Információ

19.E: Transzkripciós szabályozás eukariótákban (gyakorlatok) - Biológia

19.E: Transzkripciós szabályozás eukariótákban (gyakorlatok) - Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

19.1 (POB) Szabályozó fehérjék általi specifikus DNS-kötés.

Egy tipikus prokarióta represszor fehérje 105-106-szoros különbséget tesz specifikus DNS-kötőhelye (operátora) és a nem specifikus DNS között. Sejtenként körülbelül tíz represszor molekula elegendő a magas szintű represszió biztosításához. Tételezzük fel, hogy egy nagyon hasonló represszor létezett egy emberi sejtben, és hasonló specifitású a kötőhelye. Hány másolatra lenne szükség a represszorból sejtenként ahhoz, hogy a prokarióta sejtben tapasztalthoz hasonló szintű elnyomást váltsunk ki? (Tipp: A E. coliA genom körülbelül 4,7 millió bázispárt, a humán haploid genom pedig körülbelül 2,4 milliárd bázispárt tartalmaz).

A következő 3 probléma megoldásához használja a következő információkat. Képzeljük el, hogy az OB gén expressziójának szabályozásának egy részét egy fehérje közvetíti, amelyet OBF1-nek nevezünk. Az OBF1-nek egy kötőhelye van az OB génben, és tételezzük fel, hogy ez az egyetlen specifikus kötőhely a haploid genomban, vagy két specifikus hely a diploid genomban. A haploid humán genom körülbelül 3 x 109 bp, vagy 6 x 109 bp diploid genomból áll. Ha feltételezzük, hogy a nukleáris DNS körülbelül 33,3%-a hozzáférhető kromatin konformációban van, ez azt jelenti, hogy körülbelül 2 x 109 bp DNS áll rendelkezésre az OBF1 nemspecifikus megkötéséhez.

19.2 Az emlős mag átmérője körülbelül 10 mm. Ha egy magot gömbként modellez, mekkora a térfogata? Mekkora a specifikus és nem specifikus kötőhelyek moláris koncentrációja a sejtmagban?

Az OBF1 specifikus és nem specifikus helyekhez való kötődését a következő egyenletek írják le.

Legyen P = OBF1

Ds = egy specifikus kötőhely a DNS-ben

Dns = egy nem specifikus kötőhely a genomi DNS-ben

P + Ds

Ks = = 1011 M-1 (2. egyenlet)

Kns = = 105 M-1 (3. egyenlet)

19.3 Az OBF1 (vagy az egyenletekben P) melyik része nem kötődik sem specifikus, sem nem specifikus helyekhez a DNS-ben?

19.4 Hány OBF1-molekulára van szükség sejtmagonként, hogy fenntartsák az adott helyek 90%-os kihasználtságát? Ez a feltétel azt jelenti

= 9

Használja a következő információkat a következő hét kérdéshez.

Az agoutigén egerekben szabályozza a pigmentek mennyiségét és eloszlását a szőrszálakban. Ennek a génnek néhány mutációja felnőttkori elhízáshoz, enyhe cukorbetegség-szerű szindrómához, tumorérzékenységhez és recesszív embrionális letalitáshoz is vezet. A gén egy előre jelzett 131 aminosavból álló fehérjét kódol, amely egy szekretált fehérje szerkezeti jellemzőivel rendelkezik, de nem ismertek feltűnő homológiát más ismert fehérjékkel. Ez a fehérje valószínűleg a melanin pigmentszintézis szabályozója, és általánosabb anyagcsere-szabályozó is lehet.

Tegyük fel, hogy vizsgálja a szabályozást a agoutigén, és képesek transzfektálni egy melanocita sejtvonalat, amely átírja a vad típust agouti gén, és egy zsírsejtvonal, amely átírja a vad típust agoutigén csak nagyon alacsony szinten. Ezenkívül már tudja, hogy a bazális promoter egy -100 és +50 közötti DNS-szegmensben található. Progresszív 5' deléciót hajt végre egy -300 és +50 közötti fragmentumból, összekapcsolja egy luciferáz riportergénnel, és a konstrukciókat melanocita és zsírsejtekbe transzfektálja, a következő eredményekkel.

19.5. Mi a következtetés a -250 és -200 közötti régióról?

19.6. Mi a következtetés a -200 és -150 közötti régióról?

19.7. Mi a következtetés a -150 és -100 közötti régióról?

Megvizsgálja a nukleáris fehérjék kötődését is ezekhez a DNS-szegmensekhez, amelyek az áramlásirányban találhatóak agoutigén. A melanocitákból származó nukleáris fehérjéket tartalmazó kivonatokat megvizsgáltuk, hogy képesek-e kötődni a fenti deléciós sorozatban körvonalazott fragmentumokhoz.

A -150 és -100 közötti fragmentumot használtuk jelölt próbaként a mobilitási eltolódási vizsgálatban. A szabad próba mobilitása az 1. sávban látható, a melanocita nukleáris kivonathoz való kötődés utáni mintázat pedig a 2. sávban látható. A 3-14. sávok a mobilitás eltolódásait mutatják be a versenytársaknak a kötési reakcióhoz való hozzáadása után; a sávok feletti háromszög azt jelzi, hogy egyre több versenyzőt használnak az egymást követő sávokban. A „Self” ugyanaz a -150 és -100 közötti fragmens, amelyet próbaként használnak, de nincs jelölve, és feleslegben van jelen a jelölt próbához képest (3-5. sáv). Egy teljesen más DNS-t (nyírt E. coli DNS) használtunk nem specifikus versenytársként (6-8. sáv). Két különböző duplex oligonukleotidot is teszteltünk, az egyik az AP1 kötőhelyét (9-11. sáv), a másik pedig az Sp1 kötőhelyét (12-14. sáv) tartalmazza. A vékonyabb, kevésbé sűrűn kitöltött dobozok kisebb intenzitású sávokat jelölnek, mint a sötétebb, vastagabb sávok. Használja ezeket az eredményeket a következő két kérdés megválaszolásához.

19.8. Mire következtet ezekből az adatokból?

19.9. A -150-től -100-ig terjedő szegmensen belül milyen szekvenciára számíthat, hogy a melanocita magokban kötődik?

19.10. A -200 és -150 közötti fragmentumot jelölt próbaként is használták a -150 és -100 közötti szegmensnél leírthoz hasonló mobilitási eltolási vizsgálatban, amint az alább látható.

Mire következtet ezekből az adatokból?

19.11. Néhány mutáns allél a agouti gén ektopikusan (azaz rossz szövetben) expresszálódik. Csak a fenti 5' deléciókra vonatkozó információkat felhasználva, melyik régió valószínűsíthető egy olyan funkcióvesztési mutáció helyére, amely ektópiás expresszióhoz vezet a zsírszövetben?

19.12 (POB) Funkcionális domének a szabályozó fehérjékben.

Egy biokémikus az élesztő GAL4 fehérje DNS-kötő doménjét lecseréli a lambda-represszor (CI) DNS-kötő doménjére, és úgy találja, hogy a módosított fehérje már nem működik transzkripciós aktivátorként (már nem szabályozza a fehérje transzkripcióját). GALoperon élesztőben). Mit lehet tenni a DNS-ben lévő GAL4-kötő hellyel, hogy a módosított fehérje működőképes legyen az aktiválásban? GALoperon átírás?

19.13 Mi az Sp1 transzkripciós faktor DNS-kötő doménje?

19.14 Mi az AP1 transzkripciós faktor dimerizációs doménje?

19.15 (ASC) Ismertessen három mechanizmust a transzkripciós faktorok aktivitásának szabályozására.

19.16 (ASC) Ön egy plazmidkészletet készített, amely egy sor nukleotid inszerciót tartalmaz a glükokortikoid-receptor gén hossza mentén. Minden inszerció három vagy négy aminosavat kódol. A különböző inszerciók térképi pozíciói a receptorgén kódoló szekvenciájában a következők:

0 Glükokortikoid-receptor kódoló szekvencia 783

| |

| |

| |

Beillesztés: A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S

A receptor gént tartalmazó plazmidok funkcionálisan expresszálhatók CV-1 és COS sejtekben, amelyek szteroid-reszponzív gént tartalmaznak. Ezeknek a sejteknek a segítségével meghatározhatja, hogy a receptorban ezek a beépülések milyen hatással vannak a szteroidokra reagáló gén indukciójára és a szintetikus szteroid dexametazon kötődésére. Ezen elemzések eredményeit az alábbi táblázat foglalja össze.

Beillesztés Indukció Dexametazon kötés

A ++++ ++++

B ++++ ++++

C ++++ ++++

D 0 ++++

E 0 ++++

F 0 ++++

G ++++ ++++

H ++++ ++++

Én + ++++

J ++++ ++++

K 0 ++++

L 0 ++++

M 0 ++++

N + ++++

O ++++ ++++

P ++++ ++++

Q 0 0

R 0 0

S 0 0

vad típusú ++++ ++++

a) Ebből az elemzésből hány különböző funkcionális doménje van a glükokortikoid receptornak? Adja meg ezen tartományok helyzetét a beillesztési térképhez képest.

b) Melyik tartomány a szteroidkötő tartomány?

c) Hogyan határozhatta meg, hogy a domének közül melyik a DNS-kötő domén?


A kikövetkeztetett szabályozó és a rekonstruált metabolikus hálózatok kombinálása javítja a fenotípus előrejelzését élesztőben

Kapcsolatok A fejlődési és neuropszichiátriai rendellenességek genetikai laboratóriuma (Oktatási Minisztérium), Bio-X Intézetek, Shanghai Jiao Tong Egyetem, Sanghaj, Kína, Élettudományi és Biotechnológiai Iskola, Shanghai Jiao Tong Egyetem, Sanghaj, Kína, Rendszerek Intézete Biológia, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Biostatisztikai Tanszék, University of Washington, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois, Urbana-Champaign, Illinois, Egyesült Államok Amerika

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Biológiai és Mikrobiológiai Tanszék, valamint Molekuláris és Sejtbiológiai Program, Washingtoni Egyetem, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, California, Egyesült Államok Amerika államai

Affiliations Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok, Center for Infectious Disease Research, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok

Affiliation Institute for Systems Biology, Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok


Absztrakt

Az eukarióta transzkriptumok alternatív splicingje egy olyan mechanizmus, amely lehetővé teszi a sejtek számára, hogy korlátozott számú génből hatalmas fehérjediverzitást hozzanak létre. Az egyes átiratok alternatív splicingjének mechanizmusai és eredményei viszonylag jól ismertek, és a közelmúltban tett erőfeszítések az illesztési hálózatok tanulmányozására irányultak. Nyilvánvalóvá vált, hogy az összehangolt splicing hálózatok szabályozzák a szövetek és szervek fejlődését, és az alternatív splicing fontos élettani funkciókat tölt be az ember különböző fejlődési folyamataiban.


Eredmények

SARS-CoV-2 RdRp visszamenőleges komplexek Cryo-EM-hez.

Korábban DdRp backtracked komplexeket (BTC) állítottak elő szerkezeti vizsgálatokhoz a DdRp közvetlen inkubálásával olyan DNS-RNS vázzal, amely az RNS 3′ végén nem illő nukleotidokat tartalmazott (27, 28, 30), ezek a BTC vázak kötődnek a Watson-Crick downstream Watson-Crick-hez. az RNS-DNS hibrid bázispárjai, amelyek a DdRp aktív helyén helyezkednek el, és a nem illeszkedő RNS egyszálú 3′ szegmense, amely kinyomja a DdRp NTP belépési alagútját. Az RdRp BTC-k tanulmányozásához ezért RNS-állványokat terveztünk és teszteltünk az eredeti SARS-CoV-2 RTC vázon alapuló, de három vagy öt nem illeszkedő citozin nukleotiddal a termék RNS (p-RNS) 3'-végéhez (BTC)3 és BTC5 állványok 1. ábraA). Az egymást követő eltérések a p-RNS ​​3′ végén úgy lettek kialakítva, hogy stabil, homogén BTC-ket hozzanak létre a biokémiai és szerkezeti elemzéshez – nem állítjuk, hogy az egymást követő eltérések biológiailag relevánsak lennének.

SARS-CoV-2 backtrack komplexum. (A) RNS állványok: (Top) RTC állvány (14) (Alsó) hátrácsos komplex állványok (BTC3 és BTC5). (B) Egy natív gél elektroforetikus mobilitás-eltolódási vizsgálat azt mutatja, hogy a holo-RdRp nsp13-at (ADP-AlF) igényel3), hogy hatékonyan megkösse a BTC állványokat. (C) SARS-CoV-2 BTC-k krio-EM szerkezetei. Az átlátszó krio-EM sűrűség [helyi felbontású szűrt (47)] látható a finomított modellekkel egymásra helyezve (SI függelék, S1 táblázat). A modellek és a sűrűség a kulcsnak megfelelően színezett. Két fő BTC-t figyeltek meg (SI függelék, S2 ábra), az egyik egy nsp13 protomert tartalmaz (nsp131-BTC5), az egyik pedig két nsp13 promotert (nsp132-BTC5). Megjelöljük az nsp13 promotert, amely mind az nsp13.1, mind a másik nsp13.2 struktúrában közös (14). A cián gömbök az egyszálú t-RNS 5′ szakaszának útját jelölik, amelyek közül néhány mindkét struktúrában kapcsolódik az nsp13.1-hez.

A natív elektroforetikus mobilitáseltolódási vizsgálatok kimutatták, hogy bár a holo-RdRp (nsp7/nsp82/nsp12) kötötte az RTC vázat, amint azt korábban megfigyeltük (1. ábra).B, 1. sáv, SI függelék, S1 ábraA, és ref. 14. ábra), nsp13-ra volt szükség a BTC állványokhoz való hatékony kötődéshez (1. ábra).B). Stabil nsp13-holo-RdRp komplexeket BTC állványokkal is megfigyeltünk natív tömegspektrometriával (SI függelék, S1 ábra B és C).

A modellezés azt sugallta, hogy a p-RNS ​​3′ végén lévő, visszafelé ívelt egyszálú RNS körülbelül öt nukleotidja elegendő lenne az RdRp NTP belépési alagútjának áthaladásához. Ezért a SARS-CoV-2 BTC szerkezeti felépítésének meghatározásához összeállítottuk az nsp13(ADP-AlF)3) és holo-RdRp a BTC-vel5 állványzat (1. ábraA a továbbiakban BTC5), és a mintákat egyrészecskés krio-EM-el elemezték. A minta két fő osztályból állt: nsp131-BTC5 (3,4-Å névleges felbontás) és nsp132-BTC5 (3,6 Å 1. ábraC és SI függelék, Fig. S2 és S3). A két finomított szerkezet elemzése azt mutatta, hogy az egyes struktúrák RdRp része lényegében azonos volt (927 nsp12 α-szén pozíció rmsd <0,3 Å SI függelék, S2 táblázat), míg a közös nsp13 protomer (nsp13.1) elhelyezkedése eltérő volt (590 nsp13 α-szén pozíció rmsd >8 Å SI függelék, S2 táblázat). Az nsp13 alegységek szerkezeti heterogenitásának kiküszöbölése és a BTC nagyobb felbontású képének elérése érdekében mindkét osztály részecskéit kombinálták és lokálisan finomították a holo-RdRp és az RNS köré felvitt maszkban (kivéve az nsp13 alegységeket), ami a BTC5(helyi) kombinált térkép (3,2 Å 1. ábraC és SI függelék, Fig. S2 és S3, valamint az S1 táblázat).

A krio-EM térképek (1. ábraC és 2) két szignifikáns különbséget tártak fel az nsp13-RTC struktúrákkal (14): 1) Az nsp13.1-hez kapcsolódó egyszálú downstream templát RNS (t-RNS) feloldódott (2. ábra).A), és 2) egy egyszálú p-RNS ​​3′ szegmenst extrudáltunk az RdRp NTP belépési alagútba (2. ábra).B).

Cryo-EM sűrűségtérképek. (A, Bal) Az nsp13 átfogó képe2-BTC5. Az Nsp13.2 eltávolítva (körvonal) az egyértelműség kedvéért. A bekeretezett terület a jobb oldalon ki van nagyítva. (A, Jobb) Az nsp13.1 helikáz alegységbe zárt t-RNS szegmens (+14-5′-CCCAUGU-3′-+8) nagyított képe. A krio-EM sűrűségtérkép (az nsp132-BTC szerkezet) látható (kék háló). (B, Bal) A BTC átfogó képe5(helyi) szerkezet. A bekeretezett terület a jobb oldalon ki van nagyítva. (B, Jobb) Az RdRp aktív helye körüli régió nagyított képe, a t-RNS-t (cián) és a p-RNS-t (piros) mutatja a visszafelé ívelt RNS-szegmenssel. Az RNS krio-EM sűrűségtérképe [a BTC-ből5(helyi)] látható (kék háló). (C) BTC5(lokális) krio-EM denzitástérképek az nsp12 konzervált F, C és E motívumai körül. A kiválasztott aminosavakat jelöljük.

Az Nsp13 megköti a downstream egyszálú t-RNS-t.

Az nsp13-ban1-BTC5 és nsp132-BTC5 krio-EM térképeken a t-RNS egyszálú 5′ szegmense az nsp13.1-gyel kapcsolódott. A krio-EM sűrűségnek ez a tartománya jól feloldódott (2. ábra).A), lehetővé téve a helikázon belüli t-RNS szegmens azonosítását +14 és +8 között (a számozást az 1.A), 5′ CCCAUGU 3′ . A t-RNS-t a helikáz és az RdRp között összekötő öt nukleotidból álló szegmens (+7-től +3-ig) rendezetlen volt, és nem modellezett.

A SARS-CoV-2 RdRp NTP belépési alagút a visszafelé haladt RNS-t tartalmazza.

A krio-EM térképek a BTC egyszálú p-RNS ​​3′ szegmensét is feloldották.5 állvány extrudálása az RdRp NTP belépési alagútba (2. ábraB), amely megerősíti a BTC kialakulását (3. ábra).A). A SARS-CoV-2 BTC általános architektúrája analóg a DdRp BTC-kkel (3. ábra és 14. hivatkozás). A DdRp hídspirál (BH) (35) elválasztja a DdRp aktív helyet egy csatornába a downstream templát DNS számára (a BH teteje felett, 3. ábra).B) és az NTP belépési alagút (a BH alatt, 3. ábraB). Hasonlóképpen, a vírus RdRp motívuma F (SI függelék, S4 ábraA és ref. 32) a visszafelé ívelt RNS szálelválasztó szerkezeti elemeként szolgál (3. ábra).A). A downstream t-RNS áthalad az F motívum tetején, míg a visszafelé haladó RNS az F motívum alatti NTP belépési alagutat extrudálja (3. ábra).A).

