstrom). et al. 2000). Így az alacsony áteresztőképességű plazmidok perzisztenciája paradoxon: nem tarthatók fenn jótékony gének nélkül, de jótékony gének nem tarthatók fenn ezeken a plazmidokon (Bergstrom et al. 2000).

Ezt a jóslatot modellünkben teszteljük (a 4. Támogatási szakaszban részletezve) annak a paraméterternek a összehasonlításával, amelyben a plazmid által hordozott rezisztencia evolúciósan stabil (azaz a rezisztencia gének a kromoszómális rezisztencia által okozott versengés jelenlétében is elhelyezkedhetnek a plazmidon). azzal a paramétertérrel, amelyben a parazita plazmid fennmaradhat (vagyis egy érzékeny plazmid fennmaradhat egy kromoszómára érzékeny populációban). Azt találtuk, hogy a korábbi eredmények nem érvényesek az itt bemutatott modellszerkezetre: a rezisztencia gének a kromoszóma helyett a plazmidon helyezkedhetnek el, még akkor is, ha a plazmid transzmissibilitása túl alacsony ahhoz, hogy a plazmid parazitaként fennmaradjon (S11. ábra). Ez azt jelenti, hogy elméletileg létezhetnek alacsony áteresztőképességű plazmidok, amelyek pusztán a gazdasejtek számára nyújtott előnyük miatt fennmaradnak. Érdemes azonban megjegyezni, hogy kicsi a paramétertér, amelyben ez előfordul (S11. ábra).

A MEGSZERZÉS ARÁNYA MEGHATÁROZza az ELLENÁLLÁSGÉN HELYET

Eddigi eredményeink azt mutatják, hogy a mérsékelten előnyös gének (azaz a bistabil paraméterrégióban lévők) esetében a pozitív frekvenciafüggő szelekció jelenléte azt jelenti, hogy a plazmid által hordozott rezisztencia evolúciósan stabil lehet a szegregációs veszteség ellenére. Ez a frekvenciafüggő szelekció önmagában nem elegendő magyarázat arra, hogy a rezisztencia gének miért plazmidokon keresztül terjednek. Mindazonáltal azt sugallja, hogy a rezisztencia (plazmid által terjesztett vagy kromoszómális) formáját először szerezzük meg, valószínűleg kialakul a populációban: ha az első rezisztenciaformának van ideje, hogy sűrűsége növekedjen a másik forma megszerzése előtt, a nagyobb gyakoriság fitneszelőnyt biztosít. Az első ellenállástípusnak nem kell fixálást elérnie, hogy megakadályozza a másik invázióját: a frekvenciafüggő előny még alacsony összellenállási frekvenciákon is kellően erős (S13. ábra). Ezért, ha az ellenállás megszerzésének sebessége alacsony a megszerzett ellenállás-gyakoriság növekedési üteméhez képest, az ellenállás első formája fennmarad.

Így a rezisztencia gének jelenléte a plazmidokon azzal magyarázható, hogy a plazmid által hordozott rezisztencia megszerzésének sebessége magasabb, mint a kromoszómális rezisztencia megszerzésének sebessége. Valójában a konjugatív plazmidtranszfer sebessége általában magasabb, mint a kromoszómális horizontális géntranszfer sebessége (egy kísérleti mérések összehasonlításán alapuló becslés szerint a magasabb, bár ez valószínűleg erősen kontextusfüggő Nazarian et al. 2018). Ezenkívül számos baktériumfaj esetében a rezisztenciagén megszerzésének elsődleges mechanizmusa valóban a rezisztenciát hordozó plazmidok fajok közötti átvitele (Baker et al. 2018 MacLean és San Millan 2019).

Ennek az elképzelésnek a formalizálására kidolgozunk egy egyszerű modellt a rezisztencia megszerzésére több fajban (5. ábra és „Módszerek” rész). Modellezünk faj egy rezisztenciagén, amely minden faj számára előnyös, és egy plazmid, amely átvihető a fajok között, és minden fajban megmarad (akár azért, mert széles gazdakörrel rendelkezik, akár azért, mert tartománya eltolódhat vagy kiterjeszthető az átvitelt követően Loftie-Eaton et al. 2016 ). A rezisztencia lehet plazmid által hordozott vagy kromoszómális. Miután egy faj megszerezte a rezisztencia egy formáját, ez a rezisztenciaforma megszilárdul, és többé nem pótolható (a pozitív frekvenciafüggő szelekció miatt). Feltételezzük, hogy a rezisztencia gének csak de novo jelennek meg a kromoszómán (a sebességgel ). A gén a kromoszómális rezisztencia fajok közötti horizontális átvitelével (pl. transzformációval) terjedhet (gyorsasággal) ), vagy rezisztenciaplazmidok fajok közötti átvitele (sebességgel ). Feltételezzük, hogy a gén alacsony sebességgel tud mozogni a plazmid és a kromoszóma között, ami lehetővé teszi, hogy az egyébként kizárt rezisztenciaforma alacsony gyakorisággal fennmaradjon. Nem kifejezetten modellezzük ezt az együttélést, de modellezzük az alacsony frekvenciájú forma vízszintes átvitelét (sebességgel a plazmid által terjesztett rezisztenciára és sebességre kromoszóma rezisztenciára, ahol az alacsony frekvenciájú forma gyakorisága).

A plazmid által terjesztett rezisztencia prevalenciája. A panel: A modell szerkezetének ábrázolása. rezisztenciagén nélküli fajt képvisel a rezisztenciagént tartalmazó fajok a plazmidon olyan fajok, amelyek kromoszómájában rezisztenciagén található. az a sebesség, amellyel a rezisztencia mutáció révén keletkezik a plazmid által terjesztett rezisztencia fajok közötti átvitelének sebessége a kromoszómális rezisztencia fajok közötti átvitelének sebessége és rögzíti a génáramlást a plazmid és a kromoszóma között. B panel: A plazmid által terjesztett rezisztencia aránya a szimulált fajok számától és a kromoszómák fajok közötti átvitelének arányától függ () és plazmid által hordozott gén (). A vízszintes szaggatott vonalak a plazmid rezisztencia maximális arányát mutatják, mivel a rezisztenciának először a kromoszómán kell megjelennie (). A hibasávok 95%-os konfidenciaintervallumot jelentenek, 1000 realizálás alapján. A paraméterek a következők voltak: , és . Az alternatív paraméterezések eredményeit az S14 ábra mutatja.

Ezt a rendszert sztochasztikusan szimuláljuk (lásd a „Módszerek” részt), abból indulva ki, hogy egyetlen faj sem rendelkezik rezisztenciagénnel. Az 5. ábra a plazmid által terjesztett rezisztenciával rendelkező fajok arányát mutatja, miután a gén minden fajra átterjedt. Ahogy az várható volt, a plazmid által hordozott rezisztenciával rendelkező fajok aránya a fajok közötti plazmidtranszfer sebességével nő. Ráadásul ez az arány a modellezett fajok számával is növekszik. Ez a hatás két okból következik be. Először is, a gén kezdeti de novo megjelenésének a kromoszómán kell lennie. Így például, ha csak két fajt modelleznek, a plazmid által terjesztett rezisztencia csak a két faj egyikében fordulhat elő. Másodszor, a fajok közötti átvitel sebességének hatása a potenciális donorfajok számával nő. Ezek az eredmények robusztusak a különböző paraméterezéshez (S14. ábra).


A bakteriális plazmidok evolúciója és a szelekció szintjei

A különböző reproduktív, például bakteriális plazmidok és kromoszómák közötti génáramlás szokatlan problémákat okoz az evolúciós elemzésben. Sokkal inkább, mint az eukariótáknál, a plazmid evolúciójának megértéséhez egyidejűleg figyelembe kell venni a szelekciós gének, transzpozonok, plazmidok, sejtek és klónok számos szintjén reproduktív előnyöket. Konfliktushelyzetekben nem érvényesül következetesen semmilyen szint, és egyes szaporodási egységek olyan géneket hordoznak, amelyek korlátozzák saját szaporodásukat vagy túlélésüket, nyilvánvalóan azért, hogy fokozzák az ezeket hordozó magasabb szintű reproduktív egységek szaporodását vagy túlélését. A plazmidok és kromoszómák közötti génáramlás ellenére bizonyos funkciókat végző gének erős hajlamot mutatnak a plazmidokon, míg mások következetesen a kromoszómákon fordulnak elő. A plazmidokhoz általában társított funkciók változatosak, de mindegyik csak lokálisan korlátozott összefüggésekben használható. Az érvelés szerint a plazmidok nagyobb horizontális (generáción belüli) átvitelének szelektív következményei felelősek ezért a mintáért. Az a tendencia, hogy a prokarióta transzpozonok, amelyek szintén horizontálisan mozgékonyak, a plazmidokon szokásos génekhez hasonló géneket hordoznak, alátámasztja ezt az érvet. Az eukarióta plazmidok és transzpozonok nyilvánvaló tendenciája, hogy hiányoznak ezek a karakterek, szintén összhangban vannak a lokális adaptációs hipotézis előrejelzéseivel, mivel ezeken a genetikai egységeken lévő gének általában nem mozgékonyabbak horizontálisan, mint a kromoszómális gének. Elméleti okok alapján feltételezhető, hogy a plazmidgének gyorsabban fejlődnek, mint a kromoszonális gének.


Eredmények

A karakterisztikus példányszámok létezése

Kezdjük azzal, hogy figyelmünket egyetlen sejtre összpontosítjuk, amely replikációs profiljuk tekintetében azonos plazmidok populációját tartalmazza. Kezdetben figyelmen kívül hagyjuk a replikáció és a sejtosztódás sztochasztikus természetét, és a kópiaszámot folyamatos változónak tekintjük, mind a gazdaszervezet növekedését, mind a kópiaszámot determinisztikus differenciálegyenletek írják le (lásd az 1. és 2. egyenletet az S1 kiegészítő szövegben). Modellünk lehetővé teszi, hogy kapcsolatot állapítsunk meg a plazmidok száma között a sejtciklus elején () és a plazmidok száma a sejtciklus végén a sejtosztódás időpontjában (), ahol a plazmidok számát jelenti a kapott leánysejtekben, feltételezve, hogy a sejtosztódás során kiegyenlítődnek. A 2. ábra egy tipikus kapcsolatot mutat be között és , ami a plazmid replikációs sebességétől függ, ami viszont a plazmid paramétereinek függvénye , és (lásd a 2. egyenletet). Az eredeti sejtben lévő plazmidok kezdeti számától függően , a kapott leánysejtekben vagy kevesebb lesz (), több () vagy annyi plazmid (), ahogyan a szülősejtjük eredetileg tartalmazta. Az utóbbi eset egy adott kópiaszám nemzedékek közötti egyensúlyát jelenti egy adott plazmidparaméter-értékkészlethez. Ez az egyensúly lehet stabil vagy instabil, attól függően, hogy a rendszer hogyan reagál a példányszám ingadozásaira. A stabil egyensúly feltételei, ahol a stabil jellemző példányszám a következőképpen határozható meg:

hogy amikor egy cellában kevesebb mint plazmidok a sejtciklus elején, a plazmidok túlszaporodnak, és amikor több mint plazmidok, a plazmidok alulreplikálódnak. Mindkét esetben, amely a plazmid replikációjának sztochaszticitása vagy a sejtosztódás során bekövetkező szegregáció eredményeként alakulhat ki, a tendencia a jövőbeli egyensúlyi sejtciklus felé mutat. ismét plazmidok. Stabil jellemző példányszámra példa a 2. ábrán kitöltött körrel jelölt pont. Az ugyanazon a görbén nyitott körrel jelölt pont egy instabil egyensúlyi kópiaszám, amelynek bármilyen zavarása a plazmid túl- vagy alulreplikációjához vezet, ez utóbbi esetben jelen esetben a stabil egyensúly felé való elmozdulást eredményez.

