Információ

Hogyan válhat egy növény ellenállóvá a glufozináttal szemben?

Hogyan válhat egy növény ellenállóvá a glufozináttal szemben?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

A Wikipédiából a glufozinát nem szelektív gyomirtó hatásmechanizmusa a következő:

A foszfinotricin egy glutamin-szintetáz inhibitor, amely a glutamát helyhez kötődik. A glufozináttal kezelt növények elpusztulnak az ammónia felhalmozódása és ennek megfelelő pH-csökkenés miatt a tilakoid lumenben, ami a fotofoszforiláció szétválásához vezet. A fotofoszforiláció szétkapcsolása reaktív oxigénfajták képződését, lipidperoxidációt és membránpusztulást okoz.

A Kaliforniai Egyetem e cikkében (Gyomirtás, kezelés, ökológia és apróságok) ez áll:

A malajziai kutatók néhány évvel ezelőtt beszámoltak a glufozináttal szemben rezisztens libafű populációjáról zöldség- és gyümölcsösrendszerekben (Lee LJ & Ngim J (2000). Az első jelentés a glifozát-rezisztens lúdfűről (Eleusine indica (L) Gaertn) Malajziában). Pest Management Science, 56, 336-339). Évekig ez volt az egyetlen bejelentett eset, amikor rezisztenciát mutattak ki ezzel a gyomirtó szerrel szemben.

Minek kellene történnie a gyomban, hogy ellenállóvá váljon ezzel a vegyszerrel/hatásmóddal szemben, és mi indítja el ezt a folyamatot?


A foszfinotricin a baktériumok metabolitja Streptomyces viridochromogenes amely egy foszfinotricin N-acetiltranszferáz (PAT) nevű fehérjét tartalmaz. Ez a fehérje inaktiválja a foszfinotricint, ami ennek az oka S. viridochromogenes nem hal meg tőle. Ha azt szeretné, hogy egy növény rezisztens legyen a foszfinotricinnel szemben, hozzáadhatja a PAT fehérje génjét a növény genomjához. Ez a gyomirtószer-toleráns költészetről szóló cikk is leírja.

A rezisztens lúdfű magyarázata az lehet, hogy valahogy megkapta a PAT gént, talán vízszintes gentranszferrel S. viridochromogenes.

Az Ön esetében a forrásban hivatkozott publikáció egy másik lehetőséget is tartalmaz. "Feltételezésünk szerint a csökkent herbicid-transzlokáció felelős a glifozáttal és a glufozináttal szembeni rezisztenciáért ezekben a populációkban"


DD1998-22: Az AgrEvo Canada Inc. glufozinát-ammóniumtoleráns kukorica biztonságosságának meghatározása (Zea mays) vonalak, T14 és T25

Ez a határozati dokumentum az iránymutatások alapján hozott szabályozási döntés magyarázatára készült Dir94-08: Értékelési kritériumok az új tulajdonságokkal rendelkező növények környezeti biztonságának meghatározásához és kísérő dokumentuma Dir94-11: The Biology of Zea mays L . (Kukorica/kukorica) és a Dir95-03 irányelvek Útmutató az új tulajdonságokkal rendelkező növényekből származó állati takarmány értékeléséhez.

Ezért engedélyezett az AgrEvo T14 és T25 kukoricavonalainak korlátlan kibocsátása a környezetbe és állati takarmányként való felhasználása. Bármi más Zea mays az azonos transzformációs eseményekből származó vonalak és intraspecifikus hibridek, valamint azok összes leszármazottja szintén jóváhagyott, feltéve, hogy nem végeznek interspecifikus keresztezéseket, feltéve, hogy a tervezett felhasználás hasonló, feltéve, hogy az alapos jellemzést követően ismert, hogy ezek a növények nem mutatnak semmilyen további új tulajdonságokat, és feltéve, hogy a kapott vonalak lényegében egyenértékűek a jelenleg termesztett kukoricával potenciális környezeti hatásukat és állati takarmánybiztonságukat tekintve.


A mai napig az olajrepcében hagyományos módszerekkel történő hibridizációs rendszerek kifejlesztésére tett kísérletek kereskedelmi alkalmazásokban nem jártak teljes sikerrel. A lehetséges előnyök közé tartozik, hogy az olajrepce F1 hibridjei a becslések szerint 20-25%-kal több termést adnak, mint a nyílt beporzású fajták, és egységességük megkönnyíti a betakarítást és a forgalmazást.

Ezeket az anyagokat Kanadában, korlátozott körülmények között tesztelték Saskatchewanban (1994-96), Albertában (1996), Manitobában (1995, 96) és Ontarióban (1996).

Az új fehérjéket azonosították és jellemezték, beleértve a nem célszervezetekre gyakorolt ​​lehetséges toxicitásukat, az allergenitás lehetőségét és a növényi expressziós szinteket. Számos releváns tudományos publikációra hivatkoztak.

Az olyan agronómiai jellemzőket, mint a magvak nyugalmi állapota, a vegetatív életerő, a magtermelés, az érésig eltelt idő, a virágzási időszak, a hím és nőstény termékenység, valamint a betegségekre és rovarokra való érzékenység, összehasonlították a nem módosítottakéval. B. napus megfelelői.


