Információ

Mi lenne a becsült költségsorrend?

Mi lenne a becsült költségsorrend?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Újonc vagyok az NGS világában, de úgy gondoltam, hogy ez egy megfelelő és olcsóbb alternatíva a hagyományos Sanger szekvenáláshoz ehhez az alkalmazáshoz. Azonban nem vagyok olyan biztos abban, hogyan számoljam ki ezt a költséget, ezért reméltem, hogy megkeresem, hátha tud valaki segíteni. Ez az én általános iskolai kutatási projektemhez szól.

Problémanyilatkozat

Készítek egy racionális könyvtárat ~1000 fehérjekomplexből, amelyek ugyanabba a fehérjecsaládba tartoznak. Egy komplexben 4 fehérjeplazmidot kell készíteni, és ezeket szintetikus genomikus klónozási módszerek kombinációjával kell előállítani, cDNS-t használva, és több helyre irányított mutagenezist a meglévő plazmidokon. Mielőtt tesztelném a komplex funkciójukat, igazolnom kell, hogy a klónozási lépések sikeresek voltak-e az egyes plazmidok szekvenciájának ellenőrzésével.

Minden fehérjeszekvencián elvégezhetném a hagyományos Sanger-szekvenálást, de mivel mindegyik fehérje ~2 kb hosszú, plazmidonként 4 egyirányú szekvenálási reakcióra lenne szükségem, hogy lefedje a CDS-t. Összesen fehérjekomplexenként ez 16 szekvenálási reakció. Szekvenálási reakciónként 5 USD-ért minden fehérjekomplex 80 USD-ba kerülne a szekvenálást. 1000 szekvencia esetén ez 80 000 USD lenne a Sanger-szekvenálásban.

Valami másra gondoltam – a könyvtár létrehozása után, mondjuk 384-es darabokban, elküldöm NGS-nek egy Illumina MiSeq-en.

Segítségkérés

Tekintettel arra, hogy:

  • Nem vagyok elkötelezve semmilyen konkrét NGS protokollhoz,
  • Az egyetlen célunk itt az, hogy így vagy úgy, a klónozott plazmidok szekvenciáját ellenőrizzük.
  • 1000 fehérje a megfelelő számú fehérje szekvencia-ellenőrzésére. Fehérjekomplexenként 4 plazmid.

Mi lenne a megfelelő szekvenálási stratégia, amivel jóval 80 000 alá érnénk a szekvenálási költségeket?


A legtöbb NGS-megközelítésnek lehetővé kell tennie az összes plazmid szekvenálását nagyon alacsony bázisköltség mellett (az árakról itt olvashat bővebben). A kihívás az összes szekvenálása során, ha vannak közös szekvenciák az összes plazmidban, az lesz, hogy minden egyes mintához/plazmidhoz adaptereket szerezzünk, hogy a leolvasásokat vissza lehessen képezni a megfelelő plazmidokra.


A DNS-szekvenálás ára 2,7 milliárd dollárról 300 dollárra esett kevesebb mint 20 év alatt

A G enome szekvenálás valamikor hihetetlenül drága volt. Az 1990-ben elindított Human Genome Project, az emberi genom dekódolására irányuló nemzetközi erőfeszítés, 13 évig tartott, és a becslések szerint 2,7 milliárd dollárt fordítottak. Aztán 2007-ben a DNS úttörője, James Watson lett az első ember, akinek kevesebb mint 1 millió dollárért szekvenálták a genomját. Azóta a genomszekvenálás költsége a Moore-törvénynél gyorsabb ütemben csökken.

Most a Nebula Genomics, a Harvard Egyetemen működő, George Church genetikus társalapítója, a legújabb Apple Watch áránál olcsóbban indít egy otthoni teljes genom szekvenálási tesztet. 299 dollárért a Nebula szolgáltatása egy személy teljes genetikai kódjának kiolvasását biztosítja.

A Nebula szekvenálása sokkal átfogóbb teszt, mint az olyan cégek, mint a 23andMe és az Ancestry által kínált tesztek, amelyek egy másik, genotipizálásnak nevezett technikát alkalmaznak. A genotipizálás a genomnak csak egy kis részét vizsgálja. Például a 23andMe 199 dolláros egészségügyi és származási tesztje egy maroknyi genetikai változatról számol be, amelyek körülbelül egy tucat egészségügyi állapothoz kapcsolódnak. A szekvenálás egy személy összes génjét és azok változatait vizsgálja. Ez a különbség néhány oldal és egy teljes könyv elolvasása között.

A Nebula szekvenálása sokkal átfogóbb teszt, mint az olyan cégek, mint a 23andMe és az AncestryDNA.

2016-ban a szintén Church által alapított bostoni székhelyű Veritas Genetics volt az első vállalat, amely átlépte a genomszekvenálás sokat hangoztatott 1000 dolláros küszöbét. Tavaly a Veritas ezt az árat 599 dollárra csökkentette, és az automatizálásnak köszönheti a csökkenést. 2019 végén azonban a cég hirtelen leállította az Egyesült Államokban folytatott tevékenységét, miután az induló „váratlan kedvezőtlen finanszírozási helyzetnek” nevezett.