Mindegyik görbe a plazmidok száma közötti determinisztikus kapcsolatot ábrázolja a szülősejtciklus kezdetén és a plazmidok száma a leánysejtciklus kezdetén (feltéve, hogy a sejtosztódás során kiegyenlítődnek), a kezdeti kópiaszámok tartományára valamint sejt- és plazmidparaméterek rögzített halmaza. Az átló a szülő- és leánysejtek közötti kópiaszámok konzisztenciáját jelenti. Az átló alatti pontok a plazmid alulreplikációját, míg az átló feletti pontok a plazmid túlreplikációját jelzik. A görbe alakja és metszéspontja az átlóval a plazmid paraméterértékeitől függ. A görbék nem metszik egymást az átlóval, a plazmidok konzisztens alul- vagy túlreplikációját jelentik bármilyen kezdeti kópiaszám esetén (kék alacsony görbe és cián magas görbe rendre). Az egyes görbék felső vége egy határértéknek felel meg, amelyen túl a sejt nem tudja fenntartani plazmidpopulációját a sejthalálhoz vezető negatív sejtnövekedési sebesség miatt. A médiumon körökkel jelölt pontok görbe (zöld) egyensúlyi másolatszámokat jelöl, a kitöltött kör a stabilitást és a jellemző példányszám meglétét, míg a nyitott kör az instabil egyensúlyt jelzi. A kritikus Az átlót érintő görbe (piros) a stabilitás határát (élét) jelöli, amelyben a stabil és instabil karakterisztikus példányszámok szinguláris pontba esnek össze.

A plazmidstabilitás határai

A plazmid replikációs paramétereinek bármilyen konfigurációjához , és , meg tudjuk határozni, hogy létezik-e stabil karakterisztikus másolatszám, mi az értéke, és mi a megfelelő cella alkalmassága, amelyet az idő reciprokaként definiálunk. szükséges a sejt osztódásához. A 3. ábra a plazmidparaméterek terének feltárásának eredményeit mutatja be két különböző CNC-rezsim esetében. Először is megvizsgáljuk azt az esetet, amikor a plazmidok önmeghatározott replikációs sebességgel rendelkeznek, függetlenül attól, hogy ugyanabban a gazdaszervezetben vannak-e más plazmidok (, NO-CNC). Ebben az esetben a kópiaszám szabályozásának egyetlen mechanizmusa a plazmid önkorlátozás (amely formájában ), amit a korai elméleti megközelítések “passzív” másolatszám-szabályozásnak neveztek [36]. Másodszor, megvizsgáljuk a kópiaszám és a plazmid replikációs sebessége közötti aktív negatív visszacsatolási hurkot, amely transz-ható replikációs inhibitorok szintézisén keresztül valósul meg., val vel , CNC).

Stabil (szilárd) és instabil (szaggatott) egyensúlyi másolatszámok egyetlen sejt esetében a bazális plazmid replikációs sebességének függvényében számára és a kötési affinitás különböző értékei (kék a zöld számára piros számára ).A sejtfitness értékei (a sejtosztódási idő reciprokaként számítva ), amelyek megfelelnek a stabil jellemző példányszámoknak, az alsó panelen láthatók. A stabil és instabil egyensúlyi kópiaszámok egy szinguláris pontig esnek össze (a kópiaszám stabilitásának széle, amint azt a kritikus görbe a 2. ábrán), amelyet egy színes függőleges szaggatott vonal jelöl, amelyen túl nincs jellemző kópiaszám, azaz a plazmidok túlreplikálódnak bármely kezdeti kópiaszámhoz. Az a határ, amely alatt a stabil jellemző példányszám nullává válik . Abban az esetben, ha (kék vonalak), a stabilitás széle egybeesik a sejt maximális alkalmasságával (zöld, piros vonalak), a gazdagép alkalmassági csúcsát szuboptimális paraméter-konfigurációk veszik körül, amelyeket a másolatszám tekintetében a stabilitás jellemez.

Az előbbi esetben (NO-CNC) megfigyeltük, hogy a rendszer stabil, nullától eltérő karakterisztikus kópiaszámmal rendelkezik a bazális plazmid replikációs sebesség rendkívül korlátozott régiójában. . Ezt a stabil régiót a plazmidok instabilitási régiói veszik körül, amelyeket a plazmidok következetes alul- vagy túlreplikációja jellemez bármely kezdeti kópiaszámhoz (ezt az alacsony és magas kópiaszám jellemzi). görbék a 2. ábrán). A plazmid stabilitásának tartományán belül a sejt fittsége növekszik egy kritikus pontig, amely az instabilitás felé való átmenetet jelzi, ahol a plazmidok következetesen túlreplikálódnak. Ezért CNC nélkül az intercelluláris szelekció kedvez a plazmid replikációs sebességének növelésének (), mivel ez magasabb sejtfitnesst jelent, amíg el nem érjük a plazmid instabilitás kritikus pontját. Ez az átmenet (a 3. ábrán függőleges szaggatott vonallal jelölve) maximális sejtfitness esetén következik be, és a stabil és instabil egyensúlyi kópiaszámok szinguláris másolatszámmá való összeomlása jellemzi. (olyan esemény, amelyet a kritikus rögzít görbe a 2. ábrán). A következetes túlreplikáció a jövőbeni sejtciklusokat eredményezi növekvő számú plazmiddal, ami végül plazmidrobbanáshoz és sejthalálhoz vezet. A CNC rendszer aktiválása (, val vel ) hatékonyan kiszélesíti a plazmid stabilitásának tartományát, és döntően leválasztja az instabilitás átmenetét az optimális sejtnövekedés pontjától. Ennek eredményeként a plazmid replikációs paramétereinek azon konfigurációját, amely optimális sejtnövekedést eredményez, most szuboptimális, ugyanakkor stabil régiók veszik körül. Ilyen körülmények között a sejtközi szelekció a megnövekedett sejtosztódási sebesség érdekében a stabil kópiaszámú plazmidokat tartalmazó sejteket részesítené előnyben.

Plazmidstabilitás és gazdaszervezet növekedése

Korábbi szimulációink azt mutatták, hogy ha a sztochaszticitást figyelmen kívül hagyjuk, akkor a sztochaszticitásnak csak korlátozott tartománya van amely lehetővé teszi a plazmid replikációjának stabilitását. CNC hiányában a sejtosztódási sebesség optimalizálása a plazmid replikációs sebességét eredményezné a stabilitás határán, míg a CNC jelenléte kiszélesíti a stabil replikációs sebességek tartományát, és olyan helyzetet teremt, amelyben az optimális sejtfitt ennek a stabilitási régiónak a belsejében található. Most az általunk eddig figyelembe vett determinisztikus egysejtű keret kiterjesztésével folytatjuk, hogy megvizsgáljuk a plazmid stabilitását és a gazdaszervezet teljesítményét olyan sztochasztikus többsejtű szimulációk kontextusában, amelyek leírják a gazdaszervezetek aszinkron növekedését és osztódását (vagy halálát), valamint a plazmidok autonóm replikációját a szervezeten belül. olyan házigazdák. A sztochaszticitást a plazmid replikációjában úgy vezetjük be, hogy figyelembe vesszük a plazmidok replikációs eseményeinek várható számát minden egyes gazdaszervezetben minden egyes diszkrét időpontban Poisson-eloszlásúnak, a 2. egyenletben meghatározottak szerint (további részletekért lásd az S1 kiegészítő szöveget).

Egy adott törzs teljesítménye egy ilyen sztochasztikus szimulációban, amelyben a gazdaszervezeteket azonos replikációs paraméterértékekkel rendelkező plazmidokkal fertőzték meg, úgy értékelhetjük ki, hogy az átlagos nettó gazdanövekedési sebességet az átlagos gazdaosztódás és a halálozási arány különbségeként számítjuk ki. A 4. ábra a független törzsek eredményül kapott fittségi helyzetét mutatja be a plazmidreplikációs paraméterek megfelelő értékeinek függvényében. és adott . Megjegyezzük, hogy a plazmidpopuláció homogenitása miatt a paraméterek és felcserélhetők (lásd még a 2. egyenletet), és mint ilyenek, a fitneszkörnyezet és adott megegyezik a fitnesz tájjal és adott . A plazmid stabilitásának régióját ezen a tájon a nettó gazdanövekedési ráta gradiense uralja, ami egy olyan optimális növekedési területhez vezet, ahol a rendtartásnak való engedelmesség maximálisan erős (). Csakúgy, mint az egysejtű determinisztikus esetben, a stabil régiót a plazmid instabilitási régiói veszik körül, amelyekben a plazmidok eliminálódnak a gazdapopulációból, a stabil jellemző kópiaszám hiánya miatt. és a plazmidok következetes alul- vagy túlreplikációja. A következetes alulreplikáció a plazmidok fokozatos hígulásához és végső eltűnéséhez vezet a populációból (a 4. ábrán a stabil régió alatti fehér terület). A következetes túlreplikáció megnövekedett kópiaszámhoz vezet, ami lelassítja a sejtnövekedést (lásd még az 1. egyenletet), több időt biztosítva a plazmidok replikációjához, ezáltal tovább veszélyeztetve a sejtnövekedést. Mint ilyenek, a sztochasztikus szegregációs hibákból eredő plazmidmentes gazdaszervezetek képesek kinőni a túlfertőzött gazdákat, amíg a populáció teljesen plazmidmentes lesz (a 4. ábrán fehér terület a stabil régió felett). Extrém plazmidönzés esetén (magas , alacsony ), a gazdapopuláció összeomlik a túlzott plazmid-túlreplikáció súlya alatt, mielőtt a plazmidmentes szegregánsok lehetőséget kapnának arra, hogy túlnőjenek a túlfertőzött gazdákon, és plazmidmentes populációt alkossanak (fekete klaszterek a 4. ábrán).

A hőtérkép a populáció nettó átlagos növekedési ütemét mutatja (az átlagos osztódási és halálozási ráta közötti különbségként kifejezve) a plazmid replikációs paramétereinek függvényében. és , három független sztochasztikus többsejtű szimulációból átlagolva plazmid homogenitással (mutációk nélkül) és rögzített sebességgel az inhibitor termelésének. A stabil régió alatti és feletti fehér területek a plazmid paramétertér azon régióit jelentik, amelyekben a plazmidok eliminálódnak a populációból a következetes alul- vagy túlreplikáció miatt. A bal felső sarokban lévő fekete klaszterek a gazdapopuláció összeomlását jelzik a túlzott plazmidreplikáció súlya alatt. A vízszintes szaggatott vonal jelzi az értékét amelyeknél a rendszer eléri az optimális növekedést (lásd 5. ábra). Végül a fekete létraszerű út körvonalazza a CNC evolúcióját egy sztochasztikus szimulációban, ahol és valószínűséggel mutálódnak és fix kamatozású az inhibitor termelésének.