SARS-CoV-2 RdRp és DdRp BTC-k. (A és B) SARS-CoV-2 RdRp (A) és DdRp (B) BTC-k. (Top) A fehérjék átlátszó molekulafelületek, a nukleinsavak pedig atomgömbökként jelennek meg. A bekeretezett területek alul nagyítva láthatók. (Alsó) Nagyított, keresztmetszeti nézet. A fehérjéket molekulafelületként, a nukleinsavakat pedig pálcika formátumban, átlátszó molekulafelülettel ábrázolják. (A) A SARS-CoV-2 BTC5(helyi). Az Nsp8a és nsp12 látható (az nsp7 és nsp8b az egyértelműség kedvéért eltávolítva). Az Nsp12 F motívum magenta gerincszalagként jelenik meg (Top). Visszahúzott RNS (a BTC +1C-től +3C-ig5-állvány 1. ábraA) kinyomja az NTP bemeneti alagutat. (B) A DdRp (Saccharomyces cerevisiae Pol II) BTC [Protein Data Bank (PDB) ID code 3PO2 (29)]. A BH magenta gerincszalagként látható. A visszahúzódó RNS kinyomja az NTP belépési alagutat/másodlagos csatornát/tölcsért. (C) Kilátás kívülről a SARS-CoV-2 NTP belépési alagútjaiba (Bal) és egy S. cerevisiae DdRp [PDB azonosító kód 3GTP (27)] BTC. A fehérjefelületeket az elektrosztatikus felületi potenciál színezi [APBS-sel (48) számítva]. A visszahúzódó RNS sárga szénatomokat tartalmazó atomi gömbökként látható.

Az RdRp NTP belépési alagút olyan sztérikus és elektrosztatikus környezetet biztosít, amely elősegíti a visszacsatolt RNS kicsatornázását az aktív helyről anélkül, hogy specifikus poláris fehérje-RNS kölcsönhatások lépnének fel, amelyek akadályozhatnák az RNS mozgását (3. ábra).C és 4). A SARS-CoV-2 RdRp NTP belépési alagútjainak elektrosztatikus felületi potenciáljának összehasonlítása eukarióta és bakteriális DdRp-ekkel hasonló általános elektrosztatikus felületi környezetet mutat, amely elősegítheti az RNS visszalépését (3. ábra).C és SI függelék, S4 ábraB), beleértve az F motívum konzervált pozitív töltésű Arg és Lys maradékainak „nyomát” (SARS-CoV-2 nsp12 K545, K551, R553 és R555, 4. ábra és SI függelék, S4 ábraA). Az RdRp C és E motívumainak konzervált maradványai kiegészítik az aktív hely/NTP belépési alagút környezetét, amely körülveszi a visszahúzódó RNS-t (4. ábra és SI függelék, S4 ábraA).

Fehérje-RNS kölcsönhatások a BTC-ben. (A, Top) A BTC átfogó képe5(helyi). A fehérjék átlátszó molekuláris felületek, a nukleinsavak pedig atomgömbökként jelennek meg. Az Nsp8a és nsp12 látható (az nsp7 és nsp8b az egyértelműség kedvéért eltávolítva). Az Nsp12 C, E és F motívumok gerincszalagként jelennek meg (az alsó gombnak megfelelően színezve). A bekeretezett terület alább nagyítva látható. (A, Alsó) Az RNS -2 és +3 között látható. A fehérjék átlátszó molekuláris felületekként jelennek meg. A C, E és F RdRp motívumok átlátszó gerincszalagokként (a kulcsnak megfelelően színezve) láthatók, oldalláncokkal, amelyek megközelítik a visszafelé ívelt RNS-t (≤ 4,5 Å). (B) A vázlat ugyanazokat a fehérje-RNS kölcsönhatásokat szemlélteti, mint A. Nucplot (49) segítségével rajzolva.

Az nsp13-RTC-kben az RTC állvány (1. ábra).A) poszttranszlokált állapotban kötődik (14) a 3' p-RNS ​​A bázispárosodik a t-RNS U-hoz a -1 helyen a katalitikus nsp12-D760 közelében (5. ábra).A). A következő t-RNS-bázis (A +1-nél) úgy van elhelyezve, hogy fogadja a bejövő NTP-szubsztrátot, de a bejövő NTP-szubsztrát helye üres (5. ábra).A). Ezzel szemben a BTC struktúrák egy bázispárral transzlokálódtak, összehasonlítva az RTC-kkel, amely az A–U Watson–Crick bázispárnak felel meg a p-RNS ​​3′ végén (az RTC-k -1 helyén található). ) a BTC-k -2 pozíciójában volt (1. ábra).A, 4 és 5B). A BTC -1 pozícióját az első C-A eltérés foglalta el, a p-RNS ​​-1C nem-Watson-Crick hidrogénkötést hozott létre az ellentétes t-RNS A-val (4. és 5. ábra).B). A következő három nem illeszkedő p-RNS ​​nukleotid (+1C, +2C és +3C) az NTP belépési alagútjába húzódott (4. és 5. ábra).B). A BTC 3′ nukleotidja5 scaffold p-RNS ​​(+4C 1. ábraA) oldószernek volt kitéve az NTP belépési alagút kifelé néző végén, és nem volt sűrű, ezért nem modellezték (2. ábra).B). A +1/+2 pozíciókban a visszafelé ívelt nukleotidok pályája élesen meghajlott az F motívum maradékainak térbeli korlátai miatt (4. ábra).A).

Az aktív hely proximális RNS összehasonlítása az RTC és BTC struktúrákban, valamint a p-RNS ​​3′ végén egy nem illesztett nukleotid szimulációjából. (A és B) Az aktív hely proximális RNS összehasonlítása az RTC-ben [A EKT azonosító kód 6XEZ (14)], BTC5(helyi) (B), valamint egy -1U + 1C komplex molekuladinamikai szimulációinak kiválasztott pillanatképeiből (C). A vázlatok az RTC összefüggésében látható nukleotidokat jelölik (A) és a BTC5 állványok (B ábrán látható teljes állványsorozatokA) vagy a BTC-ből generált5 állvány a szimulációkhoz (C). A t-RNS szénatomjai cián színűek, a p-RNS ​​pedig lazac színű, kivéve a 3′ végén lévő nem illeszkedő Cs-t, amely sötétvörös színű. A Watson–Crick bázispárosító hidrogénkötéseket sötétszürke szaggatott vonalként, a többi hidrogénkötést pedig piros szaggatott vonalként jelöljük. Az Nsp12 C motívum sárga-narancssárga gerincszalagként, a D760 oldallánca pedig atomi gömbökként látható. (A) Az RTC poszttranszlokált állapotban van, az A–U bázispár a p-RNS ​​3′ végén a –1 pozícióban van (14). (B) A BTC5A (lokális) RNS áthelyeződik az RTC-hez képest, az RTC RNS 3′ végén lévő A–U-nak megfelelő bázispár a –1 pozícióban a BTC RNS –2 pozíciójában van. A C–A eltérés a BTC −1 helyet foglalja el. A +1, +2 és +3 nem illeszkedő Cs nyomvonal az RdRp NTP belépési alagútjába vezet (fekete kanyargós vonalak jelölik). A +4C (jelenleg a BTC-ben5 állvány 1. ábraA) oldószer hatásának van kitéve, rendezetlen és nem modellezett. (C) Az nsp13 molekuladinamikai szimulációi2– BTC−1U+1C összetett. A komplexet három ismétléssel (zöld, kék és narancssárga nyomok) szimulálták. Az idő függvényében ábrázolt Rmsd értékek a p-RNS ​​+1C nehézatom rmsd-jét jelentik a kiindulási konfigurációhoz képest (Anyagok és metódusok). Az rmsd hisztogramok (jobb oldalon ábrázolva) mindhárom ismétlés aggregátumai. Két, az egyik szimulációból vett szerkezet látható, az egyik a p-RNS ​​+1C-jét mutatja az aktív helyen (t = 0 μs), a másik pedig az NTP belépési alagútba bekopott +1C-t mutatja (t = 4,5 μs).

Az Nsp13 serkenti a visszalépést.

A SARS-CoV-2 vad típusú holo-RdRp-hez az nsp13 helikázra volt szükség ahhoz, hogy hatékonyan megkösse a BTC állványokat (1. ábra).B). Megfigyeltük azonban, hogy az egyetlen aminosav szubsztitúcióval (D760A) rendelkező nsp12-t tartalmazó holo-RdRp-hez nem volt szükség nsp13-ra a BTC-vázak megkötéséhez (SI függelék, S1 ábraA, 4. sáv). Az Nsp12-D760 az RdRp C-motívum konzervált maradéka, amely egy döntő fontosságú Mg 2+ iont kelátot képez katalitikus komplexekben (SI függelék, S4 ábraA és ref. 32), de a szubsztrátot nem tartalmazó RdRp struktúrákban (beleértve a BTC szerkezeteket is) a Mg 2+ ionok hiányoznak (14, 36, 37). A DdRps katalitikus Asp-maradékai jellemzően szubsztrát hiányában is kelátizálják a Mg 2+ iont (31, 38), és ez a Mg 2+ megmarad a DdRp visszahúzódó struktúrákban (27 ⇓ ⇓ –30). RdRp BTC struktúráink azt sugallják, hogy Mg 2+ ion hiányában a D760 elektrosztatikus gátat képez a visszahúzódó RNS foszfát gerince előtt (5. ábra).B).

A SARS-CoV-2 BTC-k szerkezeti vizsgálatokhoz való előállításához a BTC-t használtuk5 állvány öt nem illeszkedő C-vel a p-RNS ​​3′ végén (1. ábraA). A SARS-CoV-2 BTC-k RTC-állványból (teljesen Watson-Crick bázispáros p-RNS ​​3'-vége) történő képződésének tanulmányozásához elemeztük az ultraibolya (UV) által indukált térhálósodást az utolsó előtti 4-tio-U-ból. a p-RNS ​​3'-végéhez [RTC(4-thio-U)-scaffold SI függelék, S5 ábraA és ref. 39]. A keresztkötés abszolút függött a 4-tio-U jelenlététől az RNS-ben, ami meghatározta a specifitást (SI függelék, S5 ábraB). A vad típusú nsp12-vel és az RTC(4-thio-U) vázzal összeállított RTC-k gyenge nsp12-RNS-keresztkötést eredményeztek UV-sugárzás hatására.SI függelék, S5 ábraA, 1. sáv). Ezek a körülmények kedveznek egy poszttranszlokált RTC-nek (14, 36, 37), ahol a 4-tio-U az RNS-RNS hibridben meg van kötve, és így nem áll rendelkezésre a fehérje-RNS keresztkötésekhez. A p-RNS ​​és az nsp12 keresztkötése jelentősen megnőtt az nsp13 és 2 mM adenozin-5'-trifoszfát (ATP) hozzáadásával.SI függelék, S5 ábraA, 2. sáv). Ilyen körülmények között azt javasoljuk, hogy az nsp13 transzlokációs aktivitása visszahúzza a komplexek egy részét, felszabadítva a 4-tio-U-t az RNS-RNS hibridből az nsp12-vel való keresztkötéshez. A keresztkötés nsp13 jelenlétében, de ATP hiányában csökkentette az nsp12 keresztkötését (SI függelék, S5 ábraA, 7. sáv versus 2. sáv), támogatva azt a javaslatot, hogy az nsp13 transzlokációs tevékenység megkönnyíti a visszalépést. A vad típusú nsp12 lecserélése nsp12-D760A-ra (nsp12* SI függelék, S5 ábraA, 4–6, 9 és 10 sáv), amely hajlamosabb a visszalépésre (SI függelék, S1 ábraA), ugyanazokat a tendenciákat mutatta, de megnövekedett UV-függő nsp12-RNS keresztkötéssel, a maximális keresztkötés olyan körülmények között megy végbe, amelyek várhatóan a leginkább kedveznek a visszalépésnek (SI függelék, S5 ábraA, 5. sáv). Ezek az eredmények megerősítik azt a nézetet, hogy az nsp13 elősegíti a SARS-CoV-2 RdRp visszalépését.

Egy nem illeszkedő nukleotid a p-RNS ​​3′ végén spontán megtörik, és belép az RdRp NTP belépési alagútjába.

A SARS-CoV-2 RTC egy nagy feldolgozási képességű és gyors replikáz/transzkriptáz, amely körülbelül 1 kb-os RNS-templátot képes replikálni, átlagosan körülbelül 170 nt/s sebességgel (40). Más vírusos RdRp-k tanulmányozása azonban azt sugallja, hogy a téves beépülés lassítja a teljes megnyúlási sebességet, és visszalépést indukálhat (41 ⇓ –43). Molekuláris dinamikai szimulációkat használtunk a p-RNS ​​3′ végén beépült, össze nem illő nukleotid sorsának felderítésére. Az nsp13-mal kezdve2-BTC5 szerkezetében a −1C-t U-ra mutáltuk, és a +2-től +4-ig terjedő C-ket eltávolítottuk. Az eredményül kapott előtranszlokált p-RNS-nek volt egy egyező -1U és egy nem egyező +1C-je (-1U + 1C 5. ábra).C). Három 5 μs szimulációban megfigyeltük, hogy a 3′-nem illeszkedő +1C két pozíció között váltakozik, vagy az aktív hely közelében marad (rmsd <3,5 Å), vagy elszakad a p-RNS:t-RNS hibridtől a felé. vagy az NTP belépési alagútba (rmsd >3,5 Å 5. ábraC). Az összesített -1U + 1C szimulációk elemzése alapján az össze nem illő +1C az idő körülbelül 40%-át az aktív hely közelében töltötte, és az idő körülbelül 60%-át az NTP belépési alagút felé vagy az alagútban. A teljesen illeszkedő p-RNS ​​3′-végével (-1U + 1U) végzett kontrollszimulációk során a p-RNS ​​3′-végén lévő egyező +1U nem kopott, és az idő 100%-át az aktív hely zsebében töltötte (SI függelék, S6 ábra).

A BTC -36 - +14 nukleotidjai5 scaffold t-RNS (az 1. ábrán meghatározottak szerint).A) szerepeltek a szimulációkban. Az nsp13.1-hez kötött (+8-tól +14-ig) és az nsp12-höz kötött (-36-tól +2-ig) régiók stabilak voltak a szimulációs idő alatt. A +3 és +7 közötti t-RNS nukleotidok (az nsp12-hez és az nsp13.1-hez kötött t-RNS-t összekötő rész) nagyon dinamikusak voltak, ami összhangban van a jól meghatározott krio-EM sűrűség hiányával a t ezen régiójában. -RNS. Megjegyezzük, hogy a szimulációk tájékoztatnak a kopott RNS-ek útjáról, de nem az nsp13 szerepéről a visszalépésben.


E-4. Modul alapú összehasonlító génexpressziós elemzés: evolúciósan konzervált koexpresszió Bacillus subtilisben és Escherichia coliban

Zarrineh P XE "Zarrineh P" (1,*), Fierro C XE "Fierro C" (2), Sánchez-Rodríguez A XE "Sánchez-Rodríguez A" (2), De Moor B XE "De Moor B" " (1), Marchal K Xal 2)

Egyre nagyobb léptékű expressziós kompendiumok válnak elérhetővé a különböző fajokhoz. A koexpressziós hálózat modularitásának kihasználásával ezek a kompendiumok felhasználhatók olyan útvonalak vagy folyamatok azonosítására, amelyek esetében az expressziós viselkedés konzervált a különböző fajok között. A fajok közötti modulhálózatok összehasonlítása azonban nem triviális, mivel a biológiailag igaz modul meghatározása nem fix, hanem a távolsági küszöbtől függ, amely meghatározza a modulokkal való koexpresszió mértékét.

Anyagok és metódusok

Kifejlesztettünk egy fajok közötti cocluster megközelítést, a COMODO-t (CONserved MODules across Organisms). A COMODO bemeneti microarray-adatokat és homológialeképezést használ a gének között, és konzervált modulok kimeneti párjaként szolgál. A COMODO konzervált koexpressziós modulokat keres heterogén microarray expressziós kompendiákban. A modulok méretét úgy választják meg, hogy maximalizálják a két modult összekapcsoló ortológok számát az egyes modulokban lévő gének teljes számához képest, amelyek hozzájárulnak egy konzervált modulpárhoz.

Eredmények

Módszertanunkat az Escherichia coli és a Bacillus subtilis közötti koexpressziós konzerváció vizsgálatára alkalmaztuk. Számos olyan útvonalat és folyamatot azonosítottunk, amelyek esetében a transzkripciós koexpresszió megmaradt a két prokarióta szervezetet elválasztó hosszú evolúciós távolságon keresztül. Ahogy az várható volt, az operonok az egyik fő mechanizmusnak tűntek a gének közötti koexpressziós viselkedés garantálására, nem csak egy fajon belül, hanem a fajok között is. A gének transzkripciós koregulációjának mechanizmusa sokkal kevésbé konzerváltnak tűnt, mint maga a koexpressziós viselkedésük.

Vita

Kidolgoztunk egy módszert két faj közötti konzervált modulok keresésére. Ennek a módszernek az alkalmazása lehetővé tette mindkét olyan folyamat kimutatását, amelyek expressziós viselkedése konzervált az E. colit a B. subtilistől elválasztó széles evolúciós távolságon keresztül, vagy ahol a folyamatok alrészei expressziójukban különböznek. A kétirányú reciproka legjobb ütési találatának használata lehetőséget kínál funkcionálisan igaz ortológiai összefüggések keresésére.

Peyman Zarrineh (Ez az e-mail cím a spamrobotok elleni védelem alatt áll. Engedélyezze a Javascript használatát, hogy megtekinthesse.)

Katholieke Universiteit Leuven

Szerzői kapcsolatok

(1) Elektrotechnikai Tanszék, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 10, 3001 Leuven, Belgium. (2) Department of Microbial and Molecular Systems, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 20, 3001 Leuven, Belgium.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a következők támogatják: 1) KUL: GOA AMBioRICS, GOA/08/011, CoE EF/05/007, SymBioSys CREA/08/023 2) IWT: SBO-BioFrame 3) IUAP P6/25 (BioMaGNet) 4) FWO IOK-B9725-G.0329.09 5) ZKB8933/CREA/08/023/ BOF, 6) HFSP-RGY0079/2007C.


Következtetés

A kutatás a transzkriptum egészére kiterjedő, teljes hosszúságú izoformáit szolgáltatta P.americana és P.icosandra, amely betekintést nyújt az invazív sikerbe P.americana. További ajánlásokat fogalmaztak meg a megfelelő referenciagének kiválasztásához egy növényfaj különböző szöveteiben vagy változatos növényfajok között. Különböző kísérleti körülmények között egyetlen gén sem expresszálódott folyamatosan, ami a referenciagén azonosításának szükségességét jelzi. Ezek az eredmények megkönnyítenék a Phytolaccaceae-ben végzett funkcionális és összehasonlító genomikai vizsgálatok feltárását a növénybiológia jobb megértése érdekében.