Ma a Nebula még olcsóbb genomszekvenálást kínál – és új üzleti modellt próbál ki. A legtöbb otthoni DNS-tesztelő cég egyszeri vásárlásra támaszkodik. Az ügyfeleknek kevés okuk van arra, hogy folytassák kapcsolatukat ezekkel a cégekkel, miután megvizsgálták DNS-eredményeiket. Annak érdekében, hogy az emberek visszatérjenek, a Nebula előfizetéses szolgáltatást indít, amely hetente frissíti az új genetikai tanulmányokat, és elmagyarázza a felhasználóknak, hogy ezek az eredmények hogyan kapcsolódnak saját DNS-ükhöz. E további betekintés érdekében az ügyfelek havi 9,99 USD havi díjat fizethetnek éves előfizetésért vagy 19,99 USD havi előfizetést a genomszekvenálás kezdeti 299 USD-n felül. A Nebula ügyfelei mélyreható származási elemzést is kapnak.

„Úgy gondolom, hogy az egész piac olyan átfogóbb teszteket kínál, amelyek túlmutatnak a származáson” – mondja Dennis Grishin, a Nebula társalapítója és tudományos igazgatója, általánosságban utalva a közvetlen fogyasztói genetikai tesztelésre.

Valójában az Ancestry genealógiai cég is hasonló megközelítést alkalmaz. Októberben új egészségügyi szűrővizsgálatot jelentett be 199 dollárért, amely kezdetben néhány egészségügyi állapotról fog beszámolni. A félévenkénti 49 dolláros előfizetési díj néhány havonta frissíti a felhasználókat genetikai információiról. A teszt még nem érhető el, de az Ancestry szerint valamikor 2020-ban fog megjelenni. Egy olyan időszakban, amikor az otthoni genetikai tesztelés őrülete elcsendesedett, ezek a kibővített szolgáltatások új érdeklődést válthatnak ki.

A Nebula azt reméli, hogy tovább tudja különböztetni magát azáltal, hogy más megközelítést alkalmaz a magánélet védelmében. Más DNS-tesztelő cégekhez hasonlóan a Nebula is megosztja a felhasználók adatait kutatópartnerekkel, például gyógyszergyártókkal. De az ügyfeleknek a szokásosnál nagyobb kontrollt biztosít genetikai adataik felett. Az Ancestry és a 23andMe két lehetőséget kínál az adatok kutatási célú megosztására: egy átfogó hozzájárulással, amely lehetővé teszi a vállalatok számára, hogy megosszák az azonosítatlan genetikai adatait bármely kutatási partnerrel, aki használni kívánja azokat, valamint egy lehetőség, hogy egyáltalán ne osszák meg adatait. A Nebula ezeket a lehetőségeket is kínálja, plusz egy harmadikat is: a felhasználók választhatnak, hogy külön hozzájárulási kérelmet kapjanak minden alkalommal, amikor egy kutatópartner fel kívánja használni adataikat.

Egy olyan időszakban, amikor az otthoni genetikai tesztelés őrülete elcsendesedett, ezek a szolgáltatások új érdeklődést válthatnak ki.

„Megpróbálunk gondoskodni arról, hogy minden nagyon átlátható legyen, hogy az emberek tudják, mi történik az adataikkal, ki és milyen célra használja fel azokat” – mondja Grishin. A Nebula blokkláncot használ az ügyfelek adatainak védelmére, és névtelen genomszekvenálást kínál.

Hogy van-e tömegpiac a teljes genom szekvenálásának, az még várat magára. Gillian Hooker, a National Society of Genetic Counselors elnöke szerint az egyik akadály az, hogy sokan egyszerűen nem hallottak a teljes genom szekvenálásáról, vagy szkeptikusak abban, hogy az eredmények mennyire hasznosak lesznek az egészségük kezelésében. Végül is a tudósok még mindig tanulják, hogyan értelmezzék a genomot, és a legtöbb orvos még nem tudja, mit kezdjen a teljes genom szekvenálási tesztek eredményeivel.

„Vannak olyan emberek, akiknél genomszekvenálást végeznek, és megtanulnak valamit, ami megváltoztatja egészségügyi ellátásukat” – mondja Hooker. Például egy személy megtudhatja, hogy olyan genetikai változata van, amely növeli a rák vagy a szívbetegség kockázatát, ezért az orvos gyakoribb szűrést javasolhat ezekre a betegségekre. Jelenleg a legtöbb ember nem hagyja el a hasznosítható információkat, mondja. De ez valószínűleg megváltozik, ahogy a tudósok genetikai ismeretei fejlődnek.

Az egyre olcsóbb árak miatt a teljes genom szekvenálása hamarosan felválthatja a korlátozottabb genetikai teszteket, amelyek ma uralkodnak a piacon.