Az engedelmesség szintjei és a replikációszabályozás hatékonysága

A plazmid replikációjában és a sejtosztódás során bekövetkező szegregációban tapasztalható sztochaszticitások a populációban a kópiaszámok eloszlását idézik elő, amely a szimuláció során minden plazmiddal fertőzött gazdaszervezetben előfordul. Feltártuk az engedelmesség hatásait ( vagy a rendõrség , mivel ezek a plazmidpopuláció homogenitása miatt felcserélhetők) ezen eloszlások jellemzőire, figyelembe véve a fitnesz-környezet keresztmetszetét a plazmidok bazális replikációs sebességének rögzített értékéhez. , ami megfelel az optimális nettó növekedési rátának maximális CNC mellett (). A gyenge CNC-rendszer a fitnesz táj ezen keresztmetszete mentén () instabil, és a plazmidok végül eliminálódnak a populációból (lásd az 5. ábrát). A kópiaszám-eloszlások szélessége ebben a rezsimben a kópiaszámok széles körű variációját és eltolódását tükrözi a populációban a sztochasztikus kópiaszám-ingadozások felerősödése miatt [15]. Az eloszlások átalakulása az engedelmesség köztes tartományában kezdődik (), egy tiszta csúcs megjelenésével azonban a nehéz farok jelenléte a plazmid replikációs instabilitásának fennmaradását jelzi. Ezeket az instabilitásokat minimálisra csökkentik az erős CNC tartományban (), mivel az eloszlások fokozatosan kevésbé torzulnak, a sztochasztikus kópiaszám-ingadozások szabályozásának hatékonyságának növekedése és a kópiaszám-változás ennek megfelelő csökkenése miatt. Ugyanakkor a disztribúciók átlagos példányszáma közötti eltérés és a példányszámot amely a gazdaszervezet növekedéséhez optimális (lásd még az 1. egyenletet), az engedelmesség növekedésével alacsonyabb lesz , így a nettó átlagos gazdanövekedés felgyorsul az optimális sebességig maximális CNC mellett ().

Az engedelmesség hatásai (a példányszám ellenőrzésének növelése ) a plazmid kópiaszámának eloszlásáról a plazmidok alapreplikációs sebességének rögzített értékéhez , úgy választottuk meg, hogy a populáció erre az értékre való alkalmassága optimális legyen maximális CNC mellett (lásd a 4. ábrán a vízszintes szaggatott vonalat). A gyenge CNC rendszer () instabil, és a plazmidok végül eliminálódnak a populációból. Másolatszám-eloszlások vannak megadva a különböző értékeire (bal felső kék a , zöld számára , piros a , cián a bíbor pedig azért ). Az eloszlásokat az összes plazmiddal fertőzött gazdaszervezet kópiaszámának rögzítésével számítottuk ki egy többsejtű sztochasztikus szimuláció során. Az átlagos példányszám közötti eltérés és a példányszámot hogy a gazdaszervezet növekedéséhez optimális, függvényében adjuk meg (jobbra fent), valamint a szórást (bal alsó) és a ferdeség (jobbra lent) a példányszám-eloszlások.

A kollektív korlátozás evolúciója

Miután megvizsgáltuk a homogén plazmid-kooperáció hatását a gazdaszervezet növekedésére és a plazmid stabilitására, most azt kérdezzük, hogy ezek a hatások hogyan befolyásolják a plazmid replikációs paramétereinek alakulását a szelekciós szintek közötti konfliktus tágabb összefüggésében. Ebből a célból plazmidvariációt vezetünk be többsejtű sztochasztikus szimulációinkban: minden plazmid replikációs esemény magában foglalja a mutáció valószínűségét , ebben az esetben a plazmid pontosan egy, azonos valószínűséggel véletlenszerűen kiválasztott replikációs paraméterének értéke módosul.

Kezdve a plazmidok kezdeti populációjával, amelyek nem reagálnak az inhibitorokra (pl. ), megengedjük és fix arányú inhibitortermelés mellett fejlődni . Az ebből eredő evolúciós dinamika, amelyet a 4. ábra mutat be, a hatékony replikációszabályozás kialakulását mutatja, amelyet a sejten belüli szelekció közötti szinergiák vezérelnek, amelyek elősegítik az azonnali plazmid szaporodási növekedést (nagyobb önzés). , alacsonyabb engedelmesség ), valamint az intercelluláris szelekció, amely kedvez az evolúciós kiigazításoknak a plazmid paramétertér azon régiói felé, ahol a nettó gazdanövekedési sebesség nő. Valójában és a sztochasztikus kópiaszám-ingadozások tranziens és epigenetikai természete miatt a sejtek közötti szelekció a néhány generáció alatt felhalmozott nettó gazdanövekedési sebességen, és ezért a plazmidreplikáció bizonyos konfigurációihoz kapcsolódó kópiaszám-eloszláson működik. paraméterek [27]. Mint ilyenek, az intercelluláris szelekció által kedvelt evolúciós kiigazítások kooperatív plazmidparaméter-mutációk formájában jelentkeznek, mint például a fokozott plazmid-önkorlátozás (alacsonyabb önzés). ) vagy fokozott érzékenység az inhibitorral szemben (nagyobb engedelmesség ), amelyek megváltoztatják a plazmid replikáció módját, hogy biztosítsák egyrészt az optimális közötti eltérések csökkentését. és jelent példányszámban, másodsorban pedig a példányszám-ingadozások nagyságában (vagyis a példányszám-eloszlás változásában). Ily módon a CNC evolúciója önző és együttműködő plazmidparaméter-mutációk növekvő sorozatával bontakozik ki, amelyek a gazdaszervezet fitnesz tájának gradiense mentén alakulnak ki, és a rendszert a maximális CNC mellett az optimális gazdanövekedés régiója felé vezetik. A további eszkalációt a plazmid paraméterértékekre szabott korlátok megakadályozzák, ha ezek a korlátok hiánya olyan kilincselő hatást váltana ki, hogy az önző és együttműködő mutációk egymásutánja a végtelenségig folytatódna, amit csak a plazmidban szerepet játszó megfelelő faktorok előállítási költségei korlátoznak. replikáció (iniciátorok és inhibitorok).

Ugyanazt a kooperatív eredményt (egy hatékony CNC rendszer evolúcióját) kapjuk, ha mindhárom plazmid replikációs paramétert engedélyezünk , és kifejlődni egy kezdeti állapotból, ahol a plazmidok sem termelnek () sem válaszol () inhibitorokhoz (lásd a 6. ábrát). Ebben az esetben a kooperatív mutációk lehetnek cisz-specifikusak (nagyobb engedelmesség ), mint korábban, vagy transz-specifikus (nagyobb rendfenntartás ), ebben az esetben olyan mutáció, amely növeli a sebességet Az egyes plazmidok inhibitortermelése nemcsak a mutánsra, hanem az intracelluláris replikációs készletben lévő összes plazmidra is hatással lesz (a kifejezés a 2. egyenletben). A cisz-specifitása Ez azt jelenti, hogy az inhibitorral szembeni nagyobb érzékenységet kiváltó kooperatív mutáció intracelluláris szinten költséges, mivel csökkenti a mutáns esélyét arra, hogy azonnali reprodukciós sikert érjen el a replikációs készletben. A transz-specifikussága kényszerítő elemet vezet be az együttműködésbe, mivel az inhibitorok termelése szabályozza az összes plazmid replikációját a poolban. Lehetőséget teremt a szubverzív plazmid stratégiákra is, amelyek szerint az egyes plazmidok előnyre tehetnek szert a replikációs készletben azáltal, hogy buzgón termelik az inhibitort (high policing). ), miközben fenntartja az alacsony érzékenységet (engedelmesség ) maguknak az inhibitoroknak. Ennek ellenére az opportunista viselkedés lehetősége nem akadályozza meg a rendészeti CNC mechanizmus megjelenését. Valójában azt találtuk, hogy a plazmid paraméterek változása a sejten belül meglehetősen alacsony (lásd az 1. táblázatot), így a gazdaszervezeteket többé-kevésbé homogén plazmidpopuláció lakja (azaz a plazmidok erős rokonságban állnak sejten belüli szomszédaikkal). a gazdaszervezetek közötti plazmidvándorlás (horizontális transzmisszió) hiányára. A plazmidok homogenitásának mértéke körülbelül egy nagyságrenddel csökken a gazdaszervezetek között, összehasonlítva a gazdaszervezeteken belüli értékével, így létrejön a gazdaszervezet növekedési különbsége, amelyen a sejtközi szelekció működik, előnyben részesítve a plazmid replikációjának szigorúbb szabályozását.

Átlagos plazmid paraméterértékek (kék), (zöld) és (piros) idővel, mutatja a CNC mechanizmus fejlődését sztochasztikus többsejtű szimulációkban, mutációs valószínűséggel . Az eredményeket 50 független szimuláción átlagolták, azonos kezdeti feltételek mellett.

Asztal 1

házigazdákon belülházigazdák között
A táblázat összefoglalja a plazmid replikációs paramétereinek intracelluláris (gazdaszervezeten belüli) és sejtközi (gazdaszervezetek közötti) változásait, standard eltérésként kifejezve. , időbeli átlagolással és 50 független sztochasztikus többsejtű szimuláción keresztül (a megfelelő plazmid paraméterek átlagai a 6. ábrán láthatók). Az intracelluláris variációt a gazdaszervezeten belüli összes plazmidra a gazdaszervezet intracelluláris átlagához viszonyítva számítjuk ki, és a populáció összes gazdaszervezetére átlagoljuk. Az intercelluláris variációt az összes gazdaszervezet sejten belüli átlagára számítjuk ki, a populáció (globális) átlagához viszonyítva.

A rendészeti költségek hatása a CNC fejlődésére

Megvizsgáltuk a rendészeti költségeknek a kollektív korlátozások alakulására és a lakosság általános teljesítményére gyakorolt ​​hatását egy további költség kifejezés bevezetésével. az 1. egyenletben, ahol a gazdaszervezet által fizetett inhibitor egységenkénti előállítási költsége. Ez azt jelenti, hogy jelenleg a sejtek közötti szelekció zajlik a rendészeti erőforrások előállításával szemben, a kapcsolódó rendészeti költségek miatt, amelyek lassítják a gazdaszervezet növekedését. A 7. ábra azt mutatja, hogy a rendészeti költségek növekedése megfelel a rendészeti erőforrások termelésének csökkenésének (), de nem a plazmidok engedelmességének összeomlása () a rendőrséghez. Ellenkezőleg, az engedelmesség nem csak tartós, hanem némileg növekszik is a növekvő rendészeti költségekkel. Ugyanakkor az alap plazmid replikációs sebessége () csökken, hogy kompenzálja a rendészeti erőforrások rendelkezésre állásának fokozatos csökkenését (). Ennek eredményeként a CNC rendszer mindvégig működőképes marad (mivel a sejtközi szinten még mindig van szelekció a magas engedelmesség érdekében ), de kevésbé hatékony a növekvő rendészeti költségek mellett, és a populáció teljesítménye romlik, ha a gazdaszervezetek alacsonyabb osztódási arányt mutatnak, és magasabb a plazmidok szegregációs vesztesége (lásd a 7. ábrát).