Anyagok és metódusok

Reagensek és eszközök táblázat

Reagens/Forrás Hivatkozás vagy forrás Azonosító vagy katalógusszám
Kísérleti modellek
C57BL/6J (M. musculus) Charles folyó C57BL/6J
C57BL/6J (M. musculus) Nfil3 −/− van der Kallen et al ( 2015 ) N/A
AML12 sejtek (M. musculus) ATCC CRL-2254
HEK293 (H. sapiens) ATCC CRL-1573
Rekombináns DNS
pcDNA3.1-mNFIL3 Addgene Cat # 34572
pSGG5-hHNF4A Suaud et al ( 1999 ) N/A
Antitestek
példa: Nyúl-anti-H3 Abcam Cat # ab1791
ACTB Sigma-Aldrich Cat # A5441 (WB)
BRD4 Bethyl Labs Cat # A301-985A100 (ChIP)
BRD4 Wu et al ( 2006 ) N/A (WB)
DDIT3 Santa Cruz Cat # sc7351 (WB)
FOXA2 Abcam Cat # ab23630 (WB, WES)
Hiszton H3 Cell Signaling CST 3638S (WB)
H3K27ac Aktív motívum Cat # 39685 (ChIP)
HNF4A Perseus Cat # PP-H1415-00 (WB, WES)
LMNA Santa Cruz Cat # sc20681 (WB, WES)
NFIL3 Cell Signaling Cat # CST 14312S (WB)
NR1H4 Perseus Cat # PP-A9033A-00 (WB)
p-Y416-SRC Cell Signaling Cat # CST 6943S (WB)
SRC Cell Signaling Cat # CST 2109S (WB)
XBP1-ek Cell Signaling Cat # CST 12782S (WES)
TFIIB Santa Cruz Cat # sc7225 (WB)
EP300 Aktív motívum Cat #61401 (IP)
EP300 Santa Cruz Cat # sc-585 (WES)
IgG Santa Cruz Cat # sc-2025 (IP)
HRP-konjugált anti-egér Sigma-Aldrich Cat # A4416 (WB)
HRP-konjugált anti-nyúl Sigma-Aldrich Cat # A0545 (WB)
12–230 kDa Wes elválasztó modul ProteinSimple Cat# SM-W004
66–440 kDa Jess vagy Wes elválasztó modul ProteinSimple Cat # SM-W008
Oligonukleotidok és szekvencia alapú reagensek
qPCR primerek Ez a tanulmány EV5 táblázat
Vegyszerek, enzimek és egyéb reagensek
példa: T7 endonukleáz I New England Biolabs Cat # M03020S
Thapsigargin Sigma-Aldrich Cat # T9033
Tunicamycin Sigma-Aldrich Cat # T7765
MG132 Sigma-Aldrich Cat # M7449
PP2 Sigma-Aldrich Cat # P0042
Cikloheximid Sigma-Aldrich Cat # C7698
JQ1 Sigma-Aldrich Macskaszám: SML1524
Trichostatin A Sigma-Aldrich Cat # T8552
C646 Sigma-Aldrich Macskaszám: SML0002
MZ1 Tocris Cat # 6154
TUDCA Sigma-Aldrich Cat # T0266
PBA Sigma-Aldrich Cat # SML0309
STF083010 Sigma-Aldrich Macskaszám: SML0409
ISRIB Sigma-Aldrich Macskaszám: SML0843
AEBSF Euromedex Cat # 50985
jetPEI Polyplus transzfekció Cat # 101-40
Nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet Alkalmazott biorendszerek Macskaszám: 4368813
Brilliant II Sybr Green QPCR MAster mix Agilent biotechnológiák Cat # 600831
Diszukcinimidil-glutarát (DSG) Thermo Fischer Scientific Cat # 20593
Formaldehid Sigma-Aldrich Cat# F8775
benzonáz Sigma-Aldrich Cat# E1014
Protein A Sepharose GE Healthcare Cat # GE17-1279-01
Protein G Sepharose GE Healthcare Cat # GE17-0618-01
Komplett proteáz inhibitor koktél Roche Macskaszám: 11836145001
Foszfatáz inhibitor koktél Sigma-Aldrich Cat # P044
Proteináz K Qiagen Macska # 19133
tRNS Sigma-Aldrich Cat # R5636
William's medium (MPH) Lonza Cat# BE12761F
DMEM/F12 (AML12) holland Cat # P04-41250
DMEM (HEK293) Gibco-Life Technologies Macska #31966
Kollagén Roche Cat# 11179179001
Kollagenáz Sigma-Aldrich Cat # C5138
Élesztő tRNS Sigma-Aldrich Cat # R5636
Minden kivonat (Trizol) Eurobio GEXEXT04-0U
Szoftver
Partek Genomics Suite 6.6 Partek N/A
DESeq 1.26.0 Anders és Huber (2010) N/A
FactoMineR 1.41 et al ( 2008 ) N/A
STEM v1.3.11 Ernst et al ( 2005 ) N/A
ÓRIÁS Vandel et al ( 2018 ) N/A
Galaxy afgán et al ( 2018 ) N/A
R R Core Team (2015) N/A
aplpack v1.3.2 R csomag R Core Team (2015) N/A
ToppGene Suite Chen et al ( 2009 ) N/A
GSEA v3.0 Subramanian et al ( 2005 ) N/A
BubbleGUM v1.3.19 Spinelli et al ( 2015 ) N/A
csokornyakkendő 2 Langmead és Salzberg (2012) N/A
Integrált genomböngésző (IGB 9.0.1) Freese et al ( 2016 ) N/A
MACS2 Chen et al ( 2015 ) N/A
A szuperfokozók rangsorolása (ROSE) Szeretett et al (2013), Whyte et al ( 2013 ) N/A
csaw v1.6.1 Lun és Smyth (2014, 2016) N/A
Lokuszátfedés-elemzés (LOLA 1.4.0) Sheffield és Bock (2016) N/A
gplots v3.0.1 Warnes et al ( 2016 ) N/A
grafikus R csomag R Core Team (2015) N/A
Prism v5 és 8 GraphPad N/A
GeneSnap v7.12.06 Syngene N/A
Image Studio Lite v5.2 LI-COR Biosciences N/A
Iránytű ProteinSimple N/A
bioDBnet Mudunuri et al ( 2009 ) N/A
Egyéb
Beáramló válogató Becton Dickinson N/A
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent biotechnológiák N/A
MoGene-2_0-st Affymetrix N/A
GeneChip™ Scanner 3000 7G Alkalmazott biorendszerek Cat# 00-0210
GeneChip™ Fluidics Station 450 Alkalmazott biorendszerek Cat# 00-0079
Bioruptor Pico Diagenode Cat# B01060010
MinElute PCR tisztító készlet Qiagen Cat# 2800
ALT aktivitás Thermo Fischer Scientific Cat# 981769
AST aktivitás Thermo Fischer Scientific Cat# 981771
KONELAB 20 Thermo Fischer Scientific Cat# 981801
Illumina Hi-seq 4000 Illumina N/A
G-box Syngene N/A
Egyszerű nyugati, WES rendszer ProteinSimple N/A
TnT® Quick Coupled Transzkripciós/fordító rendszer Promega Cat# L5020
iBright™ CL1500 képalkotó rendszer Thermo Fischer Scientific A44240

Módszerek és protokollok

Sejttenyésztés

Az immortalizált AML12 egér hepatocita sejtvonalat az ATCC-től szereztük be (CRL-2254), és a korábban leírtak szerint tenyésztettük (Ploton). et al, 2018). Egér primer hepatocitákat (MPH) állítottunk elő 10 hetes hím C57BL/6J egerek (Charles River) májából a Bantubungi által leírtak szerint. et al (2014) és kollagénnel bevont lemezeken szérummentes William's táptalajban (Ploton) nevelték et al, 2018). Ugyanabból a májból nem parenchimális sejteket (NPC) nyertünk differenciális centrifugálással. Röviden, a perfúzió után kapott májhomogenizátumokat 70 μm-es sejtszűrőn préseltük át, és 5 percig 27 °C-on centrifugáltuk. g. Az első centrifugálásból származó pelleteket mostuk, és ismét kétszer centrifugáltuk 5 percig 27 °C-on g hogy megkapjuk az MPH-frakciót. Az első centrifugálás felülúszóit összegyűjtöttük, és 5 percig 400 °C-on centrifugáltuk g hogy megkapjuk az NPC-törtet. Az MPH és az NPC elválasztását a kiválasztott markergének expressziójának monitorozásával igazoltuk (Fig. S2D ábra). Az akut endoplazmatikus retikulum stressz (ERS) kezelés MPH-ban 4 órás kezelést jelent 1 μM thapsigarginnal. Kontrollként vivőanyagot (0,04% DMSO) használtunk. Ennek a tanulmánynak az összes ábráján az ERS-t MPH-ban 4 órás kezelésként definiáljuk 1 μM thapsigarginnal, hacsak nincs másképp jelezve (néhány kísérletben rövidebb vagy hosszabb kezelési időt is alkalmaztak különböző koncentrációkkal, amint azt az ábrákon és a hozzájuk tartozó feliratok kifejezetten jelezték). Az MZ1-et vagy JQ1-et érintő kísérleteket úgy végeztük, hogy az MPH-t 3 órán át 0,01, 0,1 vagy 1 μM MZ1-gyel vagy 1 órán át 500 nM JQ1-gyel előkezelték, majd 1 μM thapsigargin 4 órán át tartó kezelését végeztük. A C646-ot érintő kísérleteket úgy végezték, hogy az MPH-t 5, 10 vagy 20 μM C646-tal és 1 μM thapsigarginnal 4 órán keresztül együtt kezelték. A trichostatin A-val végzett kísérleteket úgy végeztük, hogy az MPH-t 1 µM trichostatin A-val és 1 µM thapsigargin-nal 4 órán át együtt kezeltük. A cikloheximiddel végzett kísérleteket úgy végezték, hogy az MPH-t 0, 1 vagy 10 μg/ml cikloheximiddel és 1 μM thapsigarginnal 4 órán át együtt kezelték. A PBA-t, ISRIB-t, MG132-t vagy PP2-t érintő kísérleteket úgy végeztük, hogy az MPH-t 30 percig előkezelték 5 mM PBA-val, 1 µM ISRIB-vel, 10 µM MG132-vel vagy 10 µM PP2-vel, mielőtt 1 µM thapsigargint adtunk volna hozzá. Az UPR három ágának inhibitorait bevonó kísérleteket úgy végezték, hogy az AML12 sejteket előzetesen 30 μM STF083010, 200 μM ISRIB vagy 100 μM AEBSF hatásának 2 órán keresztül kezelték, majd 4 órán át 1 μM g/m thapsigarral kezelték. tunicamycin.

Fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS) izolált hepatocitákat úgy kaptunk, hogy az MPH-frakciót egy 200 μm-es fúvókával felszerelt Influx szortírozóba (Becton Dickinson) 3,6 psi nyomásra és 6,3 kHz frekvenciára hangolták. A minta folyadéknyomását úgy állítottuk be, hogy elérjük a 2000 esemény/s eseménysebességet. A májsejteket FSChi SSChi eseményekként azonosították, és „tiszta” módban válogatták 80%-os válogatási hatékonysággal.

A HEK293 sejteket a Plotonhoz hasonlóan növesztjük et al (2018), és jetPEI-vel (Polyplus Transfection) transzfektáltuk a gyártó utasításai szerint.

Vegyszerek

A vizsgálatban használt összes vegyszer megtalálható a Reagensek és eszközök táblázatban.

Állatkísérletek

Hím C57BL/6J vad típusú (WT) egereket a Charles Rivertől vásároltunk 8 hetes korukban, és standard ketrecekben tartották őket egy hőmérséklet-szabályozott helyiségben (22–24 °C), 12 órás sötét-világos ciklussal. Volt nekik ad libitum hozzáférést kaptak a csapvízhez és a standard ételhez, és hagytuk akklimatizálódni 2 hétig a kísérleti protokoll megkezdése előtt. Az ERS-t tunicamycin intraperitoneális injekciójával indukáltuk 1 μg/g egértesttömeg (Sigma-Aldrich, #T7765) vagy vivőanyag (150 mM dextróz) alkalmazásával, és a májat 8 órával később összegyűjtöttük (csoportonként öt egér). Az Nfil3 A vizsgálatban használt −/− (NFIL3 KO) egereket (C57BL/6J háttér) korábban leírták (van der Kallen et al, 2015). Kontrollként WT alomtársakat használtunk. A 10 hetes egereket tunicamycinnel vagy vivőanyaggal kezeltük a fent leírtak szerint, és a májat 8 órával az injekció után összegyűjtöttük (csoportonként nyolc egér). Az ERS izomban történő indukálására 30 μg tunicamycint injektáltunk intramuszkulárisan a gastrocnemius izomba. Az ellenoldali lábba sóoldatot fecskendeztünk, és kontrollként használtuk. Az izmokat az injekció után 24 órával összegyűjtöttük (csoportonként kilenc egér).

A szepszis két különböző modelljét alkalmazták. A szepszis bakteriális injekciós modellje (BIM) (szepszis BIM) esetében az egereket intraperitoneálisan 8 × 10 8 CFU élővel injektálták. E. coli (DH5α) baktériumokat vagy PBS-t (kontroll) és a májat 16 órával később összegyűjtöttük (csoportonként hat egér). Egy külön kísérletben az egereket 4 egymást követő napon előkezelték tauroursodeoxikólsavval (500 mpk/nap TUDCA intraperitoneális injekció) vagy vivőanyaggal (PBS), majd bakteriális injekcióval 2 órával az utolsó TUDCA beadás után a negyedik napon (10 egér). csoportonként), és 6 órával a bakteriális injekció után leöltük, ami elegendő a LIVER-ID TF elvesztéséhez (Függelék S22C ábra). A szepszis vakbélligálási és szúrási (CLP) modelljéhez (szepszis CLP) a 24 hetes hím C57BL/6J vad típusú egereket véletlenszerűen szepszis CLP-be vagy egészséges, páros táplálékkal táplált kontrollba soroltuk, és 10, 30 óra elteltével leöltük. vagy 3 napig (csoportonként 15 egér időpontonként). A szepszises CLP-csoportokban az egereket egyszeri szúrásos CLP-nek vetettük alá, majd intravénás folyadék újraélesztést végeztünk a korábban leírtak szerint (Derde et al, 2017). Röviden, az egereket elaltattuk, katétert helyeztünk be a centrális jugularis vénába, és elvégeztük a sebészeti CLP eljárást (a vakbél 50%-os lekötése a disztális pólus és a vakbél alapja közötti távolság felénél, és egyszeri szúrás -and-through), majd intravénás folyadék újraélesztés. Fájdalomcsillapítót és antibiotikumot kaptak 6 órával a CLP után, majd onnantól kezdve 12 óránként a kísérlet hátralévő részében, és a „3. nap” csoportba tartozó egerek (elnyújtott fázis) parenterális táplálást kaptak a műtét utáni reggeltől, hogy utánozzák az emberi klinikai helyzetet. . A szepszis CLP-tervezésére jelentett adatok a 10 órás időpontnak (akut fázis) felelnek meg, hacsak másként nem jelezzük. Kontrollként egészséges, párban táplált egereket használtunk.

Az összes állatkísérletet a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó EU-előírásoknak megfelelően végezték el, és jóváhagyta a Nord-Pas de Calais Etikai Bizottság (az ERS-kezelések és a szepszis BIM-tervezés tekintetében) vagy a KU Leuven Etikai Bizottsága (P093/2014) a szepszis CLP-tervezés).

Biokémiai elemzések

A plazma aszpartát-aminotranszferáz (AST) és alanin-aminotranszferáz (ALT) aktivitását kolorimetriás vizsgálatokkal (Thermo Fischer Scientific) határoztuk meg retro-orbitális vérvétel után nyert szérum felhasználásával.

A génexpresszió valós idejű kvantitatív PCR elemzése

Az RNS-kivonást, a reverz transzkripciót és a valós idejű kvantitatív PCR-t (RT-qPCR) a korábban leírtak szerint végeztük (Dubois-Chevalier). et al, 2017). A primer szekvenciákat az EV5. táblázat tartalmazza. Minden primert úgy terveztünk, hogy különböző exonokhoz hibridizálódjon, és az egyes helyes amplikonok keletkezését olvadási görbe disszociációval ellenőriztük. Az egér génexpressziós szintjeit hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz (Hprt) (szepszis CLP kísérletek) vagy ciklofilin A (PPia) (minden más kísérlet) belső kontrollként a housekeeping génexpressziós szinteket. A humán génexpressziós szinteket 18S riboszomális RNS segítségével normalizáltuk.RNA18S5). A génexpressziós elemzésekhez in vitro a kísérleteket (AML12 és MPH) legalább háromszor megismételtük (független kísérletek), mindegyik kísérletet technikai három párhuzamosban hajtották végre. Mert in vivo egér vizsgálatok során kísérleti körülményenként (genotípusonként vagy kezelésenként) legalább öt állatot használtunk. A biológiai ismétlődések számát az ábra jelmagyarázatai jelzik.

Génexpressziós mikrotömbök

Az RNS-t 4 órán át 1 μM thapsigarginnal kezelt MPH-ból (három független kísérlet), NFIL3 KO és WT alomtársak májából, 8 órán át 1 μg/g tunicamycinnel kezelt (öt egér genotípusonként kezelésenként), vagy WT gastrocnemius izomzatából vontuk ki. 24 órán át 30 μg tunikamicinnel kezelt egereket (kilenc egér kezelt és ellenoldali kontroll izmai), és mennyiségüket és minőségüket az Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Biotechnologies) segítségével ellenőrizték, mielőtt a MoGene-2_0-st Affymetrix tömbök segítségével analízishez feldolgozták volna őket a szerint. a gyártó utasításait. Az adatokat az alábbiakban leírtak szerint elemeztük, és GSE122508 nyilvántartási számon benyújtották a GEO-nak.

Transzkriptomikai adatelemzések

Máj-specifitási index

A májspecifitási indexet a normál máj expresszió és a kontrollszövetekben a normalizált expresszió átlagának különbségeként számítottuk ki a BioGPS adatai alapján (EV6. táblázat).

A microarray normalizálása és a differenciálisan expresszált gének azonosítása

Az Affymetrix mikrotömbökből származó nyers transzkriptomikai adatokat a Partek Genomics Suite 6.6-tal normalizáltuk Robust Multi-array Average (RMA) háttérkorrekcióval, kvantilis normalizálással és medián polírozással végzett összegzéssel. Az adatok minőségellenőrzésére főkomponens-elemzéseket (PCA) használtunk. Az RMA értékeket a kiválasztott génkészletek expressziós változásainak különböző ábrákon történő megjelenítésére is használták. A differenciális expressziós elemzéseket próbaszinten végeztük a Partek Genomics Suite segítségével. A diszregulált géneket az eredeti kísérleti tervben előforduló lehetséges faktorkölcsönhatások figyelembevételével határozták meg, és Benjamini-Hochberg korrigált gént használtak. P-érték határérték (FDR) 0,05-re van állítva.