Mennyibe kerül az emberi genom szekvenálás? (képekkel)

Két csoport kapcsolódott össze az emberi genom első szekvenálásában: a Human Genome Project, amelyet az Egyesült Államok Energiaügyi Minisztériuma finanszírozott, és a Celera Genomics, egy magáncég. A Human Genome Project 10 évig tartott, és 3 milliárd dollárba került, míg a Celera genomszekvenálási projekt két évig tartott, és mindössze 300 millió dollárba került. Mindkét projekt 2000-ben vagy 2001-ben zárult, attól függően, hogy mi tekinthető "teljes" emberi genom szekvenálásnak.

Az emberi genom szekvenálásának mérföldköve rendkívül jelentős volt, mert közvetlen leírást adott nekünk az emberi lény létrejöttének alapjául szolgáló kódról, még akkor is, ha annak csak kis részeit értjük. A humán genomban lévő gének számát 20-25 ezerre becsülték, ami kisebb a vártnál. Ahogy egyre több genom szekvenálódik, úgy növekszik a tartalmukra vonatkozó ismereteink, valamint az a képességünk, hogy ezeket az eredményeket hasznosan alkalmazzuk a személyre szabott orvoslásban.

A génszekvenálás költségei exponenciálisan csökkentek az emberi genom 2000-es szekvenálása óta. 2001-ben a DNS szerkezetének társfelfedezője, James Watson genomszekvenálása 2 millió USD költséggel fejeződött be. 2008-ban az első teljes genomszekvenálási szolgáltatást 100 000 USD áron értékesítették az ügyfeleknek. 2008 márciusára az egyik vállalat, az Applied Biosystems, két hét alatt 60 000 USD-ért végzett egy emberi genom szekvenálást, ami az eddigi legjobb költség. Egy másik cég, az Intelligent Bio-systems olyan rendszert fejlesztett ki, amely 24 óra alatt képes szekvenálni egy teljes emberi genomot 5000 USD-ért.

Árat ajánlottak annak, aki elsőként szekvenál 100 humán genomot, egyenként 10 000 USD-ért tíz napon belül vagy kevesebben. A Steward Blusson gyémántkutató által adományozott 10 millió USD értékű díj a 2013. október 4-i határidőig továbbra is elérhető lesz. A világ számos tudósa nagy valószínűséggel tartja valószínűnek, hogy a díjat a határidő lejárta előtt, valószínűleg jóval korábban igénylik.

Ha a genomszekvenálás költsége 1000 USD alá, vagy még jobb esetben 500 USD alá esik, sok jövőkutató minőségi változásokat jósol az orvoslásban. Ha több millió genomot szekvenálnak meg és tesznek nyilvánosan elérhetővé, a genetika tudománya számára megszerezhető tudás hatalmas lenne.

Michael régóta munkatárs, aki a paleontológiával, fizikával, biológiával, csillagászattal, kémiával és futurizmussal kapcsolatos témákra specializálódott. Amellett, hogy lelkes blogger, Michael különösen szenvedélyes az őssejtkutatás, a regeneratív gyógyászat és az élethosszabbító terápiák iránt. Dolgozott a Matuzsálem Alapítványnak, a Singularity Institute for Artificial Intelligence-nek és a Mentőcsónak Alapítványnak is.

Michael régóta munkatárs, aki a paleontológiával, fizikával, biológiával, csillagászattal, kémiával és futurizmussal kapcsolatos témákra specializálódott. Amellett, hogy lelkes blogger, Michael különösen szenvedélyes az őssejtkutatás, a regeneratív gyógyászat és az élethosszabbító terápiák iránt. Dolgozott a Matuzsálem Alapítványnak, a Singularity Institute for Artificial Intelligence-nek és a Mentőcsónak Alapítványnak is.


Fehérje-fehérje kölcsönhatások: áttekintés

Többszörös szekvencia igazítás (MSA) alapú interakciós előrejelzés

A DNS-szekvenátorok népszerűsége miatt számos genomprojektet indítottak, és különféle organizmusok genomját szekvenálták és megjegyzésekkel látták el. Számos genom aminosav- vagy nukleotidszekvenciája elérhető számos nyilvános adatbázisban, és a GenBank, az EMBL és a DDBJ az ilyen információk legnagyobb tárháza. A háromdimenziós struktúrák alacsony számával szemben a nyilvános adatbázisokban található szekvenciák száma rendkívül magasabb, ami kedvez annak a tudományos közösségnek, amely ezeket a szekvenciákat kutatásai során, így az interakció előrejelzésében is felhasználja. A módszerek egy osztálya többszörös szekvencia-illesztést (MSA) használ a fehérje-fehérje kölcsönhatás előrejelzésére, és mindegyik olyan biológiai előfeltevésen alapul, amelynek célja általában az élőlények szekvenciái közötti konzerváció azonosítása igazító szoftver segítségével. Ők:

Filogenetikai profil alapú előrejelzés (együttes előfordulás): A módszer azon a biológiai előfeltevésen alapul, hogy ha két gén konzervált marad több organizmus összehasonlításakor, akkor az ezekből a génekből lefordított megfelelő fehérje kölcsönhatásba lép. Ez a feltevés még erősebbé válik, ha mindkét konzervált gén nincs jelen egy vagy több összehasonlított organizmusban, ami azt mutatja, hogy szelektív nyomás nehezedik arra, hogy mindkettő megmaradjon, vagy együtt távolodjanak el a genomból. A módszer használatának bizonytalansága abban rejlik, hogy azonosítani kell, hogy filogenetikailag milyen távolságban legyenek az összehasonlított szervezetek, ezért a közeli organizmusok kiválasztása megnehezíti annak meghatározását, hogy a fehérjék azért konzerváltak-e, mert evolúciós nyomás nehezedik rájuk, vagy egyszerűen azért, mert nem volt elég idő a szétválásra. Minél távolabb vannak az élőlények, annál megbízhatóbb lesz az előrejelzés, de kevesebb kölcsönhatást azonosítanak (Valencia és Pazos, 2002).

Szomszédsági gének alapú előrejelzés: Ez a módszer az előző evolúciója, ugyanazt a feltevést veszi figyelembe, és ugyanazt a kételyt veti fel, de úgy véli, hogy a géneknek amellett, hogy konzerváltak, szomszédoknak kell lenniük. Ez a módszer a közelebbi gének megőrzésének azonosítását helyezi előtérbe, figyelembe véve, hogy hajlamosak hasonló időszakokban fejlődni, mint például az egyszerre átíródó és lefordított operonok, amelyek valószínűleg azonos funkcióban vagy metabolikus útvonalon kölcsönhatásba lépő fehérjestruktúrákat generálnak (Valencia és Pazos, 2002).

Filogenetikai fa alapú előrejelzés (Mirrortree): A módszer azon a biológiai előfeltevésen alapul, hogy ha két fehérje kölcsönhatásba lép, hasonló evolúciós nyomáson mennek keresztül, és együtt fejlődnek egy szervezetben (Zhou és Jakobsson, 2013). Így, ha több szervezetben hasonlítjuk össze ugyanazt a fehérjét, a megfelelő kölcsönhatásba lépő fehérjék hasonló filogenetikai fát mutatnak be, az egyik tükröződik a másikban, és hasonló evolúciót képvisel a különböző szervezetekben. Azonban a különbözőképpen fejlődő fehérjék kölcsönhatásba léphetnek, és ezzel a módszerrel figyelmen kívül hagyhatók. A kölcsönhatás azonosítása érdekében különféle fehérjék filogenetikai állományait készítik, és a hasonló topológiát bemutató filogenetikai fák feltárják a kölcsönhatásban részt vevő fehérjéket (Pellegrini et al., 1999). Ez megvalósítható filogenetikai fapárok távolságmátrixmá alakításával és a korrelációs együttható kiszámításával. A magas korrelációs együtthatójú mátrixok hasonló topológiájú filogenetikai fát jeleznek.

Génfúzió alapú módszer: A módszer alapjául szolgáló biológiai feltevés az, hogy egy szervezetben két gén (ga, gb) létezik, amelyek funkcionális doménjei homológok egy másik filogenetikailag közeli szervezetben (gc) lévő egyetlen génnel, valószínűleg a két egyedi gén (pa és pb) által kódolt fehérjék. ) fizikai kölcsönhatásba lépnek, hogy betöltsék szerepüket, amit egy olyan evolúciós folyamat magyaráz, amely a gének fúziójához és egyetlen fehérje másik organizmussá (pc) történő transzlációjához vezetett. A gének közötti homológia azonosítható szekvencia-illesztéssel, és ez a feltevés még erősebbé válik, ha többszörös összehangolásban észleljük a két egyedi gént bemutató organizmuscsoportot, és egy másik csoportot, amely a fuzionált géneket mutatja be (Zahiri et al., 2013 ).


Következő generációs szekvenálás

2005 óta a laboratóriumok által használt automatizált szekvenálási technikák a következő generációs szekvenálás ernyője alá tartoznak, amely a gyors DNS-szekvenáláshoz használt automatizált technikák csoportja. Ezek az automatizált, alacsony költségű szekvenálók egy nap leforgása alatt több százezer vagy milliónyi rövid fragmentumból (25-500 bázispár) álló szekvenciákat tudnak előállítani. Ezek a szekvenálók kifinomult szoftvert használnak, hogy átvészeljék az összes töredék rendbetételének nehézkes folyamatát.