A plazmid paraméterek átlagos értékei (, , ), a gazdaszervezet osztódási aránya és a szegregációs veszteség, valamint a plazmiddal fertőzött gazdaszervezetek aránya a populációban (plazmid terjedése) a különböző rendészeti költségek miatt. Ez utóbbit itt termelési költségként fejezzük ki egységnyi inhibitorra a karbantartás állandó általános költségéhez viszonyítva plazmid kópiánként (például a génexpresszió, replikáció költsége stb.).

Az egyéni és a kollektív korlátozások összehasonlítása

A CNC pozitív hatásai nem korlátozódnak a gazdaszervezetekre, hanem kiterjednek a plazmidokra is. Többsejtű sztochasztikus CNC szimulációink (CNC) eredményeinek összehasonlításával értékeltük a CNC előnyeit gazdaszervezetek és plazmidok számára. kifejlődik) az alapmodell modelljeihez, ahol a rendszabályozás hiányzik, és a plazmidok más plazmidok jelenlététől függetlenül replikálódnak ugyanabban a gazdaszervezetben (NO-CNC). fejlődik, ). A gazdaszervezetek teljesítményét az átlagos osztódási és halálozási arányok alapján, míg a plazmidok teljesítményét a vertikális átvitel hűsége és a plazmidok gazdapopulációban való elterjedése alapján értékeltük. A 8. ábra szemlélteti, hogy minden intézkedés szignifikánsan javult, amikor a CNC működött (CNC szimulációk), összehasonlítva azzal az esettel, amikor a CNC mechanizmus hiányzott (NO-CNC szimulációk). Mint ilyen, a CNC mechanizmusnak a plazmid stabilitására gyakorolt ​​jótékony hatásai a sztochasztikus kópiaszám-ingadozások szigorúbb szabályozása miatt lehetővé teszik a gazdaszervezet széles körű fertőzését és a szegregációs veszteségek minimalizálását az intercelluláris szelekció által megengedett határokon belül, megszilárdítva ezzel a perzisztenciát. a plazmid vonal a populációban.

A gazdaszervezetek teljesítményét az osztódás (bal felső sarokban) és a halálozási arányok (jobb felső sarokban), míg a plazmidok teljesítményét a szegregációs veszteségek (bal alsó része) és a plazmiddal fertőzött gazdaszervezetek populációban való hányada alapján mérik ( jobb alsó). A szegregációs veszteség mértékét úgy számítjuk ki, hogy minden lépésben rögzítjük a plazmiddal fertőzött szülősejtből származó plazmidmentes leánysejt előfordulásait a plazmiddal fertőzött sejtek valamennyi osztódása között. Összehasonlításokat végeznek az alapmodell között, amelyben a rendészet hiányzik (NO-CNC kék színben fejlődik, ) és a modell, amelyben a rendfenntartás és az engedelmesség fejlődhet (CNC zöld színben fejlődik). Az eloszlásokat 50 független sztochasztikus többsejtű szimuláció utolsó 100 000 lépésének értékei alapján számítottuk ki, azonos kezdeti feltételekkel és mutációs valószínűséggel .

Végezetül azt is megvizsgáltuk, hogy a plazmidok között fennáll-e az önző egyedek inváziója ellen bevett rendészeti mechanizmus, vagyis olyan plazmid, amely érzéketlen a replikációgátlókra, és függetlenül attól, hogy más plazmidok ugyanabban a gazdaszervezetben jelen vannak. Pontosabban szimuláltuk a versenyt a NO-CNC ( csak vele ) és a CNC () típusok (a) a két típus egyformán keverésével a gazdaszervezeteken belül (gazdaszervezeten belüli heterogenitás) és (b) úgy, hogy a két típust külön-külön és egyenlően osztják el a populáció különböző gazdái között (gazdaszervezet heterogenitása). Minden általunk vizsgált esetben az önző típus gyors kiszorulását figyeltük meg a populációból. A CNC típus teljes elterjedtsége bizonyítja a kollektív korlátozás mechanizmusának robusztusságát és stabilitását az önző elemek inváziójával szemben, amelyek megkerülik a rendészeti mechanizmust annak érdekében, hogy viszonylagos előnyt szerezzenek a sejten belüli replikációs készletben.


Anyagok és metódusok

Reagensek és eszközök táblázat

Reagens/Forrás Referencia vagy Forrás Azonosító/ Katalógusszám
Média
Luria-Bertani (LB) BD Difco a Fisher Scientifictól DF0446 07 5
M9CA Amresco M9CA közepes húsleves por tétel sz. 2055C146
Plazmidok
Adományozók és kedvezményezettek
Törzs genotípus
RP4 donor (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
pR donor (Lopatkin et al, 2016 ) DA26735 Eco lacIZYA::FRT, galK::mTagBFP2-amp
p41 donor (Lopatkin et al, 2016 ) E. coli 41-es számú izolátum
p168 donor (Lopatkin et al, 2016 ) E. coli 168. számú izolátum
p193 donor (Lopatkin et al, 2016 ) E. coli 193. számú izolátum
p283 donor (Händel et al, 2015 ) ESBL 242
R6K donor (Lopatkin et al, 2016 ) E. coli C600
R6Kdrd donor Nagylelkű ajándék D. Mazeltől (Baharoglu et al, 2010 ) E. coli Dh5a
R1 donor Nagylelkű ajándék F. Dionisiotól és J. Alves Gamától (Gama et al, 2020 ) E. coli MG1655 Dara
R1drd donor Nagylelkű ajándék F. Dionisiotól és J. Alves Gamától (Gama et al, 2020 ) E. coli MG1655 Dara
pRK100 donor Nagylelkű ajándék T. Sysoeva-tól E. coli HB101
RIP113 donor Nagylelkű ajándék D. Mazeltől (Baharoglu et al, 2010 ) E. coli Dh5a
RB933 címzett Nagylelkű ajándék I. Gordótól (Leónidas Cardoso et al, 2020 ) E. coli lacIZYA::sebhely galK::macska-YFP ∆gatZ::FRT-aph-FRT rpoB H526Y
MG1655 (Lopatkin et al, 2016 ) E. coli MG1655 (K-12 F – λ – ilvGrfb-50 rph-1)
DA838F (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
DA838 (Lopatkin et al, 2016 ) DA32838 Eco galK::cat-J23101-dTomato
P (a p41, p193 és p168 címzettje) Ez a tanulmány, laboratóriumi állomány E. coli MG1655 (K-12 F – λ – ilvGrfb-50 rph-1)
KPN címzett (Gomez-Simmonds et al, 2015) Klebsiella pneumoniae izolátum KP0064, ST17
Szoftver
MATLAB v. R2020a https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
Eszközök
Tecan végtelen Mplex lemezolvasó Tecan N/A

Módszerek és protokollok

Törzsek, táptalajok és növekedési feltételek

A kísérleteket egyedi klónokkal indítottuk, amelyeket agarlemezekről szedtünk le, 2 ml Luria-Bertani (LB) táptalajba oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on pontosan 16 órán keresztül, miközben 250 fordulat/perc sebességgel rázattuk. Adott esetben az LB tápközeget specifikus antibiotikumokkal egészítettük ki. Például az RP4 beszerzési költségének mérésére D-t, R-t és adaptált T-t 50 µg/ml kanamicinnel (Kan), 50 µg/ml spektinomicinnel (Spec) vagy mindkettővel termesztettünk (Függelék S1A táblázat). Az összes többi donor és recipiens kombináció esetében a megfelelő antibiotikumok és koncentrációk a függelék S1B táblázatában találhatók. Minden kísérletet M9 tápközegben végeztünk (M9CA tápközeg húsleves por az Amresco-tól, 2055C146 tételszám, 2 mg/ml kazaminosavat tartalmaz, 2 mM MgSO-val kiegészítve40,1 mM CaCl2 és 0,4 tömeg/térfogat% glükóz.)

Adaptált RP4 transzkonjugánsok előállítása

Az adaptált T létrehozásához a D és R egyedi klónjait egy éjszakán át növesztettük az előző leírás szerint. 16 óra elteltével az összes tenyészetet 1:1 arányban újraszuszpendáltuk M9CA-ban. Egyenlő térfogatú (400 µl) D-t és R-t Eppendorf-csőben összekeverünk, és 1 órán át hűtött inkubátorban 25 °C-on inkubáljuk. A konjugációs periódus után a keverékeket Spec-Kan lemezekre csíkozták, és 16 órán át 37 °C-on növesztették, ami elég hosszú ahhoz, hogy lehetővé tegye a fiziológiai adaptációt (Erickson et al, 2017) genetikai mutációk nélkül (Harrison et al, 2016 Lopatkin et al, 2017), és összhangban van a fitneszköltség becsléséhez szükséges transzkonjugánsok létrehozására vonatkozó korábbi protokollokkal (Buckner et al, 2018 Dimitriu et al, 2019 ).

Az RP4 beszerzési költségének számszerűsítése

Generálni de novo T, D és R egyedi klónjait egy éjszakán át növesztettük, és a fent leírtak szerint konjugáltuk. Ezzel párhuzamosan adaptált T-kolóniákat neveltünk egy éjszakán át a standard görbe megállapításához. A D és R konjugációs periódusa alatt 800 µl adaptált T-t szintén Eppendorf-csőbe aliquot részekre osztunk, és 25 °C-os hűtőinkubátorba helyezzük. A ragozási időszakot követően de novo A T mennyiségét D és R keverékéből határoztuk meg kolóniaképző egységek (CFU) használatával, vagy a lemezleolvasóba történő hígítással. A CFU esetében a D és R keveréket 10-szeres hígítási lépésekben sorozathígítottuk. Az összes hígítási faktorból (10 0-10 7 ) 10 µl-t Spec-Kan agar lemezekre vittünk, majd 16 órán át 37 °C-on inkubáltuk és megszámoltuk. A lemezleolvasóhoz a D és R keveréket Spec-Kan-t tartalmazó M9CA táptalajba hígítottuk, és 200 µl-t osztunk ki egy 96 lyukú lemez lyukaiba, technikai három ismétlésben. A kísérleti kísérletek szerint de novo A T-t 1000-szeresre hígítottuk, hogy körülbelül 2000 sejtet kapjunk lyukanként, ami elég alacsonynak bizonyult ahhoz, hogy megakadályozza a háttérnövekedést vagy a konjugációt.

Az adaptált T CFU-ját szintén ebben az időben számszerűsítettük a fent leírt protokoll szerint. A standard görbét az adaptált T hét hígítási tényezőjének felhasználásával állítottuk elő (2B. ábra). Az adaptált T-sejteket M9CA tápközegben Spec-Kan-nal hígítottuk, majd mindegyik hígítási faktorból 200 µl-es alikvotokat szélesztettünk ugyanarra a 96 lyukú lemezre, szintén technikai három példányban. Ezután minden lyukat befedtünk 50 µl ásványolajjal, hogy megakadályozzuk a párolgást, és azonnal egy Tecan lemezleolvasóba helyezzük. Minden esetben 600 nm-en 15 percenként vettük az abszorbancia mérést legalább 24 órán keresztül, amíg az összes sejt el nem érte az állófázist. Minden RP4 adatot legalább biológiai három párhuzamosban végeztünk.