Egysejtű RNS-seq adatelemzések

Nyers számok egysejt transzkriptomikus adatokból (447 sejt E10.5-től E17.5 Yang-ig et al, 2017) a könyvtár mérettényezőjének DESeq 1.26.0-val (Anders és Huber, 2010) Brennecke szerint történő becslésével normalizáltak. et al (2013). A PCA-t normalizált adatokon végeztük FactoMineR 1.41 (Lê et al, 2008). Ezután minden sejtre vetítettük az ERS DOWN vagy ERS UP gének átlagos expresszióját a 2D PCA diagramon.

A génexpresszió preferenciális mintáinak azonosítása részleges hepatektómia után

A különböző időbeli expressziós profillal rendelkező géneket a Short Time-series Expression Miner (STEM v1.3.11 Ernst) segítségével azonosítottuk et al, 2005), amely a génexpresszió dinamikus mintázatait modellprofilokhoz illeszti. A normalizált génexpressziókat (rpkm) a Rib-től szereztük be et al (2018), és a replikátumokból származó átlagos kifejezést használtuk. A paramétereket a következőre állítottuk be: „log normalize data”, 4 a „max unit változás a modellprofilokban az időpontok között”, -0,05 a „minimális abszolút kifejezés változáshoz”, és FDR a „Javítási módszerhez”.

Az egérmájban előforduló transzkriptomikus változások szélességének összehasonlítása

Annak érdekében, hogy a hajtási változások összehasonlíthatóak legyenek az RNA-seq használatával kapottakkal, a microarray adatokat normalizáltuk az Affymetrix Power Tool (Thermo Fisher Scientific) segítségével, amelyet a GIANT eszközcsomagon (Vandel) futtattunk. et al, 2018) a Galaxy helyi példányán (Afgan et al, 2018). A normalizálást „skálaintenzitás + rma” értékre, a normalizálási szintet pedig „próbabeállításra” állítottuk. Az RNS-seq-et használó vizsgálatokhoz (EV6. táblázat) kapott normalizált expressziós értékek logaritmikusak2- átalakult. Minden adatkészlethez génenként egyetlen expressziós értéket határoztunk meg génszimbólumok azonosítóként és a replikátumokból kapott értékek átlagolásával. Változások hajtogatása (napló2) ezután skálázott adatokon számítottuk ki, amelyeket a «graphics» R csomag (R Core Team, 2015) skálafüggvényével kaptunk minden adatkészleten külön-külön. Ezt a globális átlaggal (az összes kifejezési érték átlaga minden érdeklődésre számot tartó vizsgálatban egy adott vizsgálatban) a „közép” paraméter és a globális szórással a „skála” paraméterrel végeztük. Csak az összes elemzett adatkészletben közös géneket vettük figyelembe a további elemzéseknél, és minden adatkészletnél a legalacsonyabb májexpressziójú 20%-os géneket elvetettük. A bagplotokat az „aplpack” (v1.3.2) R csomag „bagplot” funkciójával rajzoltuk meg, alapértelmezett paraméterek használatával (R Core Team, 2015). A bagplotok kétváltozós dobozdiagramok, amelyek az adatok elterjedését egy olyan „zsák” használatával mutatják be, amely a legnagyobb mélységű adatpontok 50%-át tartalmazza (a medián körül), és ennek kiterjesztését egy „hurokkal”, amelynek határa kizárja a kiugró értékeket (Rousseeuw et al, 1999 ).

A sérült máj transzkriptumának összehasonlítása a fejlődő egérmájéval

A májsérülések transzkriptomikus adatait összevontuk, és a batch hatásokat az „sva” R csomag (póréhagyma) „ComBat” funkciójával korrigáltuk. et al, 2019). A paraméterek beállítása „mean.only = T” és „par.prior = T”. Mindegyik vizsgálatot különböző tételként határoztuk meg, ahol a kontrollállapotot (azaz nem sérült májat) a referenciaadatkészlet felnőtt májstádiumához illesztettük. Ezután egy PCA-t csak az egérmáj differenciációs vizsgálatán számítottak ki a FactomineR „PCA” funkciójával (Lê). et al, 2008 a „scale.unit = F”) használatával. A májsérülési vizsgálatokat kiegészítő egyéneknek tekintették. Végül az első fő komponenst (amely az egér májdifferenciálódási vizsgálat variabilitásának 63,55%-át képviseli) ábrázoltuk, és felhasználtuk a májkárosodási vizsgálatok kivetítésére. A prenatális egérmájnak megfelelő adatokat használtuk az elemzésekhez, de ezeket az adatok megjelenítéséhez elvetették.

Funkcionális dúsítási elemzések

A funkcionális dúsítási elemzéseket a ToppGene Suite (Chen et al, 2009). KEGG utak Bonferroni-korrekcióval P < 10 -3 és génontológia (GO) biológiai folyamatok Bonferroni-korrigált P < 10 −6-ot vettünk figyelembe, és a hasonló kifejezéseket összevontuk.

Génkészlet-dúsítási elemzések

A génkészlet-dúsítási elemzéseket (GSEA) a Broad Institute (Subramanian) által kifejlesztett GSEA szoftverrel (v3.0) végeztük. et al, 2005). 1000 génkészlet-permutációt és a következő beállításokat használtuk: „súlyozott” a gazdagodási statisztikaként és „osztálykülönbség” a gének rangsorolásának mérőszáma. A rangsorolást a GSEA szoftver hajtotta végre a génenkénti átlagos expressziós érték felhasználásával, amikor több próbatest volt jelen a microarray-ben. A dúsítási diagramokon kívül az ábrák a NES-t és az FDR-t is megadják, amelyek a GSEA szoftver által biztosított normalizált dúsítási pontszám és hamis felfedezési arány. Több feltétellel végzett kísérletekben a BubbleGUM eszköz (GSEA Unlimited Map v1.3.19 Spinelli et al, 2015) számos GSEA-eredmény integrálására és összehasonlítására szolgált többszörös tesztelési korrekcióval. A nem-orientált GO kifejezés-dúsítási elemzéseket a „MousePath_GO_gmt.gmt” génkészlettel végeztük a Gene Set Knowledgebase-ból (GSKB preprint: Lai). et al, 2016 ).

Kromatin immunprecipitáció

Az MPH-t (3 × 106 sejtet) 30 percig szobahőmérsékleten fixáltuk diszzukcinimidil-glutaráttal, majd 10 percig inkubáltuk 1% formaldehiddel és 5 percig 125 mM glicinnel. Jéghideg PBS-sel végzett kétszeri mosás után a sejteket PBS-ben kapartuk, majd 400 °C-on centrifugálással ülepítettük. g 5 percig lízispufferben (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS és 1× PIC a Roche-tól) újraszuszpendáljuk, és 4 percig ultrahanggal kezeljük (négy ciklus 30 s BE/30 s KI Bioruptor segítségével Pico a Diagenode-ból). Az egérmájat (200 mg szövet) kis darabokra vágtuk jéghideg PBS-ben, átnyomtuk egy 70 μm-es sejtszűrőn, majd néhányszor átpasszíroztuk egy 18G-s tűn. A rögzítést, lízist és ultrahangos kezelést az MPH esetében leírtak szerint végeztük. A kromatint (50 μg H3K27ac ChIP-hez és 200 μg BRD4 ChIP-hez) 10-szeresére hígítottuk hígítópufferben (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl-ban egy éjszakán át) 2 μg H3K27ac antitest (Active Motif, #39685) vagy 3 μg BRD4 antitest (Bethyl Labs, #A301-985A100) 4 °C-on. Másnap A/G Sepharose gyöngy keveréket (GE Healthcare) adtunk hozzá 4 óra alatt 4°C-on 70 μg/ml élesztő tRNS (Sigma-Aldrich) jelenlétében. A gyöngyöket háromszor mostuk RIPA pufferrel (50 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,7% Na-dezoxikolát, 1% NP-40 és 500 mM LiCl), amely 10 μg/ml élesztő tRNS-t tartalmazott, és egyszer TE pufferrel (10 mM) Trisz-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). A DNS-t ezután 100 mM NaHCO-ban eluáltuk3 1% SDS-t tartalmazott, és egy éjszakán át 65 °C-on inkubáltuk a fordított térhálósításhoz. A DNS-tisztítást a MinElute PCR tisztítókészlettel (Qiagen, #2800) végeztük, és a mintákat qPCR-elemzésnek vetettük alá. A primer szekvenciákat az EV5. táblázat tartalmazza.

Három független kísérletből származó H3K27ac ChIP-t és az MPH-ból származó, 4 órán át 1 μM thapsigarginnal vagy vivőanyaggal (0,04% DMSO) kezelt bemeneti mintákat ezenkívül elküldtük Illumina Hi-seq 4000 készüléken végzett szekvenálásra, egyvégű, 50 bázisú leolvasásként a gyártó előírásai szerint. utasítás. Az adatokat az alábbiakban leírtak szerint elemeztük, és a GEO-hoz GSE122508 nyilvántartási számon nyújtották be.

ChIP-seq adatelemzések

A ChIP-seq adatminőség-ellenőrzést és az egységes újrafeldolgozást, beleértve az egérgenom mm10-es verziójához való leképezést és a jelnormalizálást, Dubois-Chevalier írta le. et al (2017), kivéve a Bowtie 2-t (érzékeny módú Langmead et al, 2009) használtuk a BRD4 ChIP-seq elemzésekhez. A ChIP-seq adatokat az Integrated Genome Browser (IGB 9.0.1 Freese) segítségével vizualizáltuk et al, 2016 ).

Széles H3K4me3 domén azonosítás és identitásgén meghatározása

H3K4me3 KÓDOLJA a ChIP-seq adatokat több egérszövetből (Shen et al, 2012 EV6 táblázat) széles, H3K4me3-mal dúsított régiók hívására használták MACS2 használatával, ahogy Chen leírása szerint. et al (2015). A széles H3K4me3 doméneket úgy határozták meg, mint amelyek egy adott szövetben az összes H3K4me3-ban dúsított régió medián méretének több mint háromszorosát fedik le. Az egérmájból származó széles H3K4me3 doméneket májazonosító (MAJ-ID) doménekre különítettük el, amelyeket a májra specifikus széles H3K4me3 doménekként határoztak meg (azaz a többi elemzett szövet kevesebb mint 25%-ában kimutatható) és a mindenütt jelenlévő (UBQ) doménekben. . A LIVER-ID és UBQ doméneket ezután a GENCODE (M9) adatbázisból átfedő TSS szerint rendelték hozzá a génekhez (franki et al, 2019), ami 621 LIVER-ID gént és 657 UBQ gént eredményez, amelyeket az EV1. táblázat sorol fel. A génlistákon belüli TF-eket ezt követően az Animal TFDB 2.0-ban (Zhang) felsorolt ​​egér TF-ekkel való összehasonlítással kaptuk. et al, 2015). Az EV4 táblázatban felsorolt ​​izomidentitás (MUSCLE-ID) és UBQ géneket hasonló módon határoztuk meg a Chen által feldolgozott ROADMAP konzorciumból származó H3K4me3 ChIP-seq adatok felhasználásával. et al (2015). Az ember-egér génnevek konverzióját a bioDBnet dbOrtho eszközével (Mudunuri et al, 2009 ).

Super-enhancer azonosítás

A BRD4 szuperfokozók (SE) meghatározásához először MACS2-t használtunk a dúsított csúcsok azonosítására (effektív genomméret = 2150570000, sávszélesség = 300, mfold = 5-50, FDR (q-érték) = 0,05, max. duplikált címkék ugyanabban hely = 1) korábban szűrt leképezett leolvasások segítségével a duplikátumok eltávolítása, valamint a Dubois-Chevalier-ben azonosított téves pozitív régiókra való leképezés. et al (2017). Az SE-ket a szuperfokozók rangsorolásával azonosították (ROSE Loven et al, 2013 Whyte et al, 2013).

A H3K27ac akut ERS által kiváltott változásainak azonosítása

Az ERS által kiváltott H3K27ac ChIP-seq jelekben jelentős változást mutató régiókat a csaw 1.6.1 segítségével azonosították (Lun & Smyth, 2014, 2016). A leképezett leolvasásokat korábban szűrtük, hogy eltávolítsuk a duplikációkat és az olvasási leképezést az ENCODE feketelistán szereplő régióihoz (Encode_Project_Consortium, 2012) vagy az egér ChIP-seq hamis pozitív régióihoz, amelyeket Dubois-Chevalier-ben azonosítottunk. et al (2017). A parancssorokat és a használt paraméterek teljes listáját az EV1 Computer Code tartalmazza. Röviden, a genomot összegyűjtöttük, és megszámoltuk a leolvasásokat, a bemeneti minták alapján meghatározott háttérszintű jelet tartalmazó rekeszeket eldobtuk a löszregresszióval történő normalizálás előtt. Végül, a Disp függvény segítségével végzett diszperzióbecslés után a szűrt és normalizált adatokon páros differenciálelemzést végeztünk a glmQLFit segítségével. A H3K27ac csúcsokat átfedő rekeszeket (széles régiók, amelyeket MACS2-vel hívnak meg, az összes H3K27ac ChIP-seq adatkészletet és bemeneteket vezérlőként – paraméterek: q-val szűk = 0,001 és q-val széles = 0,01) a GenomicRanges3 1 findOverlaps segítségével azonosították. (Lawrence et al, 2013 paraméterek : minoverlap = 75, maxgap = 0). Az egyetlen H3K27ac-csúcsot átfedő rekeszeket kombinált átfedésekkel kombináltuk, és csak a 0,05-nél nagyobb FDR-értékkel rendelkező összevont rekeszeket vettük figyelembe (a 0,05-nél nagyobb FDR-t tartalmazó egyesített rekeszeket változatlan H3K27ac-régiókként határoztuk meg). Ezután kiszámítottuk az összevont régiókban az UP és DOWN rekeszek arányát, és a H3K27ac UP vagy DOWN régiókat úgy határoztuk meg, mint amelyek aránya ≥ 2 vagy ≤ 0,5. A H3K27ac UP, DOWN és változatlan régiók koordinátáit az EV1 adatkészlet tartalmazza. A bigwig jeleket az egyes adatkészleteken lévő lösz normalizált jel felhasználásával és/vagy a lösz normalizált jelek replikációk közötti átlagolásával számítottuk ki. A géneket a következőképpen rendeltük a H3K27ac régiókhoz: Először is azok a gének, amelyek TSS-je a GENCODE (M9) adatbázisból (francia et al, 2019) közvetlenül átfedi a H3K27ac régiókat. Ezenkívül a disztális H3K27ac-et potenciálisan szabályozott génekhez kapcsolták a CisMapper (O'Connor) segítségével et al, 2017), amint azt korábban leírták (Dubois-Chevalier et al, 2017 ).

A transzkripciós szabályozók elemzése olyan régiókban, ahol a H3K27ac akut ERS által kiváltott változásai vannak

Annak érdekében, hogy azonosítsuk azokat a TF-eket, amelyek kötődése feldúsult a H3K27ac UP és H3K27ac DOWN régiókban, a Locus Overlap Analysis segítségével (LOLA 1.4.0 Sheffield & Bock, 2016) hasonlítottuk össze a TF-kötést az UP, DOWN és ALL területeken belül (vagyis beleértve a H3K27ac-et is). változatlan) régiók. Az egér TF-kötő helyek a Gene Transcription Regulation Database (GTRD) adatbázisból lettek lekérve (Metaclusters of GTRD release 16.07 Yevshin et al, 2017). A bemeneti adatokat elvetettük, és a ChIP-seq adatkészleteket a TF-ekhez rendeltük a szerzők által biztosított nómenklatúra információinak felhasználásával. A log-odds arány hőtérképét az R csomag „gplots” (v3.0.1 Warnes) heatmap.2 függvényével állítottuk elő et al, 2016) és hierarchikus klaszterezés az R csomag „Stats” hclust függvényét használva (euklideszi távolság és ward.D2 agglomerációs módszerrel R Core Team, 2015). Az egyes klaszterek TF-einek listája az EV2. táblázatban látható.

A H3K27ac UP, DOWN vagy változatlan régiói átfedésben voltak cis-Dubois-Chevalier-ben meghatározott szabályozási modulok (CRM). et al (2017) 47 transzkripciós szabályozó együttes kötődésén alapul egérmájban. A transzkripciós szabályozók kombinatorikus együttkötődését H3K27ac UP, DOWN vagy változatlan formában a Dubois-Chevalier által leírt többdimenziós skálázási (MDS) elemzésekkel elemeztük. et al (2017). A diagramokat a «graphics» R csomag (R Core Team, 2015) smoothScatter funkciójával végeztük, konzervált színskála segítségével.

Nyilvános transzkriptomikai és funkcionális genomikai adatok helyreállítása

A tanulmányban használt nyilvános adatok a Gene Expression Omnibus webhelyről (GEO http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Edgar) lettek letöltve et al, 2002 ), ENCODE (Yue et al, 2014), UCSC Genome Browser (Dreszer et al, 2012), vagy BioGPS (Mouse MOE430 Gene Atlas Wu et al, 2016), és az EV6. táblázatban találhatók.

Emberi minták

A Leuven Egyetemi Kórház intenzív osztályára (ICU) szepszisben felvett betegek posztmortem májbiopsziája (n = 64), akik átlagosan 10 napos intenzív osztályos tartózkodás után haltak meg (IQR 6–20 nap), összehasonlították az elektív helyreállító rektális műtéten átesett, hasonló betegekkel.n = 18). A betegektől vagy legközelebbi családtagjaiktól, valamint az önkéntesektől írásos beleegyezést kaptunk. A vizsgálati protokollokat és a hozzájárulási űrlapokat a KU Leuven Institutional Review Board hagyta jóvá (ML1094, ML1820 és ML2707). A bilirubint az Egyetemi Kórház Klinikai Laboratóriumában standard rutin automatizált assay segítségével határozták meg.

Fehérje kivonás

Összes kivonat

Az MPH és az AML12 sejteket jéghideg PBS-ben kapartuk, majd 400 °C-on centrifugálással ülepítettük. g 5 percig lizáltuk Laemmli pufferben 6x (175 mM Tris-HCl pH 6,8, 15% glicerin, 5% SDS, 300 mM DTT és 0,01% Bromphenol Blue), és 10 percig ultrahanggal kezeltük. Az egérmájat kis darabokra vágtuk jéghideg PBS-ben, és egy 70 μm-es sejtszűrőn préseltük át. A 400 °C-on végzett centrifugálás után kapott pellet g 5 percig lizáltuk és ultrahanggal kezeltük az MPH-nál leírtak szerint. Az ebben a vizsgálatban bemutatott Western-blot-vizsgálatokat teljes sejtkivonatok felhasználásával végeztük, hacsak másként nem jelezzük.