Pocket K No. 10: Herbicid tolerancia technológia: glifozát és glufozinát


USDA fénykép

A gyomok állandó problémát jelentenek a gazdálkodók szántóföldjein. A gyomok nemcsak a vízért, a tápanyagokért, a napfényért és a helyért versenyeznek a növényekkel, hanem a rovarokat és betegségeket is eltömítik az öntöző- és vízelvezető rendszerekben, rontják a termés minőségét, és gyommagokat raknak le a betakarításba. Ha nem kontrollálják, a gyomok jelentősen csökkenthetik a terméshozamot.

A gazdálkodók küzdhetnek a gyomok ellen talajműveléssel, kézi gyomlálással, gyomirtókkal vagy jellemzően az összes technika kombinációjával. Sajnos a talajművelés értékes termőtalajt hagy maga után a szél- és vízeróziónak, ami súlyos, hosszú távú környezeti következménye. Emiatt egyre több gazdálkodó részesíti előnyben a csökkentett vagy nem művelés nélküli gazdálkodást.

Hasonlóképpen sokan érveltek amellett, hogy a gyomirtó szerek nagymértékű használata a talajvíz szennyeződéséhez, számos vadon élő állatfaj pusztulásához, valamint különféle emberi és állati betegségekhez vezetett.

Gyomirtó gyakorlatok

A talajművelés és a gyomirtó kijuttatás tandem technikája egy példa arra, hogy a gazdálkodók hogyan irtják a gyomokat a gazdaságukban.

Általában az ültetés előtt megművelik a talajt, hogy csökkentsék a területen jelen lévő gyomok számát. Ezután széles spektrumú vagy nem szelektív gyomirtó szereket alkalmaznak (olyanokat, amelyek minden növényt elpusztítanak), hogy tovább csökkentsék a gyomnövekedést közvetlenül a növény csírázása előtt. Ez azért van így, hogy ne pusztítsák el a terményeiket a gyomokkal együtt. A tenyészidőszakban kelő gyomokat szűk spektrumú vagy szelektív gyomirtó szerekkel irtják. Sajnos a szántóföldön különböző típusú gyomok jelennek meg, ezért a gazdálkodóknak többféle szűk spektrumú gyomirtót kell alkalmazniuk a védekezésre. Ez a gyomirtó módszer nagyon költséges lehet, és károsíthatja a környezetet.

A kutatók azt feltételezték, hogy a gyomirtás leegyszerűsíthető, ha egyetlen széles spektrumú gyomirtó szert permeteznek a táblára a vegetációs időszakban bármikor.

Glifozát és glufozinát herbicid toleráns növények fejlesztése

A herbicidtűrő (HT) növények létfontosságú eszközt kínálnak a gazdálkodóknak a gyomok elleni küzdelemben, és kompatibilisek a talajművelés nélküli módszerekkel, amelyek segítenek megőrizni a termőtalajt. Rugalmasságot biztosítanak a gazdálkodóknak, hogy csak szükség esetén alkalmazzanak gyomirtó szereket, szabályozzák a teljes gyomirtó-bevitelt, és előnyben részesített környezeti jellemzőkkel rendelkező gyomirtó szereket alkalmazzanak.

Technológiai háttér

Hogyan hatnak ezek a gyomirtó szerek?
Ezek a gyomirtó szerek a növényi anyagcsereút kulcsfontosságú enzimeit célozzák meg, amelyek megzavarják a növényi tápláléktermelést, és végül elpusztítják azt. Tehát hogyan váltanak ki a növények toleranciát a gyomirtókkal szemben? Néhányan szelekció vagy mutáció révén sajátították el ezt a tulajdonságot, vagy újabban a növényeket géntechnológiával módosították.

Miért érdemes HT növényeket kifejleszteni?
Újdonság az a képesség, hogy bizonyos fokú toleranciát tudunk kialakítani a széles spektrumú gyomirtókkal – különösen a glifozáttal és a glufozináttal – szemben, amelyek a legtöbb zöld növény ellen is védekezni fognak. Ez a két gyomirtó szer hasznos a gyomirtásban, és minimális közvetlen hatással van az állatok életére, és nem perzisztens. Nagyon hatékonyak és a legbiztonságosabb agrovegyszerek közé tartoznak. Sajnos ugyanolyan hatásosak a kultúrnövények ellen is. Így a HT-kultúrákat úgy fejlesztették ki, hogy bizonyos fokú toleranciájuk legyen ezekkel a herbicidekkel szemben.

Hogyan működnek a Glyphosate és Glufosinate HT növények?

1. Glifozáttűrő növények
A glifozát herbicid az aromás aminosavak, vitaminok és számos másodlagos növényi metabolit bioszintézisében részt vevő EPSPS enzim blokkolásával pusztítja el a növényeket. Számos módja van annak, hogy a növényeket glifozáttoleránssá alakítsák. Az egyik stratégia egy olyan talajbaktérium gén beépítése, amely az EPSPS glifozáttoleráns formáját termeli. Egy másik módszer egy másik talajbaktérium-gén beépítése, amely glifozátbontó enzimet termel.

2. Glufozináttűrő növények
A glufozinát gyomirtó szerek foszfinotricin hatóanyagot tartalmaznak, amely elpusztítja a növényeket azáltal, hogy blokkolja a nitrogén anyagcseréért és a növényi anyagcsere melléktermékének számító ammónia méregtelenítéséért felelős enzimet. A glufozinát tolerálására módosított növények olyan bakteriális gént tartalmaznak, amely egy enzimet termel, amely méregteleníti a foszfinotricint, és megakadályozza annak károsodását.