A beszerzési költségek általánossága más plazmidokkal

A fent leírt konjugációs protokollt alkalmaztuk minden további plazmidhoz, kevés módosítással. Először is, a transzkonjugánsok kiválasztásához használt antibiotikumok minden esetben a plazmid által kódolt rezisztenciagénektől és a kompatibilis recipiens törzstől függtek (Függelék S1B táblázat). Ezenkívül az RP4 és a pR standard görbékhez használt hét hígítási tényező közül azt találtuk, hogy a 10 2 X, 10 4 X és 10 6 X hígítási faktorok részhalmaza elegendő mindkét plazmid beszerzési költségeinek pontos számszerűsítéséhez (ahogyan meghatározták). minden hígítással). Így ezt a három hígítási tényezőt használtuk a standard görbék létrehozására a kísérletek hátralévő részében. A maximális sejtsűrűség (az OD600) és a növekedési sebesség a törzstől és a plazmidtól függően különbözött a konjugáció hatékonysága alapján. A lemezleolvasó hígítási tényezőjét minden esetben kísérleti kísérletek alapján határoztuk meg, hogy meghatározzuk a legmagasabb kezdeti sűrűséget a lyukakban, megfigyelhető háttérkonjugáció nélkül. Azokban az esetekben, amikor a háttérkonjugációt nem lehetett teljesen kiküszöbölni, a növekedést levontuk úgy, hogy az exponenciális fázis megmaradjon. Az exponenciális fázison belül maradás érdekében a sejtsűrűség küszöbértékét az egyes kísérletekben elért maximális sűrűség 50%-ára állítottuk be, és úgy tűnt, hogy ez az érték a legkövetkezetesebben választja ki a 2A ábrán jelzett régiót, ahogy az Eredményekben is szerepel. Az exponenciális növekedési fázison belüli küszöb módosítása minőségileg nem befolyásolja következtetéseinket. Végül megjegyezzük, hogy a beszerzési költségek nagymértékben reprodukálhatóak voltak a biológiai ismétlések között (lásd a függelék S10A ábráját), és a variabilitás nagyobb volt az egyes kutak között egy adott napon, nem pedig a napon belüli átlagértékek között, valószínűleg az alacsony sejtszám miatt. lyukanként egyszer 96 lyukú lemezekre hígítva. Ahol a biológiai párhuzamos eredmények reprodukálhatók voltak, és nem vezettek eltérő statisztikai következtetésekhez, ehelyett a reprezentatív ismétlésen belüli technikai változatosságra összpontosítottunk. Ezért az adott esetben a legváltozatosabb adatok felhasználásával maximalizáljuk a kapcsolódó statisztikai következtetések szigorúságát. A statisztikák előállításához használt ismétléstípusok minden esetben a függelék S3A táblázatában láthatók (3H. ábra). Megjegyezzük, hogy a statisztikák előállításához használt ismétlésektől függetlenül a konkrét beszerzési költségek azonosak maradnak. Továbbá a beszerzési és a fitnesz költség közötti kapcsolat nem változott attól függően, hogy biológiai replikátum átlagokat használtak-e helyette (Függelék S10B ábra).

A növekedési ütem kiszámítása

ahol y2 > y1, ahol y2 és y1 az OD600 időnként t+2 és t-2, ill. A Prensky-késleltetési időt a maximális növekedési sebességen átmenő érintővonal x-metszete alapján határoztuk meg, összhangban a 2A. ábrán látható geometriai késleltetési idővel.

Versenykísérletek

Minden versenykísérletet egy korábbi publikációban végeztek, és az adatokat a Nature Communications (Lopatkin) engedélyével reprodukálták. et al, 2017), amely a Creative Commons Nevezd meg! Röviden, a plazmidmentes és plazmidot hordozó populációkat 1:1 arányban összekevertük, és egymást követő generációkon keresztül 14-21 napig növesztettük. 24 óránként a populációkat 10 000-szeresére hígítottuk, és a CFU-t rendszeres időközönként ellenőriztük kettős szelektív agaron.

Modellszámítások

Szimulációkat futtattunk a megfigyelt növekedési ráta (μ) kiszámításáraobs, és a maximális fajlagos növekedési sebesség, μ, α és β értékek tartományára (4A. ábra). μobs a függelék S6 egyenletében leírtak szerint lett kiszámítva. μobs úgy határoztuk meg, hogy számszerűen eltér μ-től bármely megfigyelt növekedési ráta alapján, amely a maximális érték 98%-a alá esett (pl. ha μobs < 0,98*μ). Az adatillesztéshez minden esetben a MATLAB fminsearch függvényével számítottuk ki. Az fminsearch egy optimalizáló függvény, amely minimalizálja a felhasználó által megadott célfüggvényeket, és megköveteli az illesztéshez szükséges paraméter(ek) kezdeti becslését. Esetünkben ezt az illesztést úgy valósítottuk meg, hogy minimálisra csökkentettük az S D + S A ODE megoldása és a nyers adatgörbék közötti különbséget, amint az a függelék S7 ábráján látható, mivel a ρ-t az adaptált és a növekedési ráták arányának kísérleti becslésével korlátoztuk. de novo populációkban a β volt az egyetlen szabad paraméter, amelyet illesztettek. Így minden plazmid esetében a kezdeti β becslést a megfelelő növekedési görbe geometriai késleltetési idejére állítottuk be, és az fminsearch optimalizálás kimenete egy olyan becsült β volt, amely a legjobban illeszkedik kísérleti adatainkhoz.


Hivatkozások

Slater FR, Bailey MJ, Tett AJ, Turner SL: Haladás a plazmidok bakteriális közösségekben való sorsának megértésében. Fems Mikrobiológia Ökológia. 2008, 66 (1): 3-13. 10.1111/j.1574-6941.2008.00505.x.

Frost LS, Leplae R, Summers AO, Toussaint A: Mobil genetikai elemek: a nyílt forráskódú evolúció ágensei. Természetértékelések Mikrobiológia. 2005, 3(9): 722-732. 10.1038/nrmicro1235.

Eberhard WG: Evolúció a bakteriális plazmidokban és a szelekció szintjei. A biológia negyedéves áttekintése. 65 (1): 3-22 (1990). 10.1086/416582.

Medini D, Donati C, Tettelin H, Masignani V, Rappuoli R: A mikrobiális pángenom. A genetika és a fejlődés jelenlegi véleménye. 2005, 15 (6): 589-594.

Tsuda M, Tan HM, Nishi A, Furukawa K: Mobil katabolikus gének baktériumokban. Journal of Bioscience and Bioengineering. 1999, 87(4): 401-410. 10.1016/S1389-1723(99)80086-3.

Khomenkov VG, Shevelev AB, Zhukov VG, Zagustina NA, Bezborodov AM, Popov VO: Organisation of metabolic pathways and molecular-genetic mechanizmuss of xenobiotic degradation in mikroorganizms: A Review. Alkalmazott biokémia és mikrobiológia. 2008, 44 (2): 117-135.

Dutta C, Pan A: Horizontális génátvitel és bakteriális sokféleség. Journal of Biosciences. 2002, 27 (1): 27-33. 10.1007/BF02703681.

Osborn AM, Boltner D: Amikor fág, plazmidok és transzpozonok ütköznek: genomi szigetek, valamint konjugatív és mobilizálható transzpozonok mozaikkontinuumként. Plazmid. 2002, 48 (3): 202-212. 10.1016/S0147-619X(02)00117-8.

Davison J: A környezetben lévő baktériumok közötti genetikai csere. Plazmid. 1999, 42(2): 73-91. 10.1006/plas.1999.1421.

Bergstrom CT, Lipsitch M, Levin BR: Természetes szelekció, fertőző transzfer és bakteriális plazmidok létezési feltételei. Genetika. 2000, 155: 1505-1519.

Zaneveld JR, Nemergut DR, Knight R: Minden horizontális génátvitel egyenlő? A HGT-minták mechanizmus-alapú vizsgálatának kilátásai. Mikrobiológia-Sgm. 2008, 154: 1-15. 10.1099/mic.0.2007/011833-0.

Fernández-López R, Garcillán-Barcia MP, Revilla C, Lázaro M, Vielva L, dlC F: Az IncW genetikai gerincének dinamikája általános tendenciákat jelent a konjugatív plazmidok evolúciójában. FEMS Microbiology Reviews. 2006, 30 (6): 942-966. 10.1111/j.1574-6976.2006.00042.x.

Cevallos MA, Cervantes-Rivera R, Gutierrez-Rios RM: A repABC plazmidcsalád. Plazmid. 2008, 60 (1): 19-37. 10.1016/j.plasmid.2008.03.001.

Bentley SD, Parkhill J: Prokarióták összehasonlító genomi szerkezete. Genetika éves áttekintése. 38, 771-792 (2004)]. 10.1146/annurev.genet.38.072902.094318.

Brilli M, Mengoni A, Fondi M, Bazzicalupo M, Liò P, Fani R: Plazmid gének elemzése filogenetikai profilozással és homológia kapcsolatok megjelenítésével Blast2Network segítségével. BMC Bioinformatika. 2008

Peleg AY, Seifert H, Paterson DL: Acinetobacter baumannii: sikeres kórokozó megjelenése. Klinikai mikrobiológiai áttekintések. 2008, 21 (3): 538-582. 10.1128/CMR.00058-07.

Juni E: Interspecies Transformation of Acinetobacter: Genetikai bizonyítékok egy mindenütt jelenlévő nemzetséghez. J Bacteriol. 112 (2): 917-931 (1972)].

Chen TL, Siu LK, Lee YT, Chen CP, Huang LY, Wu RCC, Cho WL, Fung CP: Az Acinetobacter baylyi mint opportunista fertőzés kórokozója. Journal of Clinical Microbiology. 2008, 46 (9): 2938-2944. 10.1128/JCM.00232-08.

Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H: Növekvő veszély a kórházakban: multirezisztens Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 2007, 5 (12): 939-951. 10.1038/nrmicro1789.

Davis KA, Moran KA, McAllister CK, Gray PJ: Multidrug-rezisztens Acinetobacter katonák végtagfertőzései. Emerg Infect Dis. 2005, 11 (8): 1218-1224.

Nemec A, Musilek M, Maixnerova M, De Baere T, Reijden van der TJ, Vaneechoutte M, Dijkshoorn L: Acinetobacter beijerinckii sp. november. és Acinetobacter gyllenbergii sp. nov., az emberből izolált hemolitikus szervezetek. Int J Syst Evol Microbiol. 2009, 59 (1. pont): 118-124. 10.1099/ijs.0.001230-0.

Dijkshoorn L, Nemec A: Az Acinetobacter nemzetség sokfélesége. Acinetobacter molekuláris mikrobiológia. Szerkesztette: U. Gerischer . 2008, Caister Academic Press, 1-34.