Nagy áteresztőképességű sejtes RNS-szekvenálás (HiCAR-Seq): Költséghatékony, nagy áteresztőképességű 3′ mRNS-Seq módszer, amely lehetővé teszi az egyéni mintaminőség-ellenőrzést

A nagy áteresztőképességű szűrés a gyógyszerfejlesztés egyik pillére. Az elfogulatlan transzkripciós profilalkotást ma már széles körben használják a gyógyszer hatásmechanizmusának, a célon kívüli hatásoknak és a citotoxicitásnak a mélyebb megértésére. Bár a jelenleg rendelkezésre álló nagy áteresztőképességű RNA-Seq (HT RNA-Seq) módszerek, mint például a PLATE-Seq, DRUG-Seq és BRB-Seq ezeket a célokat szolgálják, ezeknek a módszereknek a természete nem teszi lehetővé a minta szerinti szekvenálási könyvtár minőségellenőrzését. . Itt egy HTR módszert írunk le, az úgynevezett High-throughput CellulAr RNA Sequencing (HiCAR-Seq). A HiCAR-Seq-et úgy optimalizálták, hogy közvetlenül tenyésztett sejteken (akár 1000 sejten) vagy 10 ng teljes RNS-en működjön. A HiCAR-Seq magában foglalja a reverz transzkripciót tenyésztett sejtekből vagy teljes RNS-ből oligo-dT primerek felhasználásával, majd a teljes hosszúságú cDNS-ek PCR-amplifikációját, mintaspecifikus vonalkód-primerek felhasználásával az egyes lemezüregekben. A cDNS amplifikációja minden mintából a Bioanalyzer segítségével ellenőrizhető. Ez a lépés nem csak a cDNS-amplifikációt tárja fel, hanem nagyobb pontosságot is biztosít a különböző mintákból származó azonos koncentrációjú cDNS összegyűjtésére. Egyetlen összevont cDNS-könyvtárat teszünk alkalmassá Illumina szekvenátorokon történő szekvenálásra, címkéző készlet segítségével. Mivel a HiCAR-Seq egy kis régiót céloz meg az mRNS-ek 3′-ánál, már 3-4 millió leolvasás/minta elegendő ahhoz, hogy következtessen a génexpresszió változásaira emberi vagy egérsejtekben. Meggyőződésünk, hogy a HiCAR-Seq robusztus és versenyképes kiegészítést jelent a transzkriptum alapú nagy áteresztőképességű szűrési módszerek meglévő készletéhez. © 2020 Wiley Periodicals LLC.

1. alapprotokoll: cDNS szintézis és vonalkódoló/dúsító PCR

2. alapprotokoll: Nextera címkézés/erősítés, mennyiségi meghatározás és szekvenálás


DNS szekvenálás

A DNS-szekvenálás egy DNS-molekulában lévő nukleotidbázisok leolvasásának folyamata. Oldja fel a genomot, és válaszoljon a biológia legnagyobb kihívást jelentő kérdéseire innovatív és hozzáférhető szekvenálási megoldásainkkal.

Szekvenátoraink több mint 25 éven keresztül jelentős tudományos áttörésekhez járultak hozzá, beleértve az első emberi genom szekvenálását és a betegségekben, például a cisztás fibrózisban szerepet játszó gének felfedezését. Folyamatos innovációnk a szekvenálási technológiák terén továbbra is új felfedezéseket hajt végre.

A teljes genom szekvenálásától a meghatározott genomi régiók célzott szekvenálásáig szekvenálási portfóliónk a DNS szekvenáláshoz szükséges átviteli és kutatási alkalmazások széles skáláját támogatja.


Következő generációs szekvenálási technológiák

Bár a DNS- és RNS-szekvenálás története öt évtizedre nyúlik vissza, a nagyszabású, masszívan párhuzamos szekvenálás vagy a következő generációs szekvenálás (NGS) csak körülbelül 10 éve érhető el a kereskedelemben. Mindazonáltal az NGS-sel a szekvenálási sebesség meteorikus növekedése drámai módon megváltoztatta a genomunkról és önmagunkról alkotott ismereteinket. Az első humán genom szekvenálása haploid referenciaként közel 10 évig tartott, de mára a teljes diploid emberi genom szekvencia néhány nap alatt elkészíthető. Az NGS emellett csökkentette a szekvenciaadatok előállításának költségeit, és számos szekvencia-alapú módszer jelent meg a genom vizsgálatára NGS-t használó leolvasási módszerrel, és számos fajra alkalmazták. Az NGS-módszerek az orvosi szférába is bekerültek, és egyre nagyobb mértékben fogják alkalmazni a diagnózisban és a kezelésben. Az NGS-t nagyrészt a rövid olvasási idő generálása (150 bp) vezérelte, de új platformok jelentek meg, amelyek már képesek hosszú, többkilobázisú olvasást generálni. Ez utóbbi platformok referenciafüggetlen genom-összeállításokat és hosszú távú haplotípus generálást tesznek lehetővé. A gyors DNS- és RNS-szekvenálás ma már általánossá vált, és továbbra is egyre nagyobb hatással lesz a biológiára és az orvostudományra.