Egyéb módszerek, amelyekkel a növényeket genetikailag módosítják, hogy túléljék a gyomirtó hatást, ideértve: 1) új fehérje előállítása, amely méregteleníti a gyomirtót 2) a gyomirtó és rsquos célfehérje módosítása úgy, hogy a gyomirtó ne befolyásolja, vagy 3) fizikai vagy fiziológiai akadályok létrehozása. megakadályozzák a gyomirtó bejutását a növénybe. Az első két megközelítés a legáltalánosabb módszer, amellyel a tudósok gyomirtószer-tűrő növényeket fejlesztenek ki.

A gyomirtószer-tűrő technológia biztonsági szempontjai

Toxicitás és allergenitás
A kormány szabályozó ügynökségei több országban kimondták, hogy a gyomirtószer-tűrő, képződő fehérjékkel rendelkező növények nem jelentenek más környezeti és egészségügyi kockázatot a nem génmódosított társaikhoz képest.

A bevitt fehérjék potenciális toxikus és allergén aktivitását a vonatkozó nemzetközi szervezetek által kidolgozott irányelvek szerint értékelik. Olyan forrásokból származnak, amelyekben nem fordult elő allergén vagy toxicitás, nem hasonlítanak ismert toxinokra vagy allergénekre, és jól ismert funkcióik vannak.

A növényekre gyakorolt ​​hatások
Ezeknek a fehérjéknek a kifejeződése nem károsítja a növények növekedését és nem eredményez gyengébb agronómiai teljesítményt a szülői kultúrákhoz képest. A herbicid tolerancia érdekében egy további enzim expresszióján vagy egy már meglévő enzim megváltoztatásán kívül más anyagcsere-változás nem következik be a növényben.

A növények perzisztenciája vagy invazivitása
A gyomirtószer-tűrő növényekkel kapcsolatos fő környezeti aggály az, hogy új gyomokat hozhatnak létre vadon élő rokonokkal való keresztezés révén, vagy egyszerűen úgy, hogy maguk a vadonban megmaradnak. Ezt a potenciált azonban a betelepítés előtt felmérik, és a növény elültetése után is figyelemmel kísérik. A jelenlegi tudományos bizonyítékok azt mutatják, hogy gyomirtó-alkalmazások hiányában a génmódosított herbicidekkel szemben toleráns növények nem valószínűbb, hogy invazívak a mezőgazdasági területeken vagy a természetes élőhelyeken, mint nem génmódosított társaik (Dale et al., 2002).

A jelenleg forgalomban lévő gyomirtószer-tűrő növények kevés bizonyítékot mutatnak a fokozott perzisztenciára vagy invazivitásra.

A herbicidtűrő növények előnyei

  • Kiváló gyomirtás és ezáltal magasabb terméshozam
  • Rugalmasság – lehetséges a gyomok irtása a növény későbbi növekedésében
  • Csökkentett permetezések száma egy szezonban
  • Csökkentett üzemanyag-felhasználás (a kevesebb permetezés miatt)
  • Csökkentett talajtömörödés (mivel kevesebbet kell a földre permetezni)
  • Alacsony toxicitású vegyületek alkalmazása, amelyek nem maradnak aktívak a talajban és
  • A talajművelés nélküli vagy konzerváló talajművelési rendszerek használatának képessége, aminek következményei a talajszerkezetre és az élőlényekre nézve (Felsot, 2000).

Az Amerikai Szójabab Szövetség (ASA) által a szójabab-gazdaságok talajművelési gyakoriságáról végzett tanulmánya kimutatta, hogy a gazdálkodók jelentős része alkalmazta az &ldquono-tallage&rdquo vagy &ldquored talajművelés&rdquo gyakorlatot a gyomirtószer-tűrő szójababfajták ültetése után. Ezzel az egyszerű gyomszabályozási módszerrel több mint 234 millió gallon üzemanyagot takarítottak meg, és 247 millió tonna pótolhatatlan termőtalajt hagytak zavartalanul.

A herbicid tolerancia jelenlegi állapota

1996 és 2018 között a HT növények következetesen elfoglalták a biotechnológiai növények legnagyobb ültetési területét. Csak 2018-ban a HT-növények 87,5 millió hektárt foglaltak el, vagyis a 191,7 millió hektárnyi biotechnológiai növény 45%-át világszerte. A leggyakoribbak a glifozát- és glufozináttoleráns fajták. A következő táblázat azokat az országokat mutatja be, amelyek engedélyezték a főbb HT (egyetlen és halmozott génekkel) élelmiszer-, takarmány- és/vagy termesztési célú növényeket.