Iacono M, Villa L, Fortini D, Bordoni R, Imperi F, Bonnal RJP, Sicheritz-Ponten T, De Bellis G, Visca P, Cassone A stb. Acinetobacter baumannii törzs, amely az európai klón II. csoportjába tartozik. Antimikrobiális szerek és kemoterápia. 2008, 52 (7): 2616-2625. 10.1128/AAC.01643-07.

Reams AB, Neidle EL: Genomplaszticitás in Acinetobacter: nagy kromoszómaszegmensek spontán amplifikációjával szerzett új degradációs képességek. Molekuláris mikrobiológia. 2003, 47(5): 1291-1304. 10.1046/j.1365-2958.2003.03342.x.

Mugnier P, Poirel L, Pitout M, Nordmann P: Carbapenem-rezisztens és OXA-23-termelő Acinetobacter baumannii izolátumok az Egyesült Arab Emírségekben. Klinikai mikrobiológia és fertőzés. 2008, 14 (9): 879-882. 10.1111/j.1469-0691.2008.02056.x.

Marti S, Sanchez-Cespedes J, Blasco MD, Ruiz M, Espinal P, Alba V, Fernandez-Cuenca F, Pascual A, Vila J: Characterization of the carbapenem-hydrolysing oxacillinase Oxa-58 in an an Acinetobacter genospecies 3 klinikai izolátum. Antimikrobiális szerek és kemoterápia. 2008, 52 (8): 2955-2958. 10.1128/AAC.00072-08.

Hawkey PM, Munday CJ: Gram-negatív baktériumok többszörös rezisztenciája. Vélemények az orvosi mikrobiológiáról. 2004, 15 (2): 51-61.

Bach H, Gutnick DL: Új poliszacharid-fehérje alapú amfipatikus készítmények. Alkalmazott mikrobiológia és biotechnológia. 2006, 71 (1): 34-38. 10.1007/s00253-005-0149-9.

Morales-Jimenez J, Zuniga G, Villa-Tanaca L, Hernandez-Rodriguez C: Bakteriális közösség és nitrogénkötés a vörös terpentinbogárban, Dendroctonus valens LeConte (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Microb Ecol. 2009

de Vries J, Wackernagel W: Idegen DNS integrációja a természetes átalakulás során Acinetobacter sp homológiával elősegített illegitim rekombinációval. Proceedings of the National Academy of Sciences of Amerikai Egyesült Államok. 2002, 99 (4): 2094-2099. 10.1073/pnas.042263399.

Young DM, Parke D, Ornston LN: A genetikai vizsgálat által biztosított lehetőségek Acinetobacter baylyi, táplálkozási szempontból sokoldalú baktériumfaj, amely rendkívül kompetens a természetes átalakulásban. Annu Rev Microbiol. 2005, 59: 519-551.10.1146/annurev.micro.59.051905.105823.

Decorosi F, Mengoni A, Baldi F, Fani R: Alkán-monoxigenáz gének azonosítása Acinetobacter venetianus VE-C3 és a dízel üzemanyag lebomlásában károsodott mutánsok elemzése. Annals of Microbiology. 2006, 56 (3): 207-214. 10.1007/BF03175007.

Barberio C, Fani R: Biodiversity of an Acinetobacter eleveniszapból izolált populáció. Mikrobiológiai kutatás. 149 (9): 665-673 (1998)]. 10.1016/S0923-2508(99)80014-X.

Mengoni A, Ricci S, Brilli M, Baldi F, Fani R: A pAV1 és pAV2 plazmidok szekvenálása és elemzése Acinetobacter venetianus A VE-C3 részt vesz a dízel üzemanyag leromlásában. Annals of Microbiology. 2007, 57 (4): 521-526. 10.1007/BF03175349.

Osborn AM, Bruce KD, Strike P, Ritchie DA: A bakteriális higanyrezisztencia (mer) operon eloszlása, sokfélesége és evolúciója. FEMS Microbiol Rev. 19 (4), 239-262 (1997). 10.1111/j.1574-6976.1997.tb00300.x.

Kholodii G, Mindlin S, Gorlenko Z, Petrova M, Hobman J, Nikiforov V: Transzpozícióhiányos (Tn(d)PKLH2-like) transzpozonok transzlokációja a természetes környezetben: mechanisztikus betekintések szomszédos DNS-szekvenciák tanulmányozásából. Mikrobiológia-Sgm. 2003, 150: 979-992. 10,1099/mic.0,26844-0.

Tian W, Skolnick J: Mennyire konzervált az enzimfunkció a páronkénti szekvenciaazonosság függvényében? J Mol Biol. 2003, 333 (4): 863-882. 10.1016/j.jmb.2003.08.057.

Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA: A svájci 3T6 egér fibroblasztokban két különböző ATP receptort lehet megkülönböztetni deszenzitizációjuk alapján. Biochem Biophys Res Commun. 164 (2): 706-713 (1989)]. 10.1016/0006-291X(89)91517-9.

Walther-Rasmussen J, Hoiby N: OXA-típusú karbapenemázok. J Antimikrobiális kemoterápia. 2006, 57 (3): 373-383. 10.1093/jac/dki482.

Soisson SM, MacDougall-Shackleton B, Schleif R, Wolberger C: Strukturális alapok az AraC ligand által szabályozott oligomerizációjához. Tudomány. 1997, 276 (5311): 421-425. 10.1126/tudomány.276.5311.421.

Heuer H, Szczepanowski R, Schneiker S, Puhler A, Top EM, Schluter A: A pB2 és pB3 plazmidok teljes szekvenciája bizonyítékul szolgál az IncP-1béta csoport közelmúltbeli ősére, járulékos gének nélkül. Mikrobiológia. 2004, 150 (Pt 11): 3591-3599. 10,1099/mic.0,27304-0.

Rawlings DE: Az IncQ-család két rokon plazmidja, a pTF-FC2 és pTC-F14 evolúciója. Plazmid. 2005, 53 (2): 137-147. 10.1016/j.plasmid.2005.01.001.

Jerke K, Nakatsu CH, Beasley F, Konopka A: Nyolc összehasonlító elemzése Arthrobacter plazmidok. Plazmid. 2008, 59 (2): 73-85. 10.1016/j.plasmid.2007.12.003.

Mann BA, Slauch JM: Alacsony kópiaszámú plazmidok transzdukciója P22 bakteriofággal. Genetika. 146(2): 447-456 (1997).

Vaneechoutte M, Young DM, Ornston LN, De Baere T, Nemec A, Reijden Van Der T, Carr E, Tjernberg I, Dijkshoorn L: természetesen átalakítható Acinetobacter sp ADP1 törzs az újonnan leírt fajokhoz tartozik Acinetobacter baylyi. Alkalmazott és környezeti mikrobiológia. 2006, 72 (1): 932-936. 10.1128/AEM.72.1.932-936.2006.

Watson SK, Carter PE: Környezeti hatások a Acinetobacter sp törzs BD413 transzformációja a talajban. A talajok biológiája és termékenysége. 2008, 45 (1): 83-92. 10.1007/s00374-008-0314-2.

Pontiroli A, Rizzi A, Simonet P, Daffonchio D, Vogel TM, Monier JM: Vizuális bizonyíték a növények és baktériumok közötti horizontális géntranszferről a transzplasztikus dohány fitoszférájában. Alkalmazott és környezeti mikrobiológia. 2009, 75 (10): 3314-3322. 10.1128/AEM.02632-08.

Johnsborg O, Eldholm V, Havarstein LS: Természetes genetikai átalakulás: prevalencia, mechanizmusok és funkció. Mikrobiológiai kutatás. 2007, 158 (10): 767-778. 10.1016/j.resmic.2007.09.004.

Barbe V, Vallenet D, Fonknechten N, Kreimeyer A, Oztas S, Labarre L, Cruveiller S, Robert C, Duprat S, Wincker P és munkatársai: A Acinetobacter sp ADP1, egy sokoldalú és természetesen átalakuló kompetens baktérium. Nukleinsav kutatás. 2004, 32 (19): 5766-5779. 10.1093/nar/gkh910.

Iwaki M, Arakawa Y: Transformation of Acinetobacter sp BD413 a kereskedelemben kapható, genetikailag módosított burgonyából és papajából származó DNS-sel. Levelek az alkalmazott mikrobiológiából. 2006, 43 (2): 215-221. 10.1111/j.1472-765X.2006.01924.x.

Vallenet D, Nordmann P, Barbe V, Poirel L, Mangenot S, Bataille E, Dossat C, Gas S, Kreimeyer A, Lenoble P, et al: Comparative analysis of Acinetobacterek: három genom három életmódhoz. PLoS ONE. 2008, 3 (3): e1805-10.1371/journal.pone.0001805.

Fournier PE, Vallenet D, Barbe V, Audic S, Ogata H, Poirel L, Richet H, Robert C, Mangenot S, Abergel C, et al: Comparative genomics of multidrug rezisztencia in Acinetobacter baumannii. PLoS Genet. 2006, 2 (1): e7-10.1371/journal.pgen.0020007.

Smith MG, Gianoulis TA, Pukatzki S, Mekalanos JJ, Ornston LN, Gerstein M, Snyder M: Új betekintés Acinetobacter baumannii patogenezisét nagy sűrűségű piroszekvencia és transzpozon mutagenezis tárja fel. Genes Dev. 2007, 21 (5): 601-614. 10.1101/gad.1510307.

Barbe V, Vallenet D, Fonknechten N, Kreimeyer A, Oztas S, Labarre L, Cruveiller S, Robert C, Duprat S, Wincker P és munkatársai: A Acinetobacter sp. Az ADP1, egy sokoldalú és természetesen átalakuló kompetens baktérium. Nucleic Acids Res. 2004, 32 (19): 5766-5779. 10.1093/nar/gkh910.

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ: Gapped BLAST és PSI-BLAST: a fehérjeadatbázis-kereső programok új generációja. Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 (1997). 10.1093/nar/25.17.3389.

Dorsey CW, Tomaras AP, Actis LA: A pMAC szekvenciája és szervezete, an Acinetobacter baumannii a szerves peroxid rezisztenciában szerepet játszó géneket tartalmazó plazmid. Plazmid. 2006, 56 (2): 112-123. 10.1016/j.plasmid.2006.01.004.

Zarrilli R, Vitale D, Di Popolo A, Bagattini M, Daoud Z, Khan AU, Afif C, Triassi M: A plazmid által hordozott blaOXA-58 gén imipenem rezisztenciát biztosít Acinetobacter baumannii egy libanoni kórházból izolálják. Antimikrobiális szerek kemoterápia. 2008, 52 (11): 4115-4120. 10.1128/AAC.00366-08.