Copyright © 2019 Cold Spring Harbor Laboratory Press minden jog fenntartva.


RNS-fragmentálás és szekvenálás (RF-Seq): Költséghatékony, időhatékony és nagy áteresztőképességű 3′ mRNS szekvenáló könyvtár építése egyetlen csőben

Az elmúlt évtizedben a következő generációs szekvenáláson (NGS) alapuló RNS-szekvenálást (RNA-Seq) alkalmazó transzkriptomikai vizsgálatok nagymértékben hozzájárultak a sejtekben és szövetekben bekövetkező biokémiai és fiziológiai változások jellemzéséhez a szervezetekben és a kísérleti körülmények között. Az RNA-Seq kritikus lépései közé tartozik a szekvenáló könyvtár elkészítése extrahált RNS-ből. Jelenleg az RNA-Seq készletek nagy készlete kapható a kereskedelemben. Ezekben a készletekben az RNS szekvenáló könyvtárrá történő átalakítása több lépésből áll, amelyek munkaigényesek, és a könyvtár-előkészítés mintánkénti költsége korlátozhatja az RNA-Seq rutinszerű használatát. Itt egy egyszerű módszert írunk le az RNS-Seq könyvtár felépítésére, amelyet R NA Fragmentációnak és szekvenálásnak (RF-Seq) neveznek. Az RF-Seq mindössze 10 ng teljes RNS-t igényel, és megkönnyíti az mRNS-ek 3'-végének szekvenálását. Az RF-Seq magában foglalja a teljes RNS fragmentációját, amelyet reverz transzkripció követ az oligo(dT) primer/templát kapcsoló oligonukleotid jelenlétében, és a minta vonalkódolása/dúsítása egyetlen PCR-csőben/lyukon belül. A minta vonalkódolási/dúsítási lépése nagyobb rugalmasságot biztosít az egyedi minták kezeléséhez. Mindössze húsz ortogonális Illumina TruSeq HT vonalkódoló primer használata megkönnyíti 96 egyedileg jelölt RF-Seq könyvtár elkészítését egyetlen 96 lyukú PCR lemezen. Tizenkét RF-Seq könyvtár 4 órán belül elkészíthető, hozzávetőleges költsége 10 USD/minta. Példát mutatunk be az RF-Seq használatával a génexpresszió mérésére egy veleszületett immunpálya aktiválása után, STING aktivátor segítségével emberi vérsejtekben, kiemelve a javasolt módszer potenciális hasznosságát rutin transzkriptomikai alkalmazásokban, például nagy áteresztőképességű gyógyszerszűrésben és/vagy preklinikai toxicitási vizsgálatok. © 2019, John Wiley & Sons, Inc.

Alapprotokoll: RNS fragmentáció és szekvenálás (RF-Seq): Költséghatékony, időhatékony és nagy áteresztőképességű 3′ mRNS szekvenáló könyvtár felépítése egyetlen csőben


Átirat

A Motley Fool Explorer vezető tanácsadója, Simon Erickson: Sziasztok. Simon Erickson vagyok, a Motley Fool Explorer vezető tanácsadója, és itt vagyok az Ipari Biotechnológiai Konferencián Philadelphiában, Pennsylvaniában. Hozzám csatlakozik Matt McKnight, aki a Ginkgo Bioworks kereskedelmi igazgatója.

Matt, még egyszer köszönöm, hogy csatlakozott hozzám ma reggel.

Matt McKnight, a Ginkgo Bioworks kereskedelmi igazgatója: Örülök, hogy itt lehetek.

Simon: Szintetikus biológiáról beszélünk, ami egy olyan kifejezés, amelyet közönségünk nagy része valószínűleg nem ismer annyira. Mit is jelent a szintetikus biológia?

Matt: A legmagasabb szinten ez az egyik legcsodálatosabb technológia, amelyet még ki kell használnunk a gyártásban. Tehát ha a középiskolai végzettségére gondol. Felvetted a fizikát. Valaki kitalálta, hogy a fizikából olyan épületeket építsen, amelyek többé nem dőlnek le.

Ön kémiát vett fel, valaki pedig kémiát, és azt mondta, hogy létrehozunk vegyészmérnököt, és megismételhető folyamattá alakítjuk.

Ma az utolsó középiskolai tantárgyunk, a biológia küszöbén állunk, és ez -- a legmagasabb szinten (és minden kollégám rám néz, és azt mondja: "Ez sokkal bonyolultabb, Matt. .") -- de a biológia tanulmányozásának küszöbén állunk, és azt mondjuk, hogy ez egy kiszámítható mérnöki tudományág lehet, amellyel mindent meg tudunk gyártani, ami körülvesz.

És ha belegondolunk, az a tény, hogy nem mi gyártunk mindent magunk körül, amikor a világot a biológia hozza létre, a legnagyobb dolgokat: az erdőket. A legkisebb dolgok: a 30 000 ford./perc fordulatszámú motorok és a legkisebb számítógépes chip mérete mind a biológia alkotása. Mégsem rendelkezünk ma már olyan eszközökkel, amelyek segítségével kiszámíthatóan és nagy valószínűséggel használhatjuk a biológiát az emberiség mérnöki eszközeként.