Vág Országok
Lucerna Argentína, Ausztrália, Kanada, Japán, Mexikó, Új-Zéland, Fülöp-szigetek, Szingapúr, Dél-Korea, USA
Argentin repce Ausztrália, Kanada, Chile, Kína, EU, Japán, Malajzia, Mexikó, Új-Zéland, Fülöp-szigetek, Szingapúr, Dél-Afrika, Dél-Korea, Tajvan, USA
Szegfű Ausztrália, Kolumbia, EU, Japán, Malajzia
Cikória USA
Pamut Argentína, Ausztrália, Brazília, Kanada, Kína, Kolumbia, Costa Rica, EU, Japán, Malajzia, Mexikó, Új-Zéland, Paraguay, Fülöp-szigetek, Szingapúr, Dél-Afrika, Dél-Korea, Tajvan, USA
Kúszó hajlított fű USA
Len, Lenmag Kanada, Kolumbia, USA
Kukorica Argentína, Ausztrália, Brazília, Kanada, Kína, Kolumbia, Costa Rica, Kuba, EU, Honduras, Indonézia, Irán, Japán, Malajzia, Mexikó, Új-Zéland, Nigéria, Pakisztán, Panama, Paraguay, Fülöp-szigetek, Orosz Föderáció, Szingapúr, Dél Afrika, Dél-Korea, Svájc, Tajvan, Thaiföld, Törökország, USA, Uruguay, Vietnam, Zambia
lengyel repce Kanada
Burgonya Ausztrália, Kanada, Japán, Mexikó, Új-Zéland, Fülöp-szigetek, Dél-Korea, USA
Rizs Ausztrália, Kanada, Kolumbia, Honduras, Mexikó, Új-Zéland, Fülöp-szigetek, Orosz Föderáció, Dél-Afrika, USA
Szójabab Argentína, Ausztrália, Bolívia, Brazília, Kanada, Chile, Kína, Kolumbia, Costa Rica, EU, India, Indonézia, Irán, Japán, Malajzia, Mexikó, Új-Zéland, Nigéria, Paraguay, Fülöp-szigetek, Orosz Föderáció, Szingapúr, Dél-Afrika, Dél-Korea, Svájc, Tajvan, Thaiföld, Törökország, USA, Uruguay, Vietnam
Cukorrépa Ausztrália, Kanada, Kína, Kolumbia, EU, Japán, Mexikó, Új-Zéland, Fülöp-szigetek, Orosz Föderáció, Szingapúr, Dél-Korea, Tajvan, USA
Dohány EU
Búza Ausztrália, Kolumbia, Új-Zéland, USA

A Mezőgazdasági Tudományos és Technológiai Tanács által végzett szakirodalmi áttekintés arra a következtetésre jutott, hogy a környezet előnyös a HT-növények használatából. Az Egyesült Államokban például a HT szójabab bevezetése óta 35%-kal nőtt a szántás nélküli szója vetésterülete. Hasonló tendencia figyelhető meg Argentínában, ahol a szójatáblákat 98%-ban HT fajtákkal telepítik. A &ldquoA biotechnológiából származó és hagyományos szójabab-, kukorica- és gyapotnövények összehasonlító környezeti hatásai&rdquo című CAST-anyaga elérhető a http://www.cast-science.org címen.

A kereskedelmi forgalomba hozatal első 21 évében (1996-2016) a gyomirtószer-tűrő növények haszna 89,02 milliárd USD, ami a globális biotechnológiai termés 186,1 milliárd USD értékének 47,8%-a, és csak 2016-ban 8,44 milliárd USD vagy 46,4 USD. 18,2 milliárd US$ globális érték %-a.


Hogyan válhat egy növény ellenállóvá a glufozináttal szemben? - Biológia

Copyright & copy 2014 szerzők és Scientific Research Publishing Inc.

Ez a munka a Creative Commons Attribution International License (CC BY) licence alá tartozik.

Beérkezett 2014. január 18-án felülvizsgálva 2014. március 15-én elfogadva 2014. április 2-án

A glifozát- és glufozinát rezisztens (RR/LL) önkéntes kukorica problémát jelent, amikor a hibrid RR/LL kukorica követi a hibrid RR/LL kukoricát a vetésforgóban. Összesen hat szántóföldi kísérletet végeztek három éven keresztül (2008-tól 2010-ig) Ontario délnyugati részén, hogy 1) értékeljék az önkéntes RR/LL kukorica versenyképességét hibrid RR/LL kukoricában, és 2) meghatározzák, hogyan lehet kontrollálni az önkéntes RR-t. /LL kukorica hibrid RR/LL kukoricában. A megjósolt önkéntes RR/LL kukoricasűrűség a hibrid RR/LL kukorica hozamának 5%-os csökkentésére 1,7 önkéntes RR/LL kukoricanövény m 𕒶 volt. A hibrid RR/LL kukoricában nem volt terméskárosodás az 1 és 2 WAA-ra értékelt herbicidekkel, kivéve a rimszulfuront (15 g·ai·ha 𕒵 ) és a foramszulfuront (35 g·ai·ha 𕒵 ), amelyek ugyanannyit okoztak. 5% és 11% sérülés hibrid RR/LL kukoricában. Glifozát (1800 g·ae·ha 𕒵 ), glufozinát (500 g·ae·ha 𕒵 ) és glifozát + glufozinát (1800 + 500 g·ae·ha 𕒵 ) akár 18%, 10% és 21%-os kontroll az önkéntes RR/LL kukorica esetében. A rimszulfuron (15 g·ai·ha 𕒵 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha 𕒵 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g·ai·ha 𕒵 ), foramszulfuron (35 g·) POST alkalmazása ai·ha 𕒵 ), és a primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha 𕒵 ) nem biztosított semmilyen kontrollt az önkéntes RR/LL kukoricánál. A glifozát és a glifozát + glufozinát 26%-kal, illetve 30%-kal csökkentette az önkéntes kukorica sűrűségét. A többi értékelt herbicid nem csökkentette az önkéntes RR/LL kukorica sűrűségét a gyomos kontrollhoz képest. Egyik értékelt herbicid sem csökkentette az önkéntes RR/LL kukoricacsutka számát a gyomos kontrollhoz képest. A glifozát + glufozinát kijuttatású POST 35%-kal csökkentette az önkéntes RR/LL kukorica hozamát a gyomos kontrollhoz képest, de más értékelt herbicidek nem okoztak csökkenést az önkéntes RR/LL kukorica hozamában a gyomos kontrollhoz képest. A glifozáttal kijuttatott POST hibrid RR/LL kukoricatermést eredményezett, amely megegyezik a gyommentes kontrolléval, de az összes többi herbicid kezelés a gyomos kontrolléval egyenértékű hibrid RR/LL kukorica termést eredményezett. Ez a kutatás arra a következtetésre jutott, hogy az önkéntes RR/LL kukorica nagyon versenyképes lehet az RR/LL hibrid kukoricával. A vizsgált herbicidek egyike sem biztosított megfelelő kontrollt az önkéntes RR/LL kukorica ellen hibrid RR/LL kukoricában.