A genetikai információ hordozói, replikátorai és intercelluláris mozgása: a baktériumsejt evolúciós szétválasztása

A prokarióta bioszféra sok tekintetben rendkívül változatos. Bármely adott baktériumsejt különböző kombinációkban hordozhat vírusokat, plazmidokat, transzpozonokat és más genetikai elemeket a kromoszómájukkal együtt. Ezek az ágensek összetett környezetben különféle módokon lépnek kölcsönhatásba, és számos fenotípusos hatást okoznak a gazdasejteken. Ebben a megbeszélésben egy baktériumsejt boncolását végzem, hogy egyszerűsítsem a diverzitást olyan komponensekre, amelyek segíthetnek megközelíteni a részletek óceánját a fejlődő mikrobiális világokban. Maga a sejt el van választva az összes genetikai replikátortól, amely a sejthordozót használja a megőrzésre és a szaporításra. Bevezetek egy osztályozást, amely a különböző replikátorokat a sejtek közötti horizontális mozgási potenciáljuk és a jelenlegi gazdasejtek alkalmasságára gyakorolt ​​hatásuk szerint csoportosítja. Az osztályozást arra használják, hogy megvitassák és javítsák azokat az eszközöket, amelyekkel megközelíthetjük a mikrobiális közösségek általános evolúciós tendenciáit. Ezen túlmenően az osztályozást eszközként használják az evolúciós hipotézisek megfogalmazásában és a feltörekvő bakteriális kórokozók megvitatására, valamint általában a különböző replikátorok átlagos fenotípusainak megértésére. Azt is megvitatják, hogy bármely adott bioszféra, amely prokarióta sejthordozókat és genetikai replikátorokat tartalmaz, természetesen fejlődhet különböző típusú vízszintesen mozgó replikátorokká.

1. Bemutatkozás

Ismeretes, hogy a prokarióta sejteket megfertőző vírusok genetikai információik tekintetében rendkívül változatosak [1, 2]. A legtöbb új vírusizolátum valószínűleg legalább néhány olyan gént tartalmaz, amelyeknek nincs homológja a korábban ismert gének között, beleértve a rokon vírusok genomjában lévőket is [3]. Mégis vita folyik arról, hogy valóban megjelenhetnek-e új gének a vírusokban [3]. A vírusok a sejtes erőforrásoktól, így a nukleotidoktól, aminosavaktól és lipidektől függenek ahhoz, hogy több vírust termeljenek, ezért indokoltnak tűnik feltenni a kérdést, hogy genetikai információikhoz felhasználnak-e sejtgéneket is. Mégis, amikor a vírusgéneket összehasonlítjuk más génekkel az adatbázisokban, gyakran úgy tűnik, hogy nincs sejtes megfelelőjük [2]. Akkor honnan származnak ezek a vírusgének? Olyan sejtes gazdaszervezettől szerezték be, amelyet egyszerűen nem szekvenáltunk korábban? Vagy esetleg a sejtgének csak gyorsan fejlődnek a vírusgenomokban, így a gazdagénekkel való közös őseik már nem származtathatók? Vagy talán valóban lehetséges, hogy új gének magukban a vírusokban jelennek meg?

Forterre és Prangishvili, a Pasteur Intézet munkatársa azzal érvelt, hogy a vita lényege abban a felfogásban rejlik, hogy a vírusokat gyakran csak a fehérjébe zárt extracelluláris formáiknak tekintik [4], amelyek csak sejterőforrásokat (beleértve a géneket is) saját céljaikra lopják el. [3, 5, 6]. Vegyünk egy tetszőleges vírusokról szóló tankönyvet, és a vírusokat ábrázoló képek többsége a vírusgenomot körülvevő fehérjékből (és néha lipidekből) álló különböző típusú vírushéjakról készült. De ezek a fertőző vírusrészecskék vagy virionok minden tekintetben inertek, hacsak nem találkoznak fogékony gazdasejttel [7]. És a virionok ilyen tehetetlensége miatt nehéz megérteni, hogyan tud egy vírus valaha is teljesen új génekkel előállni.

A válasz természetesen az, hogy a vírusok nem tudnak új géneket termelni extracelluláris állapotuk során, és így az új vírusgén megjelenésének esetleges eseményei a sejten belül a vírus replikációs ciklusa alatt is előfordulhatnak [5]. De ha a gén megjelenik egy vírus genomjában, akkor inkább a vírus, és nem a sejt, amely a gén származéka volt? Vagy másképpen fogalmazva, nem a vírus profitált az új genetikai információk megjelenéséből? A tényleges folyamat, amely a genetikai információnak egy gén státuszának megszerzését okozza, továbbra is hasonló folyamatoknak köszönhető, mint a gének kromoszómákon belüli eredete (ezek különböző típusú genetikai változások, mint például pontmutációk, inszerciók, deléciók, génduplikációk, stb.), de ezeket a változtatásokat a vírus alkalmasságának javítása miatt választják ki. Ez az érvelés késztette Forterre-t arra, hogy olyan modellt javasoljon, amelyben a vírusokat alapvetően sejten belüli életformának tekintik, amelynek extracelluláris állapota is lehet [7, 8]. A vírus nem teljesen egyenértékű a fehérje által zárt vírusgenomtal. Inkább a vírus extracelluláris formáját virionnak kell jelölni, és ezt a viriont nem szabad összetéveszteni egy vírussal. A vírusok teljes értelemben olyan organizmusok, amelyek a sejtekben élnek (azaz riboszómát kódoló szervezetek), és több viriont termelve képesek más sejteket vírussejt organizmusokká átalakítani. Más szavakkal, a vírusok egy extracelluláris kapszulázott formát használhatnak genetikai információik egyik sejtről a másikra való átvitelére. Forterre talált ki egy kifejezést virocell, amely a vírus életének azon szakaszára utal, amelyben a vírus a sejten belül van [7]. A virocell szervezet valóban egy (kapszidot kódoló) vírus és egy (riboszómát kódoló) kromoszóma is, és a virocell tényleges fenotípusát mindkét genetikai entitás kódolja. A virosejtek teljesen képesek új genetikai információval előállni, akárcsak a sejtek, és így a vírusokat ebből a perspektívából közelítve tisztázni kell az új genetikai információk vírusokban való megjelenésével kapcsolatos vitákat.

Forterre gondolatmenete, valamint saját tanulmányaimmal különböző genetikai elemekről (beleértve a mérsékelt és virulens vírusok jellemzését [9, 10] a plazmidok, vírusok és kromoszómális elemek közös ősének meghatározása [11] evolúciós kísérletek végzése baktériumokkal, vírusokkal, és plazmidok [12, 13], valamint a genetikai információ horizontális mozgásával kapcsolatos elméletibb munka [14, 15]) szolgált inspirációként ennek a cikknek a elkészítéséhez. Valójában általánosabban lehetne vitatkozni, hogy mit jelent az, hogy a prokarióta sejtek különféle típusú genetikailag szaporodó elemek kimérái lehetnek (és gyakran azok is). A Virocell koncepció hatékonyan tisztázza a vírusok és virionok, valamint a sejtekkel való kapcsolatuk közötti zavarokat. Mindazonáltal a virocell csak egy különleges eset a lehetséges prokarióta organizmusok közül. A bakteriális és archaeális sejtek konjugatív plazmidokat, különféle típusú transzpozonokat, hibás profágokat és sok más független replikátort is tartalmazhatnak, amelyek különböznek a prokarióta kromoszómát kódoló riboszómától. Ezek a replikátorok együtt minden lehetséges kombinációban képesek organizmusokat létrehozni. Annak érdekében, hogy a virosejtekkel kapcsolatos érvek összhangban legyenek a genetikai replikátorok többi potenciális kimérájával, magát a sejtet külön entitásnak kell tekinteni az összes genetikai replikátortól (beleértve a kromoszómákat is), amelyek a sejtszerkezetet replikációhoz használják ki. A következő fejezetekben egy baktériumsejt evolúciós boncolását fogom végezni. Ez a sejthordozók és a replikátorok egymástól való elválasztásához vezet, és így egy lehetséges módot kínál a bakteriális szervezetek evolúciójának megközelítésére.

2. Járművek és replikátorok

A jármű bármely olyan egység, amely elég diszkrét ahhoz, hogy érdemesnek tűnjön elnevezésére, amely replikátorok gyűjteményének ad otthont, és amely egységként működik a replikátorok megőrzésére és terjesztésére.” – írta Richard Dawkins Kiterjesztett fenotípus. Dawkins a replikátorok és hordozók fogalmát használta fel egy érvelésben, amely szerint az evolúció végső soron a genetikai információ szintjén működik, nem pedig az organizmusok, fajok vagy akár sejtek populációinak szintjén. A replikátorok olyan genetikai információcsomagokat jelentenek, amelyek felelősek a jármű bármely hatékony fenotípusáért. Maga a hordozó lehet sejt, többsejtű szervezet, vagy például egy parazita gazdaszervezete. "A jármű nem replikátor” – érvelt Dawkins, megpróbálva hangsúlyozni, hogy a replikátor (mint a parazita kromoszómája) és nem a hordozó (mint például a parazita sejt) fejlődik ki. Ez a különbség azonban néha triviálisnak tűnhet, ezért okozott némi disszonanciát az evolúciós biológusok között.

Ennek ellenére Dawkins munkája leginkább az eukarióta szervezetek evolúciós kérdéseinek magyarázatára összpontosított, de a replikátor-központú evolúció természetesen a prokarióta sejteken belül és között is működik. Valójában a genetikai replikátorok különféle formáinak hatalmas sokfélesége létezik, amelyek prokarióta sejthordozókat használnak megőrzésükre és szaporításukra. Bármely olyan prokarióta, amely ebben a bioszférában él, legyen az egy baktérium a homlokodon vagy egy archeon a Csendes-óceán fenekén, kromoszómát hordoz, de más replikátorok gyűjteményét is befogadhatja, beleértve a plazmidokat, transzpozonokat és vírusokat. A replikátorok egy része, mint például a konjugatív plazmidok és vírusok, képesek aktívan mozogni a környezetében elérhető hordozók között, így ezek a replikátorok kevésbé függenek a sejthordozók egy adott vonalának túlélésétől. Ezért nem részei egyetlen baktériumnak sem, ezért a genetikailag replikáló entitások különálló formáinak tekinthetők, amelyek sejteket használnak fel szaporodásukhoz és túlélésükhöz (hasonlóan a Forterre-féle virocell koncepcióban szereplő vírusokhoz).

A prokarióta hordozók között és a létért folyó folyamatos küzdelem megváltoztatja a replikátorok fenotípusait. Számos elméleti és kísérleti munka történt a vírusok, bakteriális sejtek és plazmidok funkcióinak és evolúciós pályáinak tisztázása érdekében különböző ökológiai kontextusokban és különböző szelekciós nyomásokon. Ebben a vitában azonban egy lépést teszek a replikátorok vagy organizmusok bármely konkrét típusától, és általános perspektívából megvizsgálom, hogy a replikátorok oldalirányú mozgási potenciálja (vagy annak hiánya) segíthet-e megvilágítani a prokarióta bioszféra néhány evolúciós vonatkozását. . Ez a vita megkísérli, hogy intuitív képet adjon az önző génekről és a különböző típusú replikátorokról a bakteriális és régészeti sejtekben. Célom, hogy a szöveg egyszerű és olvasható legyen, függetlenül az olvasó baktériumokkal, vírusokkal, plazmidokkal, vagy ami azt illeti, az evolúciós elmélettel kapcsolatos szakértelmétől. Sőt, tekintettel a mikrobiális világ rengeteg részletére, remélem, hogy az olvasók ráébrednek arra, hogy bizonyos sarkokat különböző helyeken le kellett vágni, hogy a szöveg reális hosszon belül maradjon.