Szóval, mi a szintetikus biológia? Ez a DNS felvételének folyamata, amely csak 0-k és 1-ek, mint egy számítógép, csak véletlenül négy van belőle: A, T, C és G. A DNS szintetizálása és a sejtekbe helyezése, amelyek gyártási eszközök. Ha elmondjuk ezeket a cellákat, akkor ezeket az utasításokat szeretnénk, hogy elkészítse. Azt akarjuk, hogy egyél cukrot, azt akarjuk, hogy csinálj valamit és készíts egy terméket. És ez a szintetikus biológia. A DNS-ből hozzuk létre saját 0-ból és 1-ből, vagy A-ból, T-ből, Cs-ből és G-ből álló szekvenciánkat. Tedd őket cellákba. És mondd el azoknak a sejteknek, hogy olyasmit akarunk belőlük csinálni, amit az emberek is használhatnak. És ez a legalapvetőbb verzió, amit adhatok.

Simon: Tehát a földszinten az alapoktól kezdve megtervezzük a dolgokat, és igazán klassz termékeket készítünk, hogy szép dolgokat készítsünk belőlük.

Matt: Olyan dolgok, amelyeket soha nem tudtunk megtenni a körülöttünk lévő környezetünk különböző részei feletti emberi ellenőrzés történetében.

Simon: Az egyik ilyen dolog, láttunk egy JV-t, amit éppen tavaly alapítottatok a Bayerrel, Joyn Bio néven, amelyet tulajdonképpen a mezőgazdasági iparban használnak. El tudná mondani egy kicsit arról, hogy ennek a közös vállalkozásnak mi a célja?

Matt: Igen, fontosnak tartom, hogy a szintetikus biológia kontextusában kezdjük: mit próbál csinálni a Ginkgo?

Tehát amit elmondtunk, az a küldetésünk. és ez a küldetés, amelyet minden hónapban a csapatunk elé állítottunk, hogy megkönnyítsük a biológia tervezését és olcsóbbá tegyük a biológia tervezését. OK, ez mit jelent? Nos, az egyszerű tény az, hogy nagyon törődünk azokkal az eszközökkel, amelyeket az embereknek különböző iparágakban kell használniuk ahhoz, hogy a biológiát még sok más iparágban alkalmazhassuk.

Tehát felteszi magának a kérdést: "Miért olyan nagy dolog a biotechnológia a 70-es évek óta?" Nos, ez azért van, mert a biotechnológiának van elég tőkéje ahhoz, hogy megkösse ezeket a nagyon kockázatos fogadásokat. Ha el tudjuk hozni a költségstruktúra leépíteni a mérnökbiológiát az alapvető eszközök megépítésével – és egy pillanatban mondok egy példát – le tudjuk hozni az eszközöket, és ezt sok más iparágban is alkalmazni tudjuk.

Tehát a Ginkgo a következőkre összpontosít: Hogyan könnyíthetjük meg a biológia tervezését, és ezt kétféleképpen tesszük.

Öntödéket építünk, ami pusztán az a folyamat, amikor egy PHD-tudóst használunk, különálló egységműveleteket vonunk ki, szoftvereket csomagolunk ezek köré, és automatizáljuk őket robotokon.

Másodszor pedig össze kell gyűjteni az összes adatot, amely átmegy azon cellák tesztjein, amelyekről beszéltem, és visszacsatoljuk őket a tervezési folyamatba.

Tehát a hatékonyságunk, összteljesítményünk több mint 60-szorosára nőtt az elmúlt három évben, míg a létszámunk hétszeresére nőtt.

Csökkentjük tehát ennek a rendkívül bonyolult sejttervezésnek a költségeit, és olyan nagy cégek, mint a Bayer Cropscience, azt mondják: "Elképesztő új termékeket akarunk létrehozni, mi a legjobb módja ennek? Százmillió dollárt költhetünk el. , vagy ötszáz millió dollárt vagy egymilliárd dollárt a DNS-tudósokra. Vagy elmehetünk a Ginkgo-hoz, és ezért a milliárd dollárért vagy az 500 millió dollárért a hatékonyság 100-szorosát költhetjük el, és sokkal nagyobb a valószínűsége annak, hogy elérjük gólok."

Szóval mit akar tenni a Bayer? A Ginkgo nevében fogok beszélni, mert ez egy külön cég...

Simon: Biztos.

Matt: A Joyn Bio, egy különálló cég, nagy hangsúlyt fektet a mikrobák nitrogénmegkötésére.