Kulcsszavak:Terménysérülés, versenyképesség, kontroll, sűrűség, hozam, Zea mays

A kukorica (Zea mays L.) termelése fontos a mezőgazdaság és Ontario gazdasága számára, ahol évente 9,2 millió tonna szemes kukoricát termelnek körülbelül 894 000 hektáron, ami Kanada teljes kukoricatermelésének több mint 60%-át veszélyezteti, 2,4 milliárd dolláros mezőgazdasági értékkel. 1] . Az Ontarióban termesztett kukorica nagy része rezisztens a glifozáttal és a glufozináttal (RR/LL) szemben is, ami további gyomirtási lehetőségeket biztosított a termelőknek, amelyek széles spektrumú gyomirtást tesznek lehetővé, és széles termésbiztonsági résszel rendelkeznek, ami magasabb nettó hozamot eredményez [2] [3] .

A glifozát-rezisztens kukoricát először 2001-ben vezették be Kanadában, és piaci részesedése az évek során folyamatosan nőtt. 2013-ban Kelet-Kanadában a kukorica hektárterületének körülbelül 95%-án glifozát-rezisztens kukoricát telepítettek, és ez az arány a jövőben várhatóan növekedni fog [3]. A hibrid RR/LL kukoricatermelés növekedésével az önkéntes RR/LL kukorica (Zea mays) komoly problémává vált, amikor a hibrid RR/LL kukorica a hibrid RR/LL kukoricát követi a vetésforgóban, mivel a glifozát vagy a glufozinát nem szabályozza az önkéntes RR/LL kukoricát. LL kukorica az előző évben termesztett kukoricából. Az önkéntes kukorica magvak főként a szár megrepedése vagy leesett kalászok törése, a szem elvesztése, valamint az előző évben nagyon száraz szemek fejtöréséből eredő veszteségek, és jelentősek lehetnek a viharkárok, betegségek, rovarok és különféle környezeti terhelések által érintett területeken. 4] . Az önkéntes RR/LL kukorica a hibrid RR/LL kukoricában versenyez a nedvességért, a tápanyagokért és a fényért, csökkenti a hibrid RR/LL kukorica hozamát, a betakarítás hatékonyságát és a szem minőségét, és növelheti a betegségek előfordulását [5]–[10].

Tanulmányok kimutatták, hogy a kukoricában a gyomok korai beavatkozása csökkent levelek kelését, csökkent levélterületet és alacsonyabb kukoricaszemtermést eredményezhet [11]-[13]. Kimutatták, hogy a hibridkukoricában a gyomok versengése befolyásolja a levelek kikelését, a termésnövekedési sebességet és a termést [14]. Az önkéntes kukorica elleni védekezés a hibridkukoricában nehéz, mivel az ontariói termelők által használt hibridek többsége a glifozáttal és a glufozináttal szembeni rezisztencia tulajdonságokkal rendelkezik, ezért a glifozát vagy glufozinát nem szabályozza megfelelően az önkéntes RR/LL kukoricát a hibrid RR/LL kukoricában. következő évben [4] . Ezért kritikus fontosságú új gyomirtási stratégiák kidolgozása az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezésre hibrid RR/LL kukoricában.

Korlátozott számú publikált információ áll rendelkezésre az önként jelentkező RR/LL kukorica kompetitív hatásairól hibrid RR/LL kukoricában, valamint az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezési stratégiákról hibrid RR/LL kukoricában Ontariói termesztési körülmények között. A termelőknek biztonságos, hatékony és gazdaságilag fenntartható gyomirtó szerekre van szükségük az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezéshez a hibrid RR/LL kukoricában, hogy versenyképesek legyenek a globális piacon.

A tanulmány célja az önkéntes RR/LL kukorica kompetitív hatásainak meghatározása volt hibrid RR/LL kukoricában, valamint a glifozát, glufozinát, glifozát + glufozinát, rimszulfuron, nikoszulfuron, nikoszulfuron/rimszulfuron, foramszulfuron és primiszulfuron/dicamba posztemergence-kukoricában történő értékelése. (POST) az önkéntes RR/LL kukorica ellenőrzésére hibrid RR/LL kukoricában.

Hat tereppróbát (3 a versenyképességre és 3 az önkéntes kontrollellenőrzésre) végeztek három év alatt (2008-tól 2010-ig) a Guelph Egyetem Ridgetown Campusán, Ontario délnyugati részén. A Ridgetown talaja Watford (szürke-barna brunizolos)-Brady (Gleyed Brunisolic Grey- Brown Luvisol, vegyes) homokos agyagos vályog, 53% homok, 27% iszap, 20% agyag, 5,3% szerves anyag és 7,0 pH-értékkel. 2008-ban 56% homok, 27% iszap, 17% agyag, 5,4% szerves anyag és pH 6,7 2009-ben, valamint 52% homok, 28% iszap, 20% agyag, 5,9% szerves anyag és pH 6,4 2010. A magágykészítés az őszi deszkás szántásból, majd tavasszal három munkamenetből állt egy szántóföldi kultivátorral, gördülő kosárboronával.