Nukleáris kivonatok

Az MPH-t jéghideg PBS-ben kapartuk, az egérmájt pedig jéghideg PBS-ben apró darabokra vágtuk, és egy 70 μm-es sejtszűrőn préseltük át. A pelleteket 400 °C-on végzett centrifugálással nyertük g 5 percig hipotóniás pufferben lizáltuk (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl20,2% NP-40 és 1× PIC a Roche-tól) és 5 percig 4 °C-on inkubáltuk. A mintákat 600 °C-on centrifugáltuk g 5 percig 4 °C-on, és a felülúszók alkották a citoplazmatikus frakciót. A nukleáris pelleteket Nucleus Lysis Pufferben (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 és 1× PIC a Roche-tól) lizáltuk. A hipotóniás puffert és a sejtmag lízis puffert foszfatázgátló koktéllal (#P044 a Sigma-Aldrich cégtől), valamint 5 mM nátrium-butiráttal és 5 μM trichostatin A-val egészítettük ki a dezacetiláz gátlására. 30 perces, 4 °C-on történő inkubálás után a mintákat 10 percig ultrahanggal kezeltük, és 16 000 fokon centrifugáltuk. g 5 percig 4 °C-on. Laemmli 6×-ot adtunk a felülúszókhoz, amelyeket Western immunoblothoz használtunk.

Kromatin frakció

Az MPH-t jéghideg PBS-be kapartuk, és 400 °C-on centrifugálással ülepítettük g 5 percig A pufferben lizáltuk (50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2340 mM szacharózt, 10% glicerint, 1 mM DTT-t és 1 x PIC-t a Roche-tól), és 10 percig 4 °C-on inkubáltuk. A mintákat 1300 °C-on centrifugáltuk g 5 percig 4 °C-on, és a felülúszót eldobtuk. A nukleáris pelleteket A pufferrel mostuk, majd B oldatban lizáltuk (3 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT és 1× PIC a Roche-tól). 30 perces 4 °C-os inkubálás után a mintákat 1700-on centrifugáltuk. g 5 percig 4 °C-on, és a felülúszót elöntöttük. A kromatin pelleteket B oldattal mostuk, C pufferben (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM MgCl) újra szuszpendáltuk.2és 83 U/μl benzonáz), és 20 percig 4 °C-on inkubáltuk. 6x Laemmli puffert adtunk a Western immunoblot betöltés előtt.

Plazmidok és in vitro átírás és fordítás

A pcDNA3.1-mNFIL3 (Addgene 34572) és a pSGG5-hHNF4A konstrukciókat használták in vitro átírás és fordítás (in vitro TNT) a TnT ® Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) segítségével.

Western immunoblot

Western blot assays (WB)

Száz μg fehérjét választottunk el 10%-os SDS-PAGE-val, és Western immunoblot-eljárással immunodetektáltuk a Reagensek és eszközök táblázatban felsorolt ​​elsődleges antitestek felhasználásával. Az elsődleges antitesteket HRP-konjugált másodlagos antitestek (Sigma-Aldrich) alkalmazásával mutattuk ki. A képeket egy G-box (Syngene, Cambridge, Egyesült Királyság) vagy az iBright™ CL1500 képalkotó rendszer (Thermo Fisher Scientific) segítségével szereztük be. A számszerűsítéseket Image Studio Lite v5.2 (LI-COR Biosciences, Lincoln, USA) segítségével végeztük, és a sávintenzitást a jelérték (az alakban lévő pixelintenzitás összege mínusz a háttérérték) segítségével határoztuk meg.

Egyszerű nyugati immunoassays (WES)

Az egyszerű Western méret alapú vizsgálatokat WES rendszeren futtattuk a gyártó ajánlása szerint (ProteinSimple, San Jose, USA). A fehérjekoncentráció 0,25 és 0,8 μg/μl között változott a célfehérjétől függően. Az elsődleges antitestek a Reagensek és eszközök táblázatban vannak felsorolva. A másodlagos antitesteket a gyártó biztosította (PS-MK14 és PS-MK15, ProteinSimple). Az adatokat a Compass szoftverrel (ProteinSimple) elemeztük. A mennyiségi meghatározásokat a kérdéses fehérje csúcsa alatti terület felhasználásával végeztük.

Ko-immunprecipitációs vizsgálatok

Az MPH sejteket hipotóniás pufferben (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl) szuszpendáltuk.20,2% NP-40 és proteáz inhibitorok), és a pelletet 30 percig lizáltuk. 10 perces ultrahangos kezelés (30 másodperces be-/kikapcsolási ciklusok Bioruptorral (Diagenode) és centrifugálás) után az oldható frakcióból származó 500 μg sejtmagfehérjét két térfogatnyi pufferrel hígítottuk, amely 25 mM Tris–HCl-t (pH7,5, 1 mM) tartalmazott. EDTA, 1,5 mM MgCl2, és egy éjszakán át inkubáltuk 2 μg p300 antitesttel (Active motif, #61401) vagy kontroll egér IgG-vel (sc-2025, Santa Cruz). A mintákat ezután 4 órán át 5 mg/ml szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkolt mágneses gyöngyökkel (Life Technology) inkubáltuk, majd négyszer mostuk jéghideg mosópufferrel, amely 25 mM Tris–HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2% NP-40 és proteáz inhibitorok. A gyöngyöket végül Laemmli pufferben 6x eluáltuk.

Statisztikai elemzések

A statisztikai elemzéseket a Prism szoftver (GraphPad, San Diego, CA) és az R (R Core Team, 2015) segítségével végeztük. A többszörös teszteléshez használt konkrét teszteket és korrekciókat, valamint a minták számát állapotonként az ábra jelmagyarázatai jelzik. A statisztikai szignifikanciát minden esetben akkor tekintették elértnek, amikor P-értékek 0,05 alatt voltak, amit * vagy # jelzett. Minden oszlopdiagram az átlagokat ± SD (standard eltérések) mutatja. A dobozdiagramok a 25. és a 75. percentilis közötti négyzetből állnak, a mediánt egy vonallal, a mintől a maximumig pedig bajuszokat.


Szarvasmarha MSTN gén promóter

A szarvasmarha upstream régiójának 1,6 kb-os vizsgálata kimutatta, hogy a szekvencia 79%-ban azonos a humán 5' szabályozórégióval, és számos feltételezett kötőhelyet is tartalmaz, köztük egy CAAT-helyet, három TATA-boxot, valamint egy MEF2-t, amelyről kimutatták, hogy fokozza a promoter aktivitást in vitro [19, 40] (lásd az 1. kiegészítő fájlt). Tíz feltételezett E-box három klaszterbe szerveződik a szarvasmarha-promoteren belül (1. ábra), a két proximális klaszter hat E-boxot tartalmaz, amelyek elegendőek mind a tíz E-box esetében megfigyelt azonos szintű promoteraktivitás stimulálásához. 19]. Úgy tűnik, hogy a 6-os számú E-box kulcsfontosságú szerepet játszik a szabályozásban, és a MYOD és MYF5 MRF-ek preferenciális kötőhelyeként jelölték meg, mivel képes kompenzálni a többi E-box elvesztését. Az E-boxok MRF-eken keresztüli génexpresszióban betöltött szerepével összhangban a promoterről kimutatták, hogy izomspecifikus, és gyenge aktivitást mutat, ha fibroblasztokba transzfektálják [19].

Ez a szarvasmarha MSTN A promótert a luciferáz riportergén előtt klónoztuk, C2C12 sejtekbe transzfektáltuk, és növekvő koncentrációjú vad típusú MSTN fehérjével kezeltük. Ez csökkent promóter aktivitást eredményezett, ami azt jelzi MSTN A promóter az MSTN fehérje negatív szabályozása alatt áll [41]. Azonban a piemonti szarvasmarhából származó mutált MSTN fehérje használatakor, amely a C-terminális aktív doménben cisztein-tirozin átmenetet mutat be, a promoter aktivitása nem változott szignifikánsan. Továbbá a negatív visszajelzések MSTN kimutatták, hogy az MSTN fehérje által termelt promóter az ActRIIB és ALK5 receptoroktól, valamint az SMAD7 fehérjétől függ. Kimutatták, hogy az SMAD7 génpromoterét a vad típusú MSTN fehérje aktiválja, de a mutált piemonti MSTN nem, míg MSTN kimutatták, hogy a promóter aktivitása csökkenti az SMAD7 expresszióját. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a MSTN A promótert az MSTN fehérje negatívan autoregulálja SMAD7 függő módon, és az egyes kettős izomzatú szarvasmarha fajtákban megfigyelt mutáns MSTN fehérje elveszíti erre való képességét, ami a MSTN mRNS ilyen állatokban [41].

Az egynukleotidos polimorfizmusokat (SNP-ket) már számos szarvasmarha 5′-es szabályozó régiójában kimutatták számos fajta esetében, mint például a belga kék, piemonti, limuzin, Marchigiana, fekete-fehér bikák, holstein, hanwoo, jeju fekete szarvasmarha és qinchuan szarvasmarha esetében [40 , 42,43,44,45]. A legrelevánsabbakat az 1. táblázat foglalja össze. Néhányukban közvetlen összefüggést találtak a promóter polimorfizmusok és a fenotípus között, ami megerősíti a potenciális felhasználást. MSTN promóter mint molekuláris marker, valamint potenciális célpont a szarvasmarhafajták gazdasági tulajdonságainak javítására irányuló manipulációkhoz, amint azt a Lehetséges alkalmazások részben tárgyaljuk. Fontos megjegyezni, hogy az izomzatra gyakorolt ​​hatások mellett egyes SNP-k zsírlerakódással is összefüggésbe hozhatók [42], ami megerősíti az MSTN szerepét a myoblasztok és a preadipocita differenciálódás, valamint az izom/zsír lerakódás közötti egyensúlyban.


Absztrakt

A kétkomponensű rendszerek (TCS) rövid jelátviteli útvonalak, amelyek általában prokariótákban fordulnak elő. Gyakran szabályozzák a prokarióta ingerválaszokat, és így a biotechnológia és a szintetikus biológia területén is érdekesek. A tanulmány célja a TCS újrahuzalozásának jobb megértése és leírása, miközben különböző evolúciós forgatókönyveket vizsgál. Különböző organizmusokban a TCS-ek nagyszabású képernyői alapján ez a tanulmány részletes adatokat, konkrét igazításokat és szerkezet-elemzést ad három általános módosítási forgatókönyvről, ahol a TCS-t új válaszok és funkciók érdekében újrahuzalozták: (i) cserék a sorozatban egyetlen TCS-n belül. tartományok, (ii) teljes TCS tartományok cseréje (iii) TCS funkciót moduláló új komponensek hozzáadása. Ennek eredményeként az inger- és promotor kazetták cseréje a TCS újrahuzalozására jól meghatározott, kihasználva az itt megadott igazításokat. Az eltérő TCS-példák nem triviálisak, és a tervezés kihívást jelent. A tervezett összekötő fehérjék bizonyos esetekben hasznosak lehetnek a TCS módosítására is.


19.E: Transzkripciós szabályozás eukariótákban (gyakorlatok) - Biológia

A T-sejt aktiváció szelektív változást indukál a celluláris lipidomban

Tapio Lonnberg 1, Laxman Yetukuri 2, Tuulikki Seppanen-Laakso 2, Riitta Lahesmaa 1, Matej Oresic 2

1 Turku Biotechnológiai Központ, Turku Egyetem és Abo Akademi Egyetem, Turku, Finnország, 2 VTT Finnországi Műszaki Kutatóközpont, Espoo, Finnország

TARTALOMJEGYZÉK 1. Absztrakt 2. Bevezetés 3. Anyag és módszerek 3.1. CD4+ sejtek izolálása 3.2. Sejtstimuláció és -tenyésztés 3.3. Betakarítás 3.4. Lipidomanalízis 3.5. Klaszterezési elemzés 4. Eredmények 4.1. A naïve T helper prekurzor sejtek lipidösszetétele 4.2. A lipidkoncentráció változása a T-sejt aktiváció hatására 4.3. A PC és PE ​​zsírsavak változási hosszának és telítettségi fokának változása az aktivált T-sejt fenotípusok kialakulása során 4.4. A lipidanyagcsere transzkripciós szabályozása 5. Megbeszélés 6. Köszönetnyilvánítás 7. Irodalom

A naïve T helper sejtek aktiválása rokon antigén bemutatásával komplex intracelluláris jelátviteli folyamatot indít el, ami funkcionálisan aktív effektor sejtpopuláció kialakulásához vezet. A nyugalmi állapotból az aktivált állapotba való váltás a sejtmetabolizmus mélyreható változásával jár, ami a többszörös proliferációs kör befejezéséhez szükséges. Ultrateljesítményű folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával elemeztük, hogy ez a változás hogyan tükröződik a humán köldökzsinórvér T-sejtek sejt lipidösszetételében. Megállapítottuk, hogy a T-sejt-receptor aktiválását követő első 72 órában jelentős koncentrációváltozások mennek végbe, ami korrelál az aktiváció által kiváltott sejtosztódás első köreivel. A legfontosabb, hogy a foszfatidil-kolinok és foszfatidil-etanol-aminok összetétele következetes tendenciát mutatott a rövidebb és telítettebb molekulafajták felé. A kapcsolódó transzkriptomikai adatokkal együtt az eredmények egyértelműen a de novo zsírsavszintézis indukálására és az endogénen szintetizált zsírsavak sejtmembránokba való felhalmozódására utaltak, ami a sejt lipidómának részleges átalakításához vezet az újonnan kifejlesztett effektor sejtpopulációban.

A T helper sejtek alkotják az adaptív immunrendszer legfelső szabályozó rétegét, szabályozzák az összes downstream immunsejttípus aktivitását, és így koordinálják az összes szerzett immunválaszt.Maguk a T-helper sejtek aktivitását a rokon peptid-MHC komplexek T-sejt-receptor által közvetített aktiválása, majd a funkcionálisan eltérő effektor alcsoportok, nevezetesen a Th1, Th2 és Th17 sejtek citokin által befolyásolt differenciálódása határozza meg (1-3). Ezek a folyamatok előfeltételei a specifitásnak és a memóriának, amelyek a szerzett immunválasz jellemzői.

Mivel a T-sejt aktiválás alapvető funkciója a patogén nem-saját peptidek felismerése egy ártalmatlan és saját molekulák által dominált környezetben, rendkívül szigorú és specifikus szabályozásra van szükség. Fontos, hogy sok más sejtfelszíni receptor funkciójával ellentétben a T-sejt aktiváció nem követi a tipikus tömeghatás kinetikát, ahol a reakció sebességét a résztvevő molekulák koncentrációja határozza meg. Ehelyett az intracelluláris jelátviteli mechanizmusok rendkívül összetett hálózata fejlődött ki, amely szabályozza az aktiválás kezdetét, időtartamát és erősségét (4-6).

Lényegében a jelenlegi modell szerint az antigén peptid-MHC komplexnek a TCR α/ b alegységeihez való kötődése a citoplazmatikus ITAM domének foszforilációjához vezet, és ezt követi a ZAP70 autofoszforilációja. A ZAP70 foszforilációja pedig a kulcsfontosságú scaffold fehérjék, a LAT és az SLP76 aktiválásához vezet, lehetővé téve a jelek diverzifikációját több útvonalra, amelyek közül a legfontosabbak a Ras, PKC q és az intracelluláris Ca 2+ által közvetített jelátvitel. A közelmúltbeli nagy áteresztőképességű vizsgálatokból származó kísérleti bizonyítékok arra utalnak, hogy végső soron a T-sejt-receptor aktiválása mélyreható hatással van a sejtműködésre, amint azt több mint 400 fehérje foszforilációja mutatja már egy órával a stimuláció után (7), és több mint 6000 gén differenciális aktiválása a sejtekben. 48 órával az aktiválás után (8).

A sejtmembránok megfelelő lipidösszetételének fenntartása szükséges a membrán fluiditása, a kapcsolódó fehérjék topológiája, a membránhoz kötött enzimek aktivitása, a felszíni fehérjék expozíciójának mértéke, a receptorok oldalirányú mobilitása és a specifikus jelátviteli utak aktiválása érdekében. Tekintettel a membrán lipidösszetételének ilyen fontosságára, a sejtek robusztus mechanizmusokat fejlesztettek ki a membrán lipid homeosztázisának fenntartásához. A T-sejt lipidanyagcseréjének megértéséhez tehát fontos végtermékeinek, a sejt lipideinek molekuláris szintű mérése. Az úgynevezett lipidomikai megközelítés, amely a szerkezetileg és funkcionálisan változatos lipidek globális profilját fedi le, nemcsak a T-sejtek lipidmolekuláris összetételét tisztázza, hanem támpontokat is szolgáltathat a sejt lipid homeosztázisának szabályozása mögött meghúzódó mechanizmusokról a T folyamatban. -sejtaktiválás(9).

Azt, hogy a T-sejt aktiválásához vezető jelek milyen mértékben tükröződnek a sejt lipidösszetételében, eddig nem foglalkoztak rendszerszintű módon. A tömegspektrometrián alapuló megközelítések közelmúltbeli fejlődéséig (9-11) ezt a korlátot vitathatatlanul inkább a hatékony eszközök hiányának, semmint az érdeklődés hiányának tulajdonították, mivel bizonyos lipidek sajátos szerepe a TCR jelátvitel proximális szakaszában jól ismert. . A Ras és a PKC q útvonalak aktiválása különösen a plazmamembrán foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfátból (PI(4,5)P 2 ) a foszfolipáz C g (PLC g) által termelt diacilglicerin (DG) függvénye. ) válaszul a TCR elkötelezettségére. A reakció másik terméke, az inozit (1,4,5)-trifoszfát (IP 3 ) pedig a citoplazmatikus Ca 2+ felszabadulását és a Ca 2+ által közvetített jelátvitel megindítását közvetíti (12). Sőt, a közelmúltban célzott megközelítéseket is kiaknáztak, pl. lipidrendű plazmamembrán doménekkel összefüggésben (13), és erős bizonyítékot szolgáltattak bizonyos molekuláris lipid környezetek szabályozó szerepének alátámasztására. Felmerül tehát a kérdés, hogy a T-sejt aktiváció és az ebből következő effektorsejt-alcsoportok kialakulásának lejjebb lévő lépéseit is lipidek szabályozzák, vagy lipid intermedierek közvetítik.