Ezen túlmenően az egyszerűség megőrzése érdekében a következő nómenklatúrát és meghatározásokat használjuk ebben a cikkben. A sejt jármű Prokarióta sejtet jelöl membránokkal, erőforrásokkal és minden mással, de kizár minden genetikai anyagot. Sejt-jármű származás egyetlen járművet és annak közvetlen leszármazottját jelöli, amelyek sejtosztódással jönnek létre. A replikátor a genetikai anyag bármely eléggé diszkrét gyűjteménye (amit érdemesnek tűnik elnevezni), amely a sejthordozót használja annak megőrzésére és szaporítására. A replikátorok különálló egységekként replikálódnak, amelyek a genetikai anyag koherens gyűjteményét alkotják, amely ésszerű erőfeszítéssel elválasztható más replikátoroktól. A replikátorok más replikátorok replikációjának részeként is replikálódhatnak, mivel az integratív vírusok a gazda-kromoszóma szaporodásával együtt replikálódnak, de lényegében ez a két replikátor két különálló entitásként jelölhető, mivel az integratív vírus külön-külön is képes replikálni genetikai információit. a kromoszóma replikációjából. A replikátor genetikai információinak replikációjának átlaga nem releváns. Mindazonáltal inkább nem definiálok túl szigorúan a replikátort, mivel az valószínűleg terméketlen szőrszálhasogató érvekhez vezet.Mégis meg kell jegyezni, hogy a replikátorok nem tartalmaznak riboszómákat vagy más olyan nukleinsavakat tartalmazó molekulákat, amelyeknek alapvetően enzimatikus funkciójuk van, de amelyeket nem használnak templátként saját replikációjukhoz.. Vertikális kapcsolat vagy a replikátor függőleges öröklődése azt jelzi, hogy ez a genetikai replikátor megőrzi magát a sejthordozók osztódó vonalán belül. Vízszintes mozgási lehetőség azt jelenti, hogy a replikátor képes bevezetni magát egy olyan sejt-hordozó vonalba, ahol a replikátor korábban hiányzott. A replikátor által kódolt vagy indukált jellemzőket a-val jelöljük fenotípus. Az 1. ábra összekapcsolja ezeket a kifejezéseket biológiai megfelelőikkel.


D. FÜGGELÉK

Kiszámoljuk Tp, a plazmid várható fennmaradási ideje egy populációban szelektív sweepekkel. Ezt úgy tesszük, hogy sorra kiszámoljuk a 11. egyenlet elemeit a szövegben, amely meghatározza Tp. A legtöbb erőfeszítés (a D13 egyenletig) a számításban van PR majd kifejezéseket adunk arra Ta és Tf.

Először is számolunk PR, annak a valószínűsége, hogy egy kromoszómális variáns megjelenését követően a plazmidot egy szelektív sweep megmenti, mielőtt kihalna. Kezdetben tegyük fel, hogy a kromoszómaváltozat időben keletkezik t = 0.

Akkor jegyezd meg PR P R = ∫ 0 ∞ P M ( t ) P X ( t ) d t , (D1) ahol PM(t) annak a valószínűsége, hogy az első mutáns megjelenik az intervallum alatt [t,t + dt) a kromoszóma megjelenését követően, és Px(t) annak a valószínűsége, hogy egy plazmid átkerül a mutáns vonalba a szelektív sweep során, mivel a sweep az intervallumban kezdődött [t,t + dt).

Komplexebb feltételezés hiányában feltételezzük, hogy az új mutációk Poisson-folyamatként érkeznek a populációba állandó σ sebességgel. Ekkor P M ( t ) = σ e − σ t . (D2)

Számolni Px(t) a következő modellt használjuk. Vegyünk egy lokálisan adaptált, állandó sűrűségű populációt N kötetben V, hogy vannak NV baktériumok jelen vannak. A populáció kezdetben olyan baktériumokból áll, amelyek egy plazmidon a fokális gént hordozzák, és amelyek sűrűséggel rendelkeznek P(t) időben tés a kromoszómájukon a fokális gént hordozó baktériumok, amelyek sűrűséggel rendelkeznek C(t). Feltételezzük, hogy minden fitneszhatás multiplikatív, a fokális gén fitneszelőnye β, és a plazmid fitneszköltsége α. Ekkor a kromoszómális és a plazmidot hordozó populációk növekedési üteme rendre ψ(1 + β), illetve ψ(1 + β)(1 − α). Egy mutáns megjelenését követően nyomon követjük a mutánsok sűrűségét a populációban, mint M(t), és feltételezzük, hogy az általa hordozott mutáció fitneszelőnyt hordoz b, így ψ(1 + b), mivel nem hordozza sem a fokális gént, sem a plazmidot. A matematikai egyszerűség kedvéért figyelmen kívül hagyjuk a szegregációt, ami nem változtat a minőségi eredményeken. Ezen paraméterek értékeit a következő feltételezések korlátozzák:

A fokális gén fittségi haszna nagyobb, mint a plazmid fitneszköltsége: β > α/(1 − α).

Az új mutáció fitnesz előnye nagyobb, mint a fokális géné (így a fokális gén fixálódik): b > β.

A Stewart és Levin-kritérium következménye: a plazmid nem tudott versenyben maradni a kromoszómális változattal azáltal, hogy transzferrel pótolja fitneszterhét: γN < ψα(1 + β).

A plazmidhordozók, kromoszómák és mutánsok (a transzkonjugánsokat pillanatnyilag figyelmen kívül hagyva) sűrűségében bekövetkező változások modellezésére (a nagybetűkkel nyomon követve), konstans populációméretet szabva, d P ( t ) dt = [ Ψ ( 1 ) − α ) ( 1 + β ) − Ψ ¯ ] P + γ PC (D3) d C ( t ) dt = [ Ψ ( 1 + β ) − Ψ ¯ ] C − γ PC (D4) d M ( t ) dt = [ Ψ ( 1 + b ) − Ψ ¯ ] M , (D5) ahol Ψ ¯ ( t ) = Ψ [ ( 1 - α ) ( 1 + β ) P ( t ) + ( 1 + β ) C ( t ) + ( 1 + b ) M ( t ) ] ∕ N a populáció súlyozott átlagos növekedési üteme az adott időpontban t és levonják az egyéni növekedési rátákból, hogy állandó populációméretet tartsanak fenn.

Feltételezzük, hogy a kromoszóma a t = 0 egyetlen baktériumban ez a kezdeti sűrűségnek felel meg C(0) = 1/V. A kromoszóma megjelenését követően, de még mielőtt a mutáns bekerülne a populációba, csak a kromoszómális és plazmidot hordozó típusok gyakoriságát vesszük figyelembe. Ebben az időszakban nyomon követjük a plazmidot hordozó típus gyakoriságát, p = P/(P + C), amely (D3) és (D4) alapján d p ( t ) d t = [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] p ( 1 − p ) értékből számítható ki. (D6)

Ennek a megoldása p(t) = (N V − 1) e [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] t 1 + ( N V − 1 ) e [ γ N − Ψ α ( 1 + β ) ] t . (D7)

Tegyük fel, hogy a mutáns egy adott időpontban jelenik meg t = t*. A mutáns megjelenése idején a populációban a plazmidhordozók, kromoszómák és mutánsok sűrűségét P ( t ∗ ) = ( N − 1 ∕ V ) p ( t ∗ ) (D8 ) C ( t ∗ ) = ( N − 1 ∕ V ) ( 1 − p ( t ∗ ) ) (D9) M ( t ∗ ) = 1 ∕ V , (D10) ahol p(t*) értéke (D7). A mutáns megjelenését követően ennek a három populációnak a dinamikáját a D3, D4 és D5 egyenletek adják meg, ez a dinamika a mutánsok számának növekedéséből áll (a szelektív sweep), miközben a plazmidhordozók és a kromoszómák száma csökken.

Ki akarjuk számolni Px, annak a valószínűsége, hogy a plazmid legalább egyszer átkerül a mutáns populációba, transzkonjugánst hozva létre, mielőtt a plazmidhordozók kihalnak. A sweep során keletkező transzkonjugánsok várható számát használjuk annak kiszámításához, hogy a sweep során mekkora valószínűséggel keletkezik legalább egy transzkonjugáns. A transzkonjugánsok pillanatnyi megjelenési sebessége a sweep során γP(t)M(t), így x(t*), a transzkonjugánsok várható száma egy szelektív sweepben az időponttól kezdődően t = t*, az X ( t ∗ ) = γ ∫ t ∗ ∞ P ( s ) M ( s ) d s , (D11 ) ahol P(s) és M(s) a D3, D4 és D5 egyenletek integrálásával számítható ki, kezdve a t*, a D8, D9 és D10 egyenletek által megadott kezdeti feltételekkel. A valószínűség Px(t*), hogy legalább egy transzkonjugáns megjelenik egy szelektív sweep-ben, amely időponttól kezdődik t*, P X ( t ∗ ) = 1 − e − X ( t ∗ ) . (D12)

(D2) és (D12) helyett (D1) PR = ∫ 0 ∞ σ e − σ t [ 1 − e − X ( t ) ] dt = ∫ 0 ∞ σ e − σ t [ 1 − e − γ ∫ t ∞ P ( s ) M ( s ) ds ] dt . (D13)

Végül a számításhoz Tp a 11. egyenletből kifejezésekre van szükségünk Ta és Tf. Feltételezve, hogy a gén plazmid által hordozott változatára rögzített populációban a kromoszómák Poisson-folyamatként jelennek meg χ sebességgel, Ta = 1/χ. Tf közelíthető úgy, hogy feltételezzük, hogy a kromoszóma rögzül, mert ebben az esetben nem történik szelektív sweep, Tf egyszerűen az az idő, amely szükséges ahhoz, hogy a kromoszómák száma 1-ről >-re változzon N − 1, vagy ezzel egyenértékű, ha a plazmidhordozók gyakorisága 1-ről 1/N <1/N. Ezt (D7) beállítással lehet kiszámítani p(Tf) = 1/N a (D7)-ben, és megoldani Tf. Ez T f = 2 ln ( N V − 1 ) Ψ α ( 1 + β ) − γ N . (D14)

Megjegyzés a számításhoz: (D3, D4 és D5) nem oldható meg analitikusan (H ofbauer és S igmund 1988). Ezeket azonban numerikus integrációval egyszerű megoldani. A plazmidot hordozó sejtek gyakorisága mindig legalább olyan gyorsan csökken, mint (D7), mivel a mutánsok, ha megjelennek, csak felgyorsítják a plazmid hanyatlását (a transzkonjugánsokat figyelmen kívül hagyva).

Ezért indokolt az integrációt a következő időpontban befejezni Tf, az az időpont, amikor a plazmidot hordozó sejtek száma <1. Így számítási célokra Tf biztonságosan használható mindkét integrál felső határaként (a ∞ helyett) a (D13)-ban.


Nézd meg a videót: Osnovni oblici uzgoja vinove loze . (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Jensen

    Ez a szórakoztató információ

  2. Joed

    Nem fog működni.

  3. Moogujora

    Ez átfogalmazható?

  4. Roibin

    Nagyon köszönöm a támogatást, hogyan köszönhetném meg?

  5. Andraemon

    Something is wrong with nothing

  6. Fortune

    Ez a téma egyszerűen összehasonlíthatatlan :), nagyon tetszik.



Írj egy üzenetet