2.2. Versenyképességi tanulmányok

A kísérleti terv randomizált teljes blokktervezés (RCBD) volt, négy ismétléssel. A parcellák 3 m szélesek (négy sor egymástól 0,75 m távolságra) és 8 m hosszúak voltak. Mindegyik parcella négy, 4 soros „DKC50-45 RR” kukoricából állt. A hibrid RR/LL kukoricát minden év április végétől május elejéig ültettük el, 80 000 mag·ha mennyiségben − 1 . A kísérletek megalapozásához használt glifozát-rezisztens önkéntes kukorica vetőmag az előző évben egy ontariói kereskedelmi táblán termesztett glifozát-rezisztens „DKC50-45 RR” kukoricából származott. A kukorica vetőmagját a hibrid kukorica vetése előtt körülbelül 7500, 15 000, 30 000, 45 000, 60 000 és 75 000 önkéntes vetőmag·ha − 1-ben szórták ki műtrágyaszóróval, és két kultivátorral művelték a talajba. guruló kosaras boronák.

A kelést követő 4., 8. és 12. héttel (WAE) meghatároztuk az önkéntes kukorica sűrűségét, a hibrid kukorica magasságát, a levélnyakokat és a levélvégeket. A hibrid kukoricára vonatkozó összes változót (magasság, levélnyak, levélvégek és terméshozam) a gyommentességi ellenőrzés százalékára konvertáltuk. Az önkéntes RR/LL kukoricát kézzel betakarították a hibrid RR/LL kukorica betakarítása előtt. Feljegyeztük a csövek számát és az önként jelentkező RR/LL kukorica termését. A hibrid RR/LL kukoricát kisparcellás kombájnnal betakarítottuk, a nedvességtartalmat és a hozamot feljegyeztük.

A SAS 9.2 (SAS Institute Inc. 2008) PROC MIXED eljárásait használták annak meghatározására, hogy mely környezetek kombinálhatók a regressziós elemzéshez (az adatok kombinálva, ha a környezet sebességi kölcsönhatása nem volt szignifikáns). Mindhárom környezet kombinálható minden változóhoz.

2.2.1. Használt regressziós egyenletek (modellek).

A paramétereket az önkéntes RR/LL kukorica sűrűségéhez viszonyítottuk a megfelelő időpontban, amelyet az egyenletekben DENS-ként jelöltünk.

Hibrid RR/LL kukoricamagasság, levélnyak, levélvégek és hozam előrejelzett értékei az önkéntes RR/LL kukoricacsutka számára és termésmennyiségére vonatkozóan (lineáris):

[1] Y = a0 + b1 * DENS ahol a0 a metszéspont és b1 a meredekség.

Regressziós egyenleteket használtunk az önkéntes RR/LL kukoricasűrűség kiszámításához (per·m 2 ), ami 5%-os csökkenést eredményezett (R95) a hibrid RR/LL kukoricamagasság, a levélnyak, a levélvégek és a hozam.

Ha az önként megjósolt kukorica sűrűsége magasabb volt, mint a legnagyobb önként jelentkező kukorica sűrűsége (1. táblázat, 2. táblázat), akkor azt „>”-ként fejeztük ki, mert nem lenne helyénvaló az ezekben a kísérletekben értékelt sűrűségtartományon kívülre extrapolálni.

Az R95 értéket is felhasználtuk az önként jelentkező RR/LL kukoricasűrűség előrejelzett kalászszámának és terméshozamának kiszámításához.

2.3. Önkéntes kukoricaszabályozási tanulmányok

A kísérleti terv randomizált teljes blokktervezés (RCBD) volt, négy ismétléssel. Kezelések

Asztal 1 . Cél és tényleges önkéntes kukorica sűrűség 4, 8 és 12 WAE Ridgetown 2008-2010 között. a

a Rövidítések: WAE, hetekkel a hibridkukorica kelése után.

2. táblázat. A regressziós paraméterek becslései és az önkéntes kukorica sűrűségének, kalászszámának és terméshozamának becslése a hibrid kukoricamagasság, a levélnyak, a levélvégek és a termés regressziós modelljei alapján. a

> az önkéntes kukorica becsült sűrűségét, kalászszámát vagy hozamát jelöli, amely kívül esik az ezekben a kísérletekben értékelt tartományon. a Rövidítések: WAE, hetekkel a hibridkukorica kelése után. bLineáris paraméterek ((1) egyenlet): a0, b1 metszéspont, meredekség. cR95 az önkéntes kukorica sűrűsége, amelynél egy adott változó 5%-kal csökken. dA megfelelő R-hez megjósolt csövek száma95 sűrűség.

glifozátból (1800 g·ae·ha − 1 ), glufozinátból (500 g·ae·ha − 1 ), glifozátból + glufozinátból (1800 + 500 g·ae·ha − 1 ), rimszulfuronból ( 15 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), foramszulfuron (35 g·ai·ha − 1 ), és primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha − 1 ) A primiszulfuron/dicamba kivételével minden kezelés tartalmazta a dikambát (141 g·ai·ha − 1 ). A Rimszulfuron, nikoszulfuron, nikoszulfuron/rimszulfuron és primiszulfuron/dicamba kezelések nemionos felületaktív anyagot (Agaral 90 ®) tartalmaztak 0,2 térfogat% mennyiségben. A foramszulfuron kezelés 28%-os karbamid-ammónium-nitrátot (UAN) tartalmazott 2,5 L·ha mennyiségben − 1 .