Szóval, mi az alkalmazás? Ma az üvegházhatású gázok 4%-át használjuk fel, és vegyi eljárással nitrogén alapú műtrágyát állítunk elő a kukorica, a búza és a rizs, alapvető növényeink etetésére. Ha meg tudná reprodukálni azokat a baktériumokat, amelyek például a földimogyorón élnek, amelyek természetesen ezt a folyamatot végzik, és a kukoricán növekednének, akkor csökkentheti a szén-dioxid-kibocsátást. Kihagyhatná a nitrogén alapú műtrágya szükségességét. Elképzelheti a nitrogén alapú műtrágyák piacának méretét.

Simon: Hatalmas.

Matt: . hogy ezt együtt meg tudjuk oldani Joyn Bio segítségével.

Simon: Így a soros növények segítése fokozza a nitrogénfelvételt. Nagyon jó lehetőségnek tűnik.

Matt: Ez egyike azoknak a Szent Grál-lehetőségeknek, amelyek segítségével a biológiát felhasználhatjuk arra, hogy javítsuk a világ számára megtermelt élelmiszer mennyiségét, hogy támogassuk a növekvő népességet, hogy ezt kevésbé károsítsuk a környezetre – ez egy a sok nagyszerű lehetőség közül. Ez az egyik legvilágosabb.

Simon: Matt, ez egy hatalmas lehetőség. Valószínűleg itt megállhatnánk. De még többet fogok kérni tőled. Milyen további lehetőségek vannak a mezőgazdaságon kívül, amelyeken a Ginkgo jelenleg is dolgozik?

Matt: Tehát úgy tekintünk erre, mint egy alapvető átalakulásra abban, hogy a világ hogyan fogja előállítani a dolgokat.

Őszintén szólva, szó szerint azt mondhatnánk, hogy a GDP szinte minden részének van olyan része az ellátási láncban, amelyet a biológiának kellene érintenie. Tehát a mi megközelítésünk az, hogy egyszerűbbé tegyük a biológia tervezését, olcsóbbá tegyük a biológia tervezését, majd kitaláljuk, hogyan tudunk partnerséget vállalni olyan nagyszerű alkalmazási területeken, amelyek tudják, hogy be kell építeniük a biológiát a gyártási rendszerükbe. Behozták a fizikát, behozták a kémiát, és tudják, hogy be kell vinni a biológiát.

Tehát megnézheti a környezet makro változásait, és megkérdezheti: "Hol vannak azok a helyek?" Egyértelműen a bioüzemanyagokban van, ami az iparág első nagy íve volt. De most csak nézze meg a sajtót: "Hogyan fogjuk táplálni a világot fehérjeoldalon?" Rengeteg új élelmiszer, amely biológiailag vezérelt új élelmiszer lesz, ami nagyon érdekel minket. Azért vagyunk itt az Industrial Biotech-nél, mert egyre több ipari alkalmazás létezik az enzimek és a biológia használatának spektrumában. .

Ezek a nagy piaci lehetőségek. Úgy érezzük, hogy ez az egész GDP-t érinti. De minket is teljesen lenyűgöz a hatalom, és őszintén szólva alázatosak vagyunk a biológia ereje előtt minden nap, és úgy érezzük, nagyon fontos, hogy tiszteletben tartsuk ezeket a dolgokat, ezért nagyon részt veszünk abban, hogy segítsünk a kormányzati közösségnek, hogy biztosítsák a megfelelő körüli szabályozás és megfelelő védelem ezeknek a dolgoknak a végrehajtása körül.

Jason, a vezérigazgatónk éppen most tett egy nagy bejelentést a nemzetbiztonsági közösséggel végzett munkánkról. Valójában annak biztosítása, hogy ebben a környezetben ne legyenek rossz színészi reakciók. A legszórakoztatóbb az, hogy nagy rajongói vagyunk a Jurassic Parknak.

Simon: Ahogy én is.

Matt: . mert ha látja a Jurassic Parkot, látja a biológia erejét, tehát valóban a tevékenységünk tanúságaként, nem feltétlenül mint fő termékként, néhány évvel ezelőtt csapatunk elment a Harvard Botanikai Laboratóriumába, és talált néhány kihalt virágot. Egy kihalt virág, amely sok-sok évvel ezelőtt élt, és megszekvenálta a DNS-t, és megtalálta a DNS-nek azt a részét, amely az illatért felelős.

Valamilyen élesztőbe tettük, az élesztőt úgy alakítottuk ki, hogy terpént termeljen, ami az a vegyi anyag, amely ezt az illatot hozza, és parfümöt készítettünk belőle.

Simon: Szeretem.

Matt: Tehát van kihalt virágos parfümünk. Ez a Jurassic Park első lépcsője. Szóval ez az, ami miatt izgulunk.

Simon: Nos, a szintetikus biológia határozottan egy olyan lehetőség, amelyre odakint figyelnie kell. És úgy gondolom, hogy a Ginkgo Bioworks egy olyan cég, amelynek a radarján kell lennie. Itt van Matt McKnight, aki a Ginkgo Bioworks kereskedelmi igazgatója.