Itt bemutatjuk a humán primer köldökzsinórvér T-sejtek celluláris lipidprofiljainak globális elemzését, mind stimulálatlan állapotban, mind a T-sejt aktiválását követő 72 órás időtartam alatt. Ezenkívül mértük az IL-4, a kulcsfontosságú Th2-promotáló citokin kumulatív hatásait. Az eredmények jelentős longitudinális változást jeleztek több glicerofoszfolipid koncentrációjában. Fontos, hogy a telített, rövid szénláncú foszfatidil-kolinok és foszfatidil-etanol-aminok koncentrációjának szisztematikus növekedését mértük, a hosszabb, többszörösen telítetlen fajok megfelelő csökkenésével.

Jelenlegi adataink a primer humán T-sejtekből származó celluláris glicerofoszfolipidek, szfingolipidek és trigliceridek legteljesebb katalógusát képviselik, és az aktivált T-sejtek globális lipidösszetételének jelentős plaszticitására utalnak.

A köldökzsinórvér mintákat egészséges újszülött donoroktól vettük a Turku Egyetemi Központi Kórházból. A mononukleáris sejteket Ficoll gradiens centrifugálással (Amersham) izoláltuk. A CD4+ sejteket tovább tisztítottuk pozitív szelekció alkalmazásával, anti-CD4-bevonatú mágneses Dynal gyöngyökkel (Invitrogen). Az ilyen minták tipikus tisztasága 98-99%-os nagyságrendű (63).

3.2. Sejtstimuláció és -tenyésztés

A CD4+ sejteket Yssel tápközegben (Iscove módosított Dulbecco táptalaj (IMDM Invitrogen), Yssel tápközeg koncentrátummal, penicillinnel, sztreptomicinnel és 1% AB-szérummal kiegészítve) tenyésztettük 2-3*106 sejt/ml sűrűségben 24-on. kúttányérok. A sejteket lemezhez kötött anti-CD3-mal (0,5-109 g/lyuk) és oldható anti-CD28-cal (0,5-109 g/ml) aktiváltuk (mindkét antitest a Beckman Coulter-től). A Th2 polarizációt IL-4 (10 ng/ml, R&D Systems) hozzáadásával indukáltuk.

A sejteket nem stimulált állapotban gyűjtöttük össze, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 és 72 órával az aktiválás után. A betakarítást és a metabolikus kioltást de Koning és mtsai. (64), némi módosítással. Röviden, a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket újra szuszpendáltuk -20 °C 50%-os metanolban, és -20 °C-on centrifugálással ülepítettük (770 g 20 perc). A felülúszót elöntöttük, és a sejteket folyékony nitrogénben tároltuk. .

Tenyésztett T-sejtek alikvot részei, amelyek kb. 2 millió sejtet 10 lipidvegyületből álló standard keverékkel (0,2 µg/minta) kevertünk össze, és 100 µl kloroform/metanol (2:1) eleggyel kevertük össze 2 percig tartó vortexeléssel. 1 óra állás után a csöveket 10 000 fordulat/perc sebességgel 3 percig centrifugáltuk, majd az alsó szerves fázist ampullabetétbe választottuk, és 3 jelölt lipidvegyületet (0,1 µg/minta) tartalmazó standard keverékkel kevertük össze.

A lipidomikai elemzést a korábban leírtak szerint végezték el (65). Röviden, a lipidkivonatokat Waters Q-Tof Premier tömegspektrométeren (Waters) és Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography TM (Waters) kombinált oldószerrendszerrel futtattuk, amely 1) vizet tartalmaz 1% 1 M NH 4 Ac-vel és 0,1% HCOOH és 2) LC/MS minőségű acetonitril/izopropanol (5:2) 1% 1 M NH4Ac-vel, 0,1% HCOOH-val. A 65% A/35% B és 100% B közötti gradiens 6 percig tartott, és a teljes futtatási idő, beleértve az 5 perces újraegyensúlyozási lépést is, 18 perc volt. Egy Acquity UPLC TM BEH C18 1 × 50 mm-es oszlopot használtunk 1,7 μ m részecskékkel 50 °C-on és 0,200 ml/perc áramlási sebességgel. A lipidprofilozást ESI+ móddal végeztük, és az adatokat m/z 300-1200 tömegtartományban gyűjtöttük.

Az adatok feldolgozása MZmine 2 szoftverrel (66) történt. A lipid-azonosítást házon belüli spektrális könyvtár segítségével végeztük a korábban leírtak szerint (67). A könyvtárban található releváns lipidfajták azonosítása a következőképpen történt: Pozitív ion módban a PC molekulafajták protonált (M+H) + vagy szolidált (M+Na) + addukt ionokat, valamint domináns csúcsot alkotnak m/z-nél. 184, amely a kolinfej csoportot képviseli. Ezenkívül a hidrogénezett PC-adduktok jellegzetes csúcsokat képeznek m/z (M+Na-59)+, (M+Na-205)+ és (M+Na-183)+ értékeknél. Az éter-lipid azonosítás általában a pontos m/z értékeken (általában protonált vagy szolidált adduktum), valamint MS/MS szintű diagnosztikai fragmens ionon alapul, m/z 184 pozitív ion módban. Negatív elektrospray ionizációt alkalmaztunk, amikor a zsírsav-összetételre volt szükség. Mivel a PE-k ikerionosak, fragmentációjuk jellemzésére pozitív és negatív elektrospray is használható. A PE molekuláris fajok protonált fajokat alkotnak (M+H) +, amelyek m/z-nél (M+H-141) + (a fejcsoport elvesztése miatt) fő fragmentiont adnak ESI-MS/MS pozitív módban. A plazmalogén (éterkötésű) etanol-aminok kimutatása két, az sn-1 és sn-2 pozícióra jellemző fragmension alapján történik. A TG-fajták ESI-MS-e ammónium-adduktumokat eredményez, amelyek MS/MS-ben fragmentálódnak, így diacilglicerin- ((DG)+)-szerű fragmentumokat termelnek, amelyek informatívak a TG-fajták azonosításában. Az ESI-MS nem alkalmas a szabad koleszterin elemzésére. A koleszteril-észterek azonban ammónium-adduktokat képeznek pozitív ion módban, valamint fragmensiont m/z 369-nél az ütközés által kiváltott fragmentálódáskor. Pozitív módban a szfingolipidek, például a szfingomielin (SM) ESI-MS analízise jellegzetes protonált foszfokolin csúcsot hoz létre m/z 184 értéknél. A PC és SM fajokat jellemző m/z értékük alapján különböztetjük meg (PC fajok fordulnak elő páros m/z-nél és SM fajok páratlan m/z-nél). Az SM fajok pozitív ionizációs módban (M+H) + vagy (M+Na) +, negatív ionizációval pedig (M-CH3) - és (M+45) - ionokat adnak. A ceramidok instabil protonált molekulafajtákat képeznek, amelyek dehidratáción mennek keresztül, és ESI pozitív ion módban (M+H-H 2 O) + csúcsok keletkeznek. A negatív ionizációs körülmények között megfigyelt molekulaionok igen informatívak a ceramid zsírsav- és hosszúláncú bázisszubsztituenseinek azonosításában. A ceramid fajták (M-H) - és (M-H-30) - (a HCHO csoport elvesztése miatt) ionokat termelnek negatív ionizációs körülmények között. Míg a hosszú láncú bázisok, például a szfingozin (d18:1), a szfinganin (d18:0) és a 4-D-hidroxi-szfinganin (t18:0) pozitív módú analízise dehidratáción megy keresztül, és fragmentumok képződnek, m/z 282/264, 284/266 és 300/282, a szfingozin és fitoszfingozin egységek negatív ionmódusú analízisét a 237/263, illetve 225/255/267 m/z-nél lévő fragmensek alapján jellemezzük.

A lipidomikai adatok normalizálása a következőképpen történt: a koleszterin-észterek kivételével minden monoacil-lipidet, mint például a monoacilglicerinek és a monoacilglicerofoszfolipidek PC-vel (17:0/0:0), az összes diacil-lipidet az etanol-amin-foszfolipidek kivételével PC-vel (17:0) normalizáltuk. /17:0), a ceramidokat Cer(d18:1/17:0), a diacil-etanol-amin-foszfolipideket PE(17:0/17:0), a TG-t és a koleszterin-észtereket TG-vel (17:0/) normalizáltuk. 17:0/17:0).

A klaszterezési analízist az R (2.10.1-es verzió) segítségével végeztük, Ward távolság metrikákat alkalmazva.

4.1. A naïve T helper prekurzor sejtek lipidösszetétele

A nem stimulált humán T helper sejtek lipidösszetételét CD4-gyel tisztított humán köldökzsinórvérsejtekből elemeztük ultra teljesítményű folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával (UPLC-MS). Az elemzéseket négy biológiai párhuzamos mintával végeztük, amelyek mindegyike több egyedből származó sejtkészletet reprezentált.

Ennek eredményeként összesen 41 különböző lipidfajt lehetett reprodukálhatóan azonosítani. Ezek többsége a foszfatidilkolinokat (PC) és a foszfatidil-etanol-aminokat (PE) képviselte, amelyek mind az azonosított fajok, mind az abszolút koncentráció tekintetében a legelterjedtebb lipidosztályok, amint az 1. ábrán látható. A lipidek másik fő osztályába a szfingomielinek (SM) tartoznak. , triacilglicerinek (TG) és diacilglicerinek. Az alkalmazott azonosítási stratégia eredményeképpen minden egyes mért fajhoz lipidösszeg képletet rendeltünk, amely a fejcsoport osztályból, a zsíracil oldallánc szénatomjainak teljes számából és az oldallánc kettős kötéseinek számából állt: pl. PC(32:0), amely 32 szénatomszámú, kettős kötés nélküli foszfatidilkolint jelez.

4.2. A lipidkoncentráció változása a T-sejt aktiválására válaszul

A T-sejt receptoron keresztüli aktiválás mélyreható hatással van a transzkripciós és transzlációs aktivitásra. Annak vizsgálatára, hogy ezek a hatások hogyan tükröződnek a sejtes lipidek koncentrációjában, UPLC-MS-alapú lipidomikus analíziseket végeztünk ex vivo tenyésztett köldökzsinórvér CD4 + T-sejteken egy 72 órás idősoron, amely kilenc időpontból állt a lemezes aktiválást követően. kötődött anti-CD3 és oldható kostimuláló anti-CD28 antitestek. Az aktiválást az IL-4, a kulcsfontosságú Th2-t elősegítő citokin jelenlétében vagy hiányában végeztük annak elemzésére, hogy a citokin által indukált Th alcsoport differenciálódásnak van-e további kumulatív hatása ez idő alatt.

Összesen 67 lipidet sikerült mennyiségileg meghatározni az összes mintából. Ezen lipidek szabályozásának áttekintése érdekében hierarchikus klaszterezési analízist végeztünk mind a minta irányában, mind a lipidfajok időkinetikai tengelyében. Az eredmények azt mutatták, hogy a későbbi időpontok (48 és 72 óra) mutatták a legszembetűnőbb változásokat, míg a korábbi időpontok szorosabban csoportosultak egymáshoz (2. ábra). Az IL-4 stimuláció potenciális kumulatív hatása elhanyagolhatónak tűnt, és általában nem lehetett megbízhatóan megkülönböztetni a biológiai variációtól, így az időpont a minta irányú klaszterezés meghatározó tényezője.

A kinetikai irányú klaszterezés eredményeként az azonosított lipidek legalább négy különböző típusú szabályozást mutattak: a lipidek, amelyek eleinte felszabályozottak, de később csökkennek, a lipidek, amelyek az idősor vége felé növekednek, a lipidek, amelyek a lipidek csökkennek az idősor vége felé. végi idősorok, és amelyek viszonylag állandóak maradnak az idősoron keresztül. Az összes elemzett faj időbeli koncentrációprofiljait az 1. és 2. táblázat tartalmazza.

4.3. A PC és PE ​​zsírsavláncok hosszának és a telítettség mértékének változása az aktivált T-sejt fenotípusok kialakulása során

A klaszteranalízis azt mutatta, hogy a legkifejezettebb koncentrációváltozások a PC és PE ​​osztályú lipidfajtákhoz kapcsolódnak. Az eredmények közelebbi vizsgálata arra utalt, hogy a különbözően szabályozott klaszterek különböző zsírsav-összetételű lipidfajtákból álltak. Érdekes módon a 48. és 72. órában leszabályozott lipidek többszörösen telítetlen anyagokkal gazdagodtak, míg a felszabályozott lipidfajták átlagosan lényegesen kisebb mennyiségben tartalmaztak kettős kötést. A PC- és PE-zsírsavak mennyiségi változásainak, valamint a sejtmembrán-összetételre gyakorolt ​​lehetséges hatásaik további validálása érdekében a kísérletet különböző egyének köldökzsinórvér-mintáiból izolált sejtekkel reprodukáltuk. A lipidfajokat a megállapított munkafolyamat segítségével számszerűsítettük, így 34 PC és PE ​​fajt azonosítottak, amelyek megegyeztek az eredeti adatkészlettel.

A relatív bőség és a lipidtelítettség és az oldallánc hossz közötti összefüggés vizsgálata érdekében mind a 34 azonosított PC és PE ​​lipidet csoportosítottuk az oldallánc szénatomszáma (󖼴 vagy 󖾚) és az oldallánc kettős kötésszáma alapján. 𕟫 vagy 𕟶), és ezek kumulatív relatív koncentrációját számítjuk ki. Ezen lipidfajták idősoros elemzése összhangban volt azzal a megállapítással, hogy az aktivált sejtekben a rövidebb és kevésbé telített zsírsavakat általában előnyben részesítik a többszörösen telítetlen fajokkal szemben, és ezek a változások jelentősek a teljes lipidkoncentráció tekintetében, ami a zsírszövet fokozódó átalakulását eredményezi. sejtes lipidómát az aktiválást követő első 72 órában (3. ábra). A koncentrációváltozások specificitása az egyes lipidfajták szintjén is nyilvánvaló volt (4. ábra). A legkorábbi és legkésőbbi időpontok (0,5 és 72 óra) összehasonlításában a legjelentősebben felszabályozott PC-fajok viszonylag rövid láncúak és telítettek voltak (PC(30:0), PC(32:1), PC(32:2). ), és a PC(34:2)), míg a fajok (PC(38:4) és PC(O-38:5)) a legegyértelműbben csökkentek. Hasonló, bár kevésbé konzisztens tendencia volt a rövidebb és kevésbé telített lipidekre a PE osztályú lipideknél is. További szabályozási mintát figyeltek meg a plazmenil PC és PE ​​fajok különböző mértékű leszabályozásában.

4.4. A lipidanyagcsere transzkripciós szabályozása

Átfogó transzkriptomikai adatkészleteket tettek közzé a humán T-sejt-differenciációs modellből (14). A transzkripciós szabályozás lipidszint-változásokban betöltött szerepének értékelésére a transzkripciós méréseket a lipidomiai analízis eredményeivel korreláltuk. A hangsúly a lipidmetabolizmusban dokumentált szerepet játszó enzimeket kódoló géneken volt, amelyeket a KEGG adatbázisból származó annotációkkal soroltunk fel (3. táblázat) (15), kiegészítve a legújabb irodalomból származó kiegészítésekkel. E gének széles funkcionális osztályozása a zsírsavszintázok, deszaturázok, elongázok, acil-CoA szintetázok vagy foszfolipid aciltranszferázok és ezek ismert upstream szabályozói voltak.

Bár az enzimaktivitást nem kizárólag az mRNS-szint változása szabályozza, a zsírsav-szintetáz, az elongázok és a deszaturázok esetében a szabályozás elsősorban a transzkriptum szintjén megy végbe (16). Ezzel összhangban az eredmények azt mutatták, hogy az egyes funkcionális kategóriákon belül több enzim volt kitéve transzkripciós indukciónak és repressziónak egyaránt. Például az acetil-CoA karbolixáz a (ACACA), a palmitátszintézis kulcsenzimének expressziója egyértelműen indukálódott, bár a zsírsavszintáz (FASN) szintje viszonylag változatlan maradt. Különösen nagy változást figyeltek meg a sztearil-koenzim-A deszaturázt kódoló SCD génnél, amely a palmitinsav palmitoleinsavvá és a sztearinsav olajsavvá történő átalakulásáért felelős (5. ábra) Az SCD a zsírsavval együtt szabályozott deszaturázok FADS1 és FADS2, valamint elongáz ELOVL6, amelyek mindegyike mérsékelten emelkedett a T-sejt aktiválásával. A FADS1 és a FADS2 delta-5 és delta-6 deszaturázként működik. Az ELOVL6 viszont katalizálja a 16 szénatomos zsírsavak 18 szénatomossá való megnyúlását, és specifikus a telített palmitinsav szubsztrátra, ami sztearinsav képződését eredményezi, amelyet később SCD deszaturálhat. Ennek a génmodulnak az upstream szabályozói közé tartozik a PPAR a/RXR a útvonal, amely ugyanabban az időskálán belül a T-sejtekben is felszabályozott (17). Érdekes módon az ELOVL6 mellett a telített zsírsavakra is specifikus ELOVL1 expressziója indukáltnak tűnt, annak ellenére, hogy a PPAR a útvonal közvetlenül nem szabályozza.

Mind az endogénen szintetizált, mind az étrendből származó zsírsavak beépülése a foszfolipidekbe vagy de novo szintézis révén a Kennedy-útvonalon keresztül (18, 19), vagy a Lands-cikluson keresztül történő átmodellezés útján (20).A Kennedy-útvonal sebességkorlátozó reakcióját a foszfokolin-citidil-transzferáz (CT) katalizálja, amelynek aktivitását legalább részben a foszforiláció szabályozza (21). Ennek ellenére a PCYT2 gén egyértelmű indukcióját észlelték, amely a foszfoetanol-amin-citidil-transzferázt kódolja. A Lands-ciklusban a glicerofoszfolipid zsírsavláncok átalakulnak a foszfolipáz A 2 s (PLA 2 ) és a lizofoszfolipid aciltranszferáz (LPLAT) család enzimei által, amelyek közül az utóbbi egyértelmű preferenciákat mutat mind az akceptor phopsholipid fejcsoport, mind a szubsztrát fejcsoport tekintetében. oldallánc szerkezete. A microarray adatokban szereplő LPLAT próbák közül az LPCAT1 és LPCAT4 próbák finom felszabályozást jeleztek a legújabb időpontok felé. Az LPCAT1-et először olyan aciltranszferázként jellemezték, amely felelős a felületaktív dipalmitoil-PC alveoláris sejtekben történő létrehozásáért, és 16:0 acil-CoA-ra specifikus, míg az LPCAT4-et a közelmúltban 18:1-specifikus aciltranszferázként (22-24) írták le. Összességében a transzkriptomikai adatok alátámasztják azt a megfigyelést, hogy a T-sejt lipidóm aktívan és specifikusan szabályozott a TCR-stimulált sejtekben a funkcionálisan érett effektor alcsoportok fejlődése során.