A telkek 3 m szélesek és 8 m hosszúak voltak. Mindegyik parcella négy sor „DKC50-45 RR” kukoricából állt, egymástól 0,75 m távolságra. A hibrid RR/LL kukoricát minden év április végétől május elejéig ültettük el, 80 000 mag·ha mennyiségben − 1 . A kísérletekhez használt önkéntes RR/LL kukorica vetőmag „DKC50-45 RR” RR/LL kukoricából származott, amelyet előző évben termesztettek egy ontariói kereskedelmi tábláról. Az önkéntes RR/LL kukorica vetőmagot a hibrid RR/LL kukorica vetése előtt szórt műtrágyaszóróval szórtuk ki, és egy kultivátorral, guruló kosárboronával két menetben bedolgoztuk a talajba.

A herbicid kijuttatása CO-val történt2- túlnyomásos hátizsákos permetező, amely 200 L·ha − 1 víz kijuttatására van kalibrálva 207 kPa nyomáson négy, egymástól 50 cm-es távolságra elhelyezett Hypro Ultra-low drift 120-02 fúvókán keresztül (Hypro, New Brighton, MN 55112). A gyomirtó szereket akkor végezték el, amikor az önkéntes RR/LL kukorica 15 cm magas volt.

A hibrid RR/LL kukoricasérülést vizuálisan értékelték 1 és 2 héttel az alkalmazás után (WAA), az önkéntes RR/LL kukoricakontrollt pedig vizuálisan 2, 4 és 8 WAA-ra értékelték a 0%-tól 100%-ig terjedő skálán. A 0-s besorolást úgy határoztuk meg, hogy nincs látható hibrid RR/LL kukoricasérülés, a 100-as pedig teljes kukoricanekrózist. 8 WAA-nál az önkéntes RR/LL kukorica sűrűségét és 16 WAT-nál az önkéntes RR/LL kukoricacsutka számát és hozamát határoztuk meg minden parcellán. A hibrid RR/LL kukorica termését termésérettségben mértük úgy, hogy minden parcella középső két sorát parcellakombájnnal betakarítottuk. Az összes kukoricatermést 15,5%-os nedvességtartalomra állítottuk be.

Minden adatot varianciaanalízisnek (ANOVA) vetettünk alá, és a kísérletek és évek során egyesítettük, és a SAS PROC MIXED eljárásával elemeztük. A gazos és gyommentes ellenőrzések nem szerepeltek a sérülés elemzésében. A gyomosodás ellenőrzése nem szerepelt az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezés elemzésében, és a gyommentesség ellenőrzése nem szerepelt az önkéntes RR/LL kukorica sűrűségének, kalászainak vagy terméshozamának elemzésében. Mindazonáltal az összes értéket egymástól függetlenül nullával hasonlítottuk össze, hogy értékeljük a kezelési különbségeket a gyom/gyommentes ellenőrzéssel. A környezet kezelési kölcsönhatása szignifikáns volt minden sérülésminősítésnél. Az összes többi változó kombinálható a három környezetben. Az 1 WAA sérülési adatok 2008-ban és 2009-ben nullák voltak, és nem voltak kombinálhatók 2010-rel (log transzformálva). A 2 WAA sérülési adatai 2008-ban és 2009-ben nulla érték voltak, és nem voltak kombinálhatók 2010-rel (nincs átalakítás). A normalitás feltevéseinek teljesítése érdekében az önkéntes RR/LL kukoricakontroll 4 és 8 WAA arkzinusz négyzetgyököt transzformáltunk elemzéshez, és visszatranszformáltunk az eredmények bemutatásához. Az összes többi változót nem kellett átalakítani. A kezelési átlagokat Fisher védett LSD-vel választottuk el P 𕒶 értékkel az évtől függően, valamint a WAE-t (4, 8 és 12 WAE) a megcélzott vetési arányokhoz (1. táblázat). A hibrid kukorica magasságának, a levélnyak (# növény 𕒵 ) és levélvégek (# növény 𕒵 ) 5%-os csökkentésének előre jelzett önkényes kukorica sűrűsége nagyobb volt, mint az ezekben a kísérletekben megállapított önkéntes kukorica sűrűség tartománya (2. táblázat). . A hibrid kukorica terméshozamának 5%-os csökkentését célzó előrejelzett önkéntes kukoricasűrűség 1,7 önkéntes kukoricanövény·m 𕒶 , 0,6 önkéntes kukoricacsutka·m 𕒶 és 0,4 MT·ha 𕒵 önkéntes kukorica termés (2. táblázat). Alms et al. (2007) Dél-Dakotában (USA) a 0, 0,2, 0,8, 1,2, 1,9, 2,5, 2,7 vagy 3,5 növény·m 𕒶 önkényes kukorica sűrűségének hatásait tanulmányozták a Dekalb DKC 46-60 VT3 kukoricában, és 0%-ról számoltak be. - 13% hibridkukorica termésveszteség vagy 0% - 9% termésveszteség, ha az önkéntes kukorica által termelt kukoricaszemet vesszük figyelembe. Az azonos sűrűségű önkéntes kukorica azonban 0-54%-kal csökkentette a szójabab RR termését, ami azt jelzi, hogy az önkéntes kukorica versenyképesebb szójában, mint kukoricában [15]. Wilson és mtsai. [16] Nebraskában (USA) 2%-os kukorica termésveszteségről számoltak be 1,4 növény·m 𕒶-es önkéntes kukorica sűrűségéből és 10%-os kukorica termésveszteségéről 2,8 növény·m 𕒶-es önkéntes kukorica sűrűségéből. Ezzel szemben a szójabab hozama 10%-kal, illetve 27%-kal csökkent 1,4 és 2,8 növény·m 𕒶 önkéntes kukorica sűrűsége esetén [16]. Stahl és Coulter [17] Minnesotában (USA) az önkéntes kukorica sűrűségét 1,6-14,5 növény·m arányban tanulmányozva 𕒶 a hibridkukorica terméshozamában is 26%-kal csökkent. Stahl és Coulter [17] azt találta, hogy az önként jelentkező kukorica sűrűségének el kellett érnie a 3,2 növény·m 𕒶 értéket, mielőtt a hibrid kukorica termése átlagosan 18%-kal csökkent. Arra is megállapították, hogy az önként jelentkező kukorica növekedése egy-hat leveles stádiummal elmarad a hibridkukorica mögött, és nem valószínű, hogy ellensúlyozta a hibridkukorica termésveszteségét, mivel a kalászok túl kicsik voltak (nagy sűrűség mellett) a betakarítás idején [4] [17].