Míg a CD4+ T-sejteket, valamint azok aktiválódását és differenciálódását viszonylag alaposan tanulmányozták a transzkriptomika, a proteomika és legutóbb az epigenetikai megközelítések szintjén, addig a korábbi lipidszintű vizsgálatok olyan kísérletekre korlátozódtak, amelyek specifikus molekulafajokat és lokális alcsoport tulajdonságait célozták meg. sejtrendszerek, mint például a T-sejt receptor környezet. Az aktivált effektor T-sejtek fejlődését eddig nem vizsgálták alaposan molekuláris lipidek szintjén. Jelen tanulmányunkban UPLC-MS alapú lipidomikus stratégiát alkalmaztunk humán köldökzsinórvér CD4 + T-sejtek analízisében mind stimulálatlan naïve állapotban, mind a T-sejt receptor által közvetített aktivációt követő 72 órás időtartamban. és az IL-4 által kiváltott Th2 differenciálódás. A köldökzsinórvér CD4+ sejtek a humán T helper sejtek egyik legna- gyobb módon megszerezhető populációját képviselik, vonzó modellrendszert biztosítva a humán T-sejtek korai aktiválódásának és polarizációjának tanulmányozásához.

A nem stimulált T helper prekurzor (Thp) sejtekből 41 sejtlipid koncentrációját katalogizáltuk, amelyek a leggyakoribb glicerofoszfolipidek, szfingomielinek és trigliceridek. Tudomásunk szerint ez a humán primer T-sejtek eddigi legátfogóbb lipidomikus jellemzése, annak ellenére, hogy az alacsonyabb abundanciájú fajok kimutatását az elsődleges sejtanyag korlátozott elérhetősége tiltotta. Ezenkívül néhány jelentős lipidosztály, például a foszfatidil-inozitolok (PI), a foszfatidil-szerinek (PS) és a koleszterin nem szerepelt az adatokban módszertani korlátok miatt. Ezen analitok egyike sem kompatibilis közvetlenül a pozitív elektrospray ionizációval, és MS-analízisük vagy derivatizálást, vagy alternatív ionizációs stratégiákat (ESI+) tesz szükségessé (10). A vizsgálatunk körén kívül eső egyéb figyelemre méltó kategóriák közé tartoznak a glikolipidek és a kardiolipin.

A lipidomikus analízist négy ismétlésben megismételtük több egyedből származó összevont primer sejtmintával, hogy figyelembe vegyük az étrendből és más környezeti tényezőkből adódó biológiai variabilitást. A relatív szórás mértéke a trigliceridek esetében volt a legnagyobb, míg a bőséges PC-fajták koncentrációja konzisztensebb mintát követett. A trigliceridek biztosítják a szervezet zsírsavak raktározását intracelluláris lipidcseppek formájában, és így vitathatatlanul az étrendi változtatások elsődleges alanyai. Zech és munkatársai nemrégiben vizsgálták egy rokon Jurkat T-sejtvonal lipidómát. (25). Ezen adatkészletek szisztematikus összehasonlítása nem mutatott alapvető különbségeket a foszfolipid bőség eloszlásában.

A celluláris foszfolipidek többsége a sejtmembránokban, elsősorban a plazmamembránban lokalizálódik, ahol eloszlásuk aszimmetrikus - a külső levél főleg szfingolipidekből, glikoszfingolipidekből és foszfatidil-kolinból áll, míg a belső lapot a glicerofoszfolipidek, például a foszfatidil-3-6-fatizin és a foszfatidil-3-6-fatidin ). Ezt a szervezetet a foszfolipid flippáz enzimek tartják fenn aktívan (32). Ezenkívül a plazmamembrán lipidjei laterálisan oszlanak el koleszterinben és glikoszfingolipidben dúsított mikrodoménekben vagy "lipid tutajokban", amelyek külön lipidkörnyezetet biztosítanak a transzmembrán fehérjekomplexek számára (33, 34). A T-sejtekben ezek a lipid-mikrodomének fontos szerepet játszanak a T-sejt-receptorok által közvetített aktiválásban, egyesítve a LAT-t, az LCK-t és a stimuláló receptorokat, miközben izolálják a gátló molekulákat, például a CD45-öt (5). Elméletileg ezt a mikrodomain szerveződést a kapcsolószerű jelátvitel elősegítésére javasolták, ahol az aktiválási sebesség viszonylag állandó marad még akkor is, ha az antigénstimuláció egy bizonyos küszöbön belül változik (34). Bár kimutatták, hogy a T-sejt-receptor klaszterezés mechanizmusai fehérjekölcsönhatások által szabályozottak, a T-sejt-eredetű HIV-részecskék, valamint az immunizolált TCR-raft frakciók közvetlen lipidomikus analízise igazolta, hogy a TCR membránfrakció fizikailag különbözik a plazmamembrántól, és viszonylag gazdag SM-ben, koleszterinben és telített PC-kben (35, 36). Ezenkívül a stimulált emissziós kimerülés (STED) fluoreszcens mikroszkóppal a közelmúltban sikeresen megfigyelték a szfingolipidek és a koleszterin oldalirányú szerveződését élő sejtekben is (37).

Bár a lipidek szubcelluláris eloszlása ​​túlmutat e vizsgálat keretein, számos glicerofoszfolipid szintjében jelentős változásokat tudtunk mérni a T-sejt aktiválást követően. Általánosságban elmondható, hogy a hosszabb, többszörösen telítetlen glicerofoszfolipidek relatív koncentrációja csökkent a mért idősor vége felé, míg a rövidebb, telítettebb lipidfajták 48 és 72 óra elteltével egyértelműen megfelelő növekedést mutattak. Ez az időskála korrelál az aktiválás utáni sejtosztódás első fordulóival, ami arra utal, hogy az újonnan generált leánysejtek membrántulajdonságai eltérnek a nem stimulált progenitorokétól. Az egyes lipidfajok relatív koncentrációjának szintjén ezek a változások a PC-k (30:0), (32:1) és (32:2), valamint a PE-k (38:3) és ( 34:2), valamint a PC-k (38:4) és (O-38:5), valamint a PE-k (O-38:7) és (O-38:4) relatív csökkenése. Mivel az emlősök zsírsav-bioszintézise túlnyomórészt 14-18 szénatomos és alacsony telítettségű fajokat hoz létre (38), feltehető, hogy a megfigyelt lipidkoncentráció-változások az endogén zsírsav-bioszintézis fokozódását és az étkezési zsírsav relatív csökkenését tükrözik a sejtekben. membránok. Érdekes módon a makrofágokban a PC-szintézisről kimutatták, hogy előfeltétele a citokin-szekréciónak (39).

A legújabb jelentések kimutatták, hogy a tutajhoz kapcsolódó lipidek, például a gangliozid GM1, a laktozilceramid, a glükozilceramid, a ceramid, a szfingomielin és a koleszterin expressziója a TCR-en és a CD28-on (40-43) keresztül történő aktiválás hatására felfelé szabályozódik. Legalábbis a GM1 és a koleszterin esetében az upreguláció a fokozott de novo szintézistől függ (41, 43). Ezen megfigyelések fényében felmerül a kérdés, hogy a jelen adatokban megfigyelt lipidomikus változások a tutajkomponensek felszabályozását is tükrözik-e. Konkrétan az 1 vagy 0 kettős kötést és 34 vagy kevesebb zsírsav szénatomot tartalmazó telített PC-fajtákról számoltak be, hogy feldúsultak a TCR tutajokban, míg a hosszabb és kevésbé telített fajok kimerültek a teljes lipidomhoz képest (36). A legjelentősebben dúsított PC fajok (34:1), (32:0) és (30:0) közül azonban csak (30:0) volt egyértelműen felszabályozott az adataink. Ezenkívül Zech et al. nem mutat semmilyen telített PE-fajták feldúsulását a TCR-frakciókban. Összességében nem volt nyilvánvaló, hogy a TCR raftokkal való kapcsolat megmagyarázná az összes megfigyelt TCR-indukált változást az elsődleges T-sejt lipidómában.

Az aktivált T-sejtek nagymértékben megnövekedett metabolikus igényeire a glükóz katabolizmus oxidatív foszforilációról glikolízisre való eltolódása rávilágít. Ezt a reverzibilis átmenetet az úgynevezett Warburg-metabolizmusra úgy javasolták, hogy a sejt maximalizálja az új biomassza felhalmozódását nem korlátozó glükózkoncentráció mellett (44), és ez összefüggésben áll az aktivált sejtekben a tápanyagfelvétel fokozásával. Ez a mechanizmus az aktivált T-sejtek rendkívül megnövekedett proliferációs rátájával függ össze, és jellemzően rákos sejtek is alkalmazzák. A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy mellrák esetén a Warburg-effektus a de novo zsírsavszintézis fokozódásával, és ezt követően a plazmamembrán tulajdonságainak megváltozásával jár együtt (45). Többek között a PC(14:0/16:0) koncentrációja következetesen emelkedett a tumorsejtekben, és összefüggésbe hozható a tumor progressziójával, ami hasonlít a PC(30:0) megfigyelt relatív növekedéséhez az aktivált T-sejtekben.

Az aktivált T-sejtek transzkriptomikus szabályozását egy azonos kísérleti rendszerben már korábban is vizsgálták (14). Bár a lipidmetabolizmus szabályozási útvonalai összetettek és még mindig nem teljesen ismertek, az mRNS és a lipid adatkészletek integrációja számos lehetséges szabályozó mechanizmust biztosított, amelyek a T-sejt aktivációra reagálnak. A legszembetűnőbb, hogy a sztearoil-CoA-deszaturáz (SCD) gén expressziója jelentősen megnőtt az aktivált sejtekben. Az SCD katalizálja a 16:0 és 18:0 arányú zsírsavak n-9 deszaturációját, és a zsírsav-anyagcsere szabályozó csomópontja, amit kiemel az a tény, hogy az SCD-knockout egerek lipidszintézise súlyosan károsodott (46). Érdekes módon az M-CSF által kiváltott makrofágok differenciálódásában az SCD növeli az egyszeresen telítetlen zsírsavakat, és a többszörösen telítetlen zsírsavak mennyiségének csökkenéséhez vezet (47). Az SCD-t az SREBP-1/2, LXRα, RXRα és PPARα(48, 49) szabályozzák. Ezek közül mind az RXRα, mind a PPARα mérsékelten felszabályozott a TCR-aktiváció hatására humán CD4+ T-sejtekben, ami egy lehetséges szabályozási útvonalat biztosít. Az SCD mellett a FADS1 és FADS2 deszaturázok is indukálódtak a T-sejt aktiválásra adott válaszként, valamint az ELOVL6 elongáz. Kimutatták, hogy az ELOVL6, ELOVL3 és SCD egy olyan szabályozási hálózat részét képezik, amely szabályozza a lipid homeosztázist (16, 49). Ezek a kialakuló szabályozó tulajdonságok potenciálisan az aktivált T-sejtekben megfigyelhető specifikus koncentrációváltozások hátterében is állhatnak. A zsírsavszintézis utak enzimjein kívül a glicerofoszfolipid metabolizmus szabályozásában is kimutatható néhány változás. Nevezetesen, a Pcyt2 és a specifikus lizofoszfolipid acetiltranszferázok növekedése arra utal, hogy a T-sejt lipid összetétele több szinten is specifikusan szabályozható.

A jelen adatok szerint az IL-4 jelenlétében vagy hiányában stimulált sejtekben a lipid kinetika közel azonos volt, ami arra utal, hogy a TCR-aktiváció lényegesen erősebb jelet ad a metabolikus változás tekintetében. Ez összhangban van korábbi transzkriptom és proteomszintű vizsgálatainkkal, amelyekben mélyreható változásokat mértek a T-sejt aktivációra adott válaszként, míg a citokin által kiváltott T-sejt-alcsoport differenciálódás határozottabb választ jelentett (14, 50, 51). Azonban Miguel et al. a közelmúltban kimutatták a humán primer CD4 + T-sejt plazmamembrán szerveződésének heterogenitását, aminek következményei vannak az aktiválódás és az apoptózis sejtküszöbére, ami arra utal, hogy a Th2-polarizált sejtek magasabb szintű membránrendet tartanak meg a Th1-populációhoz képest, amint azt fluoreszcens membrán segítségével értékelték. szondák (13). Globális megközelítésünk sajnos nem tette lehetővé ezen eredmények kvantitatív validálását. Nevezetesen, az mTOR szerepe a T-sejt-metabolizmus központi szabályozójaként egyre inkább felértékelődik. A többféle környezeti jelzés integrálója, az mTOR szabályozza a sejtnövekedést mind térben, mind időben (52, 53). A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a környezeti jelek mTOR általi integrációja emellett részt vesz a T helper sejtek alcsoportjainak differenciálódásában (54). Tágabb összefüggésben a nukleotid bioszintézis zavarairól kimutatták, hogy torzítja a Th1/Th2 egyensúlyt, ami további bizonyítékot szolgáltat a T helper sejt alcsoportjaiban elkülönülő metabolikus útvonalakra (55). A metabolomikus szabályozás mértéke és pontos szerepe a T-sejt alcsoportok differenciálódása során ezért további vizsgálatokat igényel.

Összességében a jelen adatok szemléltetik a humán T-sejt lipidösszetétel figyelemreméltó plaszticitását a T-sejt-receptor és a CD28-útvonalak stimulálása általi aktiválásra adott válaszként. A transzkriptomikai adatok arra utalnak, hogy ezt a plaszticitást RNS-szinten szabályozza a zsírsav-bioszintetikus útvonalak aktiválása, ami a de novo termelt zsírsavak fokozott beépülését eredményezi a plazmamembránba. Míg a foszfolipidtelítettség csökkenése általában összefüggésben áll a membránok áramlásának csökkenésével (56), még tisztázni kell, hogy az ebben a vizsgálatban megfigyelt változásoknak van-e konkrét funkcionális következménye a membránfunkcióra. Fontos, hogy a humán zsírsejtekre vonatkozó legújabb adatok azt mutatják, hogy a membrán biofizikai tulajdonságai a membrán lipid komponenseinek átalakulása ellenére is aktívan fenntarthatók (57). A specifikus sejtrendszerekkel, például a T-sejtekkel kapcsolatban a lipidek térbeli szabályozásával kapcsolatos fontos információk nyerhetők különálló szubcelluláris kompartmentek párhuzamos elemzésével. Minden egyes lipidmembrán kettős réteggel határolt organellum, mint például az endoplazmatikus retikulum (ER), a Golgi-készülék és a mitokondriumok, jellegzetes lipidösszetételt fejez ki, amelyet aktívan szabályoz a lokalizált szintézis és lipidtranszport. Ezért egy specifikus sejtkompartment szelektív kiterjesztése vagy csökkentése állhat az ebben a tanulmányban megfigyelt lipidomikus változások mögött. A legújabb jelentések szerint mind a mitokondriumok, mind az ER mennyiségét a makroautofágia szabályozza a T-sejtek fejlődése során, ami jelentősen csökkenti a mitokondriális és ER-tartalmat az érett perifériás T-sejtekben (58, 59). A TCR-aktivált sejtekben a makroautofágia tovább indukálódik, de elsősorban az oldható citoszol komponenseket célozza meg, és mind a mitokondriális szám, mind a méret mérsékelt növekedésével korrelál (60). Ezenkívül kimutatták, hogy az emberi sejtek különböző citoplazmatikus és nukleáris foszfatidilkolin-készleteket tartalmaznak, amelyek közül az utóbbi túlnyomórészt telített, és potenciálisan szerkezeti szerepet tölt be a kromatinnal kapcsolatban (61). Az ilyen célzott lipidomikus megközelítések azonban továbbra is megfelelő sejtfrakcionálási módszereket igényelnek (62). A jelenlegi tanulmány eredményei hasznos keretet biztosítanak az ilyen vizsgálatokhoz.

Riitta Lahesmaa és Matej Oresic egyformán hozzájárultak ehhez a kézirathoz. Ezúton szeretnénk köszönetet mondani minden önkéntes véradónak, a Turku Egyetemi Kórház Szülészeti és Nőgyógyászati ​​Osztályának (Délnyugat-Finnország kórházi körzetének) dolgozóinak a mintagyűjtésért. A munkát a Finn Akadémia (Molekuláris Rendszerek Immunológiai és Élettani Kutatási Kiválósági Központja, 2012-2017, 250114 számú határozat, valamint 207490 SYSBIO, 116639, 115939, 140019 támogatások), az Európai Bizottság Seventh (FECrame Seventh) támogatta. -FP7-SYBILLA-201106, EC-FP7-NANOMMUNE-214281 és EC-FP7-DIABIMMUNE-202063), JDRF, a Sigrid Juselius Alapítvány, a Turku Egyetemi Kórházi támogatás és a Turku Egyetemi Alapítvány. Marjo Hakkarainen elismert ügyes technikai segítségnyújtásáért. Dr. Robert Moulder elismerést kap a kézirat nyelvezetének átdolgozásáért.

1. G. E. Kaiko, J. C. Horvat, K. W. Beagley és P. M. Hansbro: Immunológiai döntéshozatal: hogyan dönt az immunrendszer a segítő T-sejtes válasz létrehozása mellett? Immunology, 123, 326-338 (2008)
http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2567.2007.02719.x

2. J. Zhu és W. E. Paul: CD4 T-sejtek: sorsok, funkciók és hibák. Blood, 112(5), 1557-69 (2008)
http://dx.doi.org/10.1182/blood-2008-05-078154

3. J. Zhu, H. Yamane és W. E. Paul: Differenciation of effektor CD4 T sejtpopulációk. Annu Rev Immunol, 28, 445-89 (2010)
http://dx.doi.org/10.1146/annurev-immunol-030409-101212

4. O. Acuto, V. Di Bartolo és F. Michel: T-sejt-receptor jelek testreszabása proximális negatív visszacsatolási mechanizmusokkal. Nat Rev Immunol, 8(9), 699-712 (2008)
http://dx.doi.org/10.1038/nri2397

5. J. E. Smith-Garvin, G. A. Koretzky és M. S. Jordan: T sejt aktiváció. Annu Rev Immunol, 27, 591-619 (2009)
http://dx.doi.org/10.1146/annurev.immunol.021908.132706

6. P. A. van der Merwe és O. Dushek: Mechanisms for T cell receptor triggering. Nat Rev Immunol, 11, 47-55 (2011)
http://dx.doi.org/10.1038/nri2887

7. V. Mayya, D. H. Lundgren, S. I. Hwang, K. Rezaul, L. Wu, J. K. Eng, V. Rodionov és D. K. Han: A T-sejt-receptor jelátvitel kvantitatív foszfoproteomikai elemzése feltárja a fehérje-fehérje kölcsönhatások rendszerszintű modulációját. Sci Signal, 2(84), ra46 (2009)
http://dx.doi.org/10.1126/scisignal.2000007

8. RJ Lund, M. Loytomaki, T. Naumanen, C. Dixon, Z. Chen, H. Ahlfors, S. Tuomela, J. Tahvanainen, J. Scheinin, T. Henttinen, O. Rasool és R. Lahesmaa: Genome - a korai Th1 és Th2 sejtek differenciálódásában szerepet játszó új gének széles körű azonosítása. J Immunol, 178(6), 3648-60 (2007)

9. M. Oresic, V. A. Hanninen és A. Vidal-Puig: Lipidomics: a new window to biomedical borders. Trends in Biotechnology, 26(12), 647-652 (2008)
http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2008.09.001

10. M. Pulfer és R. C. Murphy: Electrospray tömegspektrometria foszfolipidekről. Mass Spectrom Rev, 22(5), 332-64 (2003)
http://dx.doi.org/10.1002/mas.10061

11. M. R. Wenk: Lipidomika: új eszközök és alkalmazások. Cell, 143, 888-895 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2010.11.033

12. Y. H. Huang és K. Sauer: Lipid jelátvitel a T-sejtek fejlődésében és működésében. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(11), a002428 (2010)
http://dx.doi.org/10.1101/cshperspect.a002428

13. L. Miguel, D. M. Owen, C. Lim, C. Liebig, J. Evans, A. I. Magee és E. C. Esküdtszék: Az elsődleges humán CD4+ T-sejtek membránlipidrendjének változatos szintjei vannak, amelyek korrelálnak funkciójukkal. J Immunol, 186, 3505-3516 (2011)
http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.1002980

14. LL Elo, H. Jarvenpaa, S. Tuomela, S. Raghav, H. Ahlfors, K. Laurila, B. Gupta, RJ Lund, J. Tahvanainen, RD Hawkins, M. Oresic, H. Lahdesmaki, O. Rasool , KV Rao, T. Aittokallio és R. Lahesmaa: Genome-wide profiling of interleukin-4 and STAT6 transzkripciós faktor szabályozása humán Th2 sejtprogramozásban. Immunity, 32(6), 852-62 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2010.06.011

15.M. Kanehisa és S. Goto: KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res, 28(1), 27-30 (2000)
http://dx.doi.org/10.1093/nar/28.1.27

16. H. Guillou, D. Zadravec, P. G. Martin és A. Jacobsson: Az elongázok és deszaturázok kulcsszerepe az emlősök zsírsav-anyagcseréjében: Insights from transgenic moce. Prog Lipid Res, 49(2), 186-99 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.plipres.2009.12.002

17. M. Miyazaki és J. M. Ntambi: A sztearoil-koenzim A deszaturáz szerepe a lipid metabolizmusban. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 68(2), 113-21 (2003)
http://dx.doi.org/10.1016/S0952-3278(02)00261-2

18. E. P. Kennedy és S. B. Weiss: A citidin koenzimek funkciója a foszfolipidek bioszintézisében. J Biol Chem, 222(1), 193-214 (1956)

19. E. P. Kennedy: Komplex lipidek bioszintézise. Fed Proc, 20, 934-40 (1961)

20. W. E. Lands: Metabolism of glycerolipides a lecitin and triglycerid synthesis összehasonlítása. J Biol Chem, 231(2), 883-8 (1958)

21. H. Sugimoto, C. Banchio és D. E. Vance: A foszfatidilkolin bioszintézisének transzkripciós szabályozása. Prog Lipid Res, 47(3), 204-20 (2008)
http://dx.doi.org/10.1016/j.plipres.2008.01.002

22. H. Nakanishi, H. Shindou, D. Hishikawa, T. Harayama, R. Ogasawara, A. Suwabe, R. Taguchi és T. Shimizu: Az egértüdő típusú acil-CoA:lizofoszfatidilkolin-aciltranszferáz 1 klónozása és jellemzése LPCAT1). Kifejezés II-es típusú alveoláris sejtekben és lehetséges részvétel a felületaktív anyagok termelésében. J Biol Chem, 281(29), 20140-7 (2006)
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M600225200

23. X. Chen, B. A. Hyatt, M. L. Mucenski, R. J. Mason és J. M. Shannon: Lizofoszfatidilkolin-aciltranszferáz azonosítása és jellemzése II-es típusú alveoláris sejtekben. Proc Natl Acad Sci USA, 103(31), 11724-9 (2006)
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0604946103

24. D. Hishikawa, H. Shindou, S. Kobayashi, H. Nakanishi, R. Taguchi és T. Shimizu: A membrán aszimmetriájához és diverzitásához elengedhetetlen lizofoszfolipid aciltranszferáz család felfedezése. Proc Natl Acad Sci USA, 105(8), 2830-5 (2008)
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0712245105

25. T. Zech, C. S. Ejsing, K. Gaus, B. de Wet, A. Shevchenko, K. Simons és T. Harder: Accumulation of raft lipids in T-cell plasmamembrane domains engaged in TCR signalling. EMBO J, 28(5), 466-76 (2009)
http://dx.doi.org/10.1038/emboj.2009.6

26. G. van Meer: Cellular lipidomics. The EMBO Journal, 24(18), 3159-3165 (2005)
http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600798

27. A. Zachowski: Foszfolipidek állati eukarióta membránokban: keresztirányú aszimmetria és mozgás. Biochem J, 294 (Pt 1), 1-14 (1993)

28. X. Han és R. W. Gross: Shotgun lipidomics: electrospray ionization tömegspektrometriás elemzés és sejt lipidómák mennyiségi meghatározása közvetlenül biológiai minták nyers kivonataiból. Mass Spectrom Rev, 24(3), 367-412 (2005)
http://dx.doi.org/10.1002/mas.20023

29. Y. Lange, M. H. Swaisgood, B. V. Ramos és T. L. Steck: A plazmamembránok a foszfolipid felét és a koleszterin és a szfingomielin 90%-át tartalmazzák a tenyésztett humán fibroblasztokban. J Biol Chem, 264(7), 3786-93 (1989)

30. D. E. Warnock, C. Roberts, M. S. Lutz, W. A. ​​Blackburn, W. W. Young, Jr. és J. U. Baenziger: A plazmamembrán lipid tömegének és összetételének meghatározása tenyésztett kínai hörcsög petefészeksejtekben nagy gradiens mágneses affinitású kromatográfiával. J Biol Chem, 268(14), 10145-53 (1993)

31. A. Sevcsenko és K. Simons: Lipidomika: a lipiddiverzitás megszerzése. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(8), 593-8 (2010)
http://dx.doi.org/10.1038/nrm2934

32. X. Tang, M. S. Halleck, R. A. Schlegel és P. Williamson: A P-típusú ATPázok alcsaládja aminofoszfolipidet szállító aktivitással. Science, 272 (5267), 1495-7 (1996)
http://dx.doi.org/10.1126/science.272.5267.1495

33. T. Harder és K. R. Engelhardt: Membrándomének a limfocitákban - lipid tutajoktól fehérje állványokig. Traffic, 5(4), 265-75 (2004)
http://dx.doi.org/10.1111/j.1600-0854.2003.00163.x

34. K. Choudhuri és M. L. Dustin: Signaling microdomains in T cell. FEBS Lett, 584(24), 4823-31 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2010.10.015

35. B. Brugger, B. Glass, P. Haberkant, I. Leibrecht, F. T. Wieland és H. G. Krausslich: A HIV lipidóm: szokatlan összetételű tutaj. Proc Natl Acad Sci USA, 103(8), 2641-6 (2006)
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0511136103

36. T. Zech, C. S. Ejsing, K. Gaus, B. de Wet, A. Shevchenko, K. Simons és T. Harder: Accumulation of raft lipids in T-cell plasmamembrane domains engaged in TCR signalling. The EMBO Journal, 28(5), 466-476 (2009)
http://dx.doi.org/10.1038/emboj.2009.6

37. C. Eggeling, C. Ringemann, R. Medda, G. Schwarzmann, K. Sandhoff, S. Polyakova, VN Belov, B. Hein, C. von Middendorff, A. Schonle és SW Hell: A nanoskála közvetlen megfigyelése membránlipidek dinamikája élő sejtben. Nature, 457 (7233), 1159-62 (2009)
http://dx.doi.org/10.1038/nature07596

38. S. Smith: Az állati zsírsav szintáz: egy gén, egy polipeptid, hét enzim. FASEB J, 8(15), 1248-59 (1994)

39. Y. Tian, ​​C. Pate, A. Andreolotti, L. Wang, E. Tuomanen, K. Boyd, E. Claro és S. Jackowski: A citokinszekrécióhoz foszfatidilkolin szintézis szükséges. J Cell Biol, 181(6) 945-957 (2008)
http://dx.doi.org/10.1083/jcb.200706152

40. M. Martin, H. Schneider, A. Azouz és C. E. Rudd: A citotoxikus T limfocita antigén 4 és a CD28 modulálja a sejtfelszíni raft expresszióját a T-sejt funkció szabályozásában. J Exp Med, 194(11), 1675-81 (2001)
http://dx.doi.org/10.1084/jem.194.11.1675

41. L. Tuosto, I. Parolini, S. Schroder, M. Sargiacomo, A. Lanzavecchia és A. Viola: Plazmamembrán funkcionális raftok szervezése T-sejt aktiváláskor. Eur J Immunol, 31(2), 345-9 (2001)
http://dx.doi.org/10.1002/1521-4141(200102)31:2<345::AID-IMMU345>3.0.CO2-L

42. S. Tani-ichi, K. Maruyama, N. Kondo, M. Nagafuku, K. Kabayama, J. Inokuchi, Y. Shimada, Y. Ohno-Iwashita, H. Yagita, S. Kawano és A. Kosugi: A lipid tutajok szerkezete és funkciója humán aktivált T-sejtekben. Int Immunol, 17(6), 749-58 (2005)
http://dx.doi.org/10.1093/intimm/dxh257

43. SJ Bensinger, MN Bradley, SB Joseph, N. Zelcer, EM Janssen, MA Hausner, R. Shih, JS Parks, PA Edwards, BD Jamieson és P. Tontonoz: Az LXR jelátvitel összekapcsolja a szterin metabolizmusát a proliferációval a szerzett immunválaszban . Cell, 134(1), 97-111 (2008)
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2008.04.052

44. M. G. Vander Heiden, L. C. Cantley és C. B. Thompson: Understanding the Warburg-effektus: a sejtproliferáció metabolikus követelményei. Science, 324 (5930), 1029-33 (2009)
http://dx.doi.org/10.1126/science.1160809

45. M. Hilvo, C. Denkert, L. Lehtinen, B. Muller, S. Brockmoller, T. Seppanen-Laakso, J. Budczies, E. Bucher, L. Yetukuri, S. Castillo, E. Berg, H. Nygren, M. Sysi-Aho, JL Griffin, O. Fiehn, S. Loibl, C. Richter-Ehrenstein, C. Radke, T. Hyotylainen, O. Kallioniemi, K. Iljin és M. Oresic: Újszerű teranosztikus lehetőségek, amelyeket kínál a megváltozott membrán lipid metabolizmus jellemzése az emlőrák progressziójában. Cancer Res, 71(9), 3236-45 (2011)
http://dx.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-10-3894

46. ​​C. M. Paton és J. M. Ntambi: A sztearoil-CoA deszaturáz biokémiai és fiziológiai funkciója. Am J Physiol Endocrinol Metab, 297(1), E28-37 (2009)
http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.90897.2008

47. J. Ecker, G. Liebisch, M. Grandl és G. Schmitz: Az alacsonyabb SCD expresszió dendritikus sejtekben a makrofágokhoz képest kevesebb egyszeresen telítetlen zsírsavat tartalmazó membránlipidekhez vezet. Immunobiology, 215(9-10), 748-55 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.imbio.2010.05.016

48. J. Ecker, G. Liebisch, M. Englmaier, M. Grandl, H. Robenek és G. Schmitz: A zsírsavszintézis indukciója kulcsfontosságú követelmény a humán monociták fagocitális differenciálódásában. Proc Natl Acad Sci U S A, 107(17), 7817-22 (2010)
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0912059107

49. C. D. Green, C. G. Ozguden-Akkoc, Y. Wang, D. B. Jump és L. K. Olson: Role of fatty acid elongases in determination of de novo synthesized monounsaturated fatty acid species. J Lipid Res, 51(7), 1871-7 (2010)
http://dx.doi.org/10.1194/jlr.M004747

50. R. J. Lund, E. K. Ylikoski, T. Aittokallio, O. Nevalainen és R. Lahesmaa: Th1 és Th2 sejtek limfocita polarizációjában részt vevő gének kinetikája és STAT4- vagy STAT6-mediált szabályozása. European Journal of Immunology, 33(4), 1105-1116 (2003)
http://dx.doi.org/10.1002/eji.200323899

51. R. Moulder, T. Lonnberg, LL Elo, JJ Filen, E. Rainio, G. Corthals, M. Oresic, TA Nyman, T. Aittokallio és R. Lahesmaa: Humán CD4+ sejtek nukleáris frakciójának kvantitatív proteomikai elemzése az IL-4 által kiváltott Th2 differenciálódás korai fázisában. Mol Cell Proteomics, 9(9), 1937-53 (2010)
http://dx.doi.org/10.1074/mcp.M900483-MCP200

52. J. D. Powell és G. M. Delgoffe: A rapamicin emlős célpontja: a T-sejtek differenciálódása, funkciója és anyagcseréje összekapcsolása. Immunity, 33(3), 301-11 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2010.09.002

53. S. Wullschleger, R. Loewith és M. N. Hall: TOR jelátvitel a növekedésben és az anyagcserében. Cell, 124(3), 471-84 (2006)
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2006.01.016

54. K. Lee, P. Gudapati, S. Dragovic, C. Spencer, S. Joyce, N. Killeen, MA Magnuson és M. Boothby: A 2-es rapamicin protein komplex emlős célpontja szabályozza a Th1 és Th2 sejtalcsoportok differenciálódását különböző módon jelzőutak. Immunity, 32(6), 743-53 (2010)
http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2010.06.002

55. P. Dimitrova, A. Skapenko, M. L. Herrmann, R. Schleyerbach, J. R. Kalden és H. Schulze-Koops: A de novo pirimidin bioszintézis korlátozása gátolja a Th1 sejtaktivációt és elősegíti a Th2 sejt differenciálódását. J Immunol, 169(6), 3392-9 (2002)

56. C. D. Stubbs és A. D. Smith: Az emlős membrán többszörösen telítetlen zsírsav-összetételének módosítása a membrán folyékonyságával és működésével kapcsolatban. Biochim Biophys Acta, 779(1), 89-137 (1984)

57. KH Pietilainen, T. Rog, T. Seppanen-Laakso, S. Virtue, P. Gopalacharyulu, J. Tang, S. Rodriguez-Cuenca, A. Maciejewski, J. Naukkarinen, AL Ruskeepaa, PS Niemela, L. Yetukuri , CY Tan, V. Velagapudi, S. Castillo, H. Nygren, T. Hyotylainen, A. Rissanen, J. Kaprio, H. Yki-Jarvinen, I. Vattulainen, A. Vidal-Puig és M. Oresic: Association of lipidom átépülése a zsírsejtek membránjában szerzett elhízással emberekben. PLoS Biol, 9(6), e1000623 (2011)
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1000623

58. H. H. Pua, J. Guo, M. Komatsu és Y. W. He: Az autofágia elengedhetetlen a mitokondriális kiürüléshez érett T-limfocitákban. J Immunol, 182(7), 4046-55 (2009)
http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.0801143

59. W. Jia, H. H. Pua, Q. J. Li és Y. W. He: Az autofágia szabályozza az endoplazmatikus retikulum homeosztázist és a kalcium mobilizációt T limfocitákban. J Immunol, 186(3), 1564-74 (2011)
http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.1001822

60. V. M. Hubbard, R. Valdor, B. Patel, R. Singh, A. M. Cuervo és F. Macian: A makroautofágia szabályozza az energiametabolizmust az effektor T-sejt aktiválása során. J Immunol, 185(12), 7349-57 (2010)
http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.1000576

61. A. N. Hunt, G. T. Clark, G. S. Attard és A. D. Postle: Az erősen telített endonukleáris foszfatidilkolint in situ szintetizálják, és CDP-kolin útvonal enzimekkel helyezik el. J Biol Chem, 276(11), 8492-9 (2001)
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M009878200

62. G. van Meer: Cellular lipidomics. EMBO J, 24(18), 3159-65 (2005)
http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600798

63. K. J. Rautajoki, E. M. Marttila, T. A. Nyman és R. Lahesmaa: Az interleukin-4 gátolja a kaszpáz-3-at azáltal, hogy számos fehérjét szabályoz a Fas útvonalon a humán T helper 2 sejtdifferenciáció kezdeti szakaszában. Molecular & Cellular Proteomics, 6(2), 238-251 (2007)
http://dx.doi.org/10.1074/mcp.M600290-MCP200

64. W. de Koning és K. van Dam: Módszer az élesztőben lévő glikolitikus metabolitok változásának meghatározására egy másodperc alatti időskálán, semleges pH-n történő extrakcióval. Anal Biochem, 204(1), 118-23 (1992)
http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(92)90149-2

65. KH Pietilainen, M. Sysi-Aho, A. Rissanen, T. Seppanen-Laakso, H. Yki-Jarvinen, J. Kaprio és M. Oresic: A szerzett elhízás összefüggésbe hozható a szérum lipidémiás profiljának genetikai hatásoktól független változásaival - Monozigóta ikervizsgálat. PLoS ONE, 2(2), e218 (2007)
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0000218

66. T. Pluskal, S. Castillo, A. Villar-Briones és M. Oresic: MZmine 2: Moduláris keretrendszer tömegspektrometrián alapuló molekuláris profiladatok feldolgozásához, megjelenítéséhez és elemzéséhez. Bmc Bioinformatika, 11 (2010)

67. R. Laaksonen, M. Katajamaa, H. Paiva, M. Sysi-Aho, L. Saarinen, P. Junni, D. Lutjohann, J. Smet, R. Van Coster, T. Seppanen-Laakso, T. Lehtimaki , J. Soini és M. Oresic: A rendszerbiológiai stratégia biológiai útvonalakat és plazma biomarker jelölteket tár fel a potenciálisan toxikus sztatinok által kiváltott izomváltozásokhoz. PLoS One, 1(1), e97 (2006)
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0000097

Kulcsszavak: Lipid anyagcsere, metabolizmus, T-sejt receptor aktiváció, T helper sejt differenciálódás


Nézd meg a videót: Érettségi 2019 Biológia: Kapcsolt öröklődés, mennyiségi jellegek öröklődése (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Samuro

    Thank you so much for your support, how can I thank you?

  2. Gabor

    Not bad topic

  3. Reid

    Szerintem ez a zseniális kifejezés



Írj egy üzenetet