3.2. Önkéntes kukoricaszabályozási tanulmányok

A hibrid RR/LL kukoricában nem volt terméskárosodás az 1 és 2 WAA-ra értékelt herbicidekkel, kivéve a rimszulfuront és a foramszulfuront, amelyek 5, illetve 11%-os terméskárosodást okoztak hibrid kukoricában (3. táblázat). A glifozát (1800 g·ae·ha − 1 ), a glufozinát (500 g·ae·ha − 1 ) és a glifozát + glufozinát (1800 + 500 g·ae·ha − 1 ) 15% -18 %, 6% - 10% és 16% - 21% kontroll az önkéntes RR/LL kukoricánál 1, 2, 4 és 8 WAA-nál (3. táblázat). Rimszulfuron (15 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), foramszulfuron (70 g·ai ·ha − 1 ), és a primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha − 1 ) nem kontrollálta az önkéntes RR/LL kukoricát a kiértékelt arányok mellett.

A glifozát (1800 g·ae·ha − 1 ) és a glifozát + glufozinát (1800 + 500 g·ae·ha − 1 ) 26%-kal, illetve 30%-kal csökkentette az önkéntes kukorica sűrűségét. Azonban glufozinát (500 g·ae·ha − 1 ), rimszulfuron (15 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g) ·ai·ha − 1 ), a foramszulfuron (70 g·ai·ha − 1 ) és a primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha − 1 ) nem csökkentette az önkéntes kukorica sűrűségét a gyomirtás (4. táblázat).

Egyik herbicid sem csökkentette az önkéntes kukoricacsutka számát a gyomnövényes kontrollhoz képest (4. táblázat). A glifozát + glufozinát 35%-kal csökkentette az önkéntes RR/LL kukorica hozamát a gyomnövényes kontrollhoz képest, de a glifozát, glufozinát, rimszulfuron, nikoszulfuron, nikoszulfuron/rimszulfuron, foramszulfuron és primiszulfuron/dicamba nem okozott csökkenést az önkéntes kukorica hozamában (a kezelhető kukorica kontrollhoz képest 4).

A hibrid RR/LL kukorica termése hasonló volt a glifozáttal (1800 g·ae·ha − 1 ), glufozináttal (500 g·ae·ha − 1 ), glifozáttal + glufozináttal (1800 + 500 g·) végzett gyomirtáshoz. ae·ha − 1 ), rimszulfuron (15 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), foramszulfuron (70 g·ai·ha − 1 ) és primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha − 1 ). A glifozát kivételével valamennyi értékelt herbicid hozama alacsonyabb volt, mint a gyommentes kontroll (4. táblázat). Más tanulmányokban Alms et al. [15] hatékony kontrollt talált az önkéntes RR önkéntes kukoricánál 3,5 növény·m 𕒶 sűrűségnél 470 g·ae·ha − 1 glufozináttal alkalmazott POST-val RR hibrid kukoricában.

3. táblázat. Vizuális becslések a hibrid kukorica sérülésére 1 és 2 WAA és önkéntes kukorica kontroll 1, 2, 4 és 8 WAA különböző gyomirtó kezelésekkel. Az egy oszlopon belül ugyanazt a betűt követő átlagok nem különböznek jelentősen a Fisher védett LSD-je szerint P a-nál

a Rövidítések: WAA, hetekkel az alkalmazás után. b A primiszulfuron/dicamba kivételével minden kezelés tartalmazta a dikambát (141 g·ai·ha 𕒵 ). c Tartalmazott nemionos felületaktív anyag (0,2% v/v). dTartalmaz 28% UAN-t (2,5 L·ha 𕒵 ).

4. táblázat. Sűrűség, csövek száma és hozam az önkéntes kukorica esetében, valamint a hibrid kukorica termése különböző gyomirtó kezelésekkel. Az egy oszlopon belül ugyanazt a betűt követő átlagok nem különböznek jelentősen a Fisher védett LSD-je szerint, a P 𕒵 címen. b Tartalmazott nemionos felületaktív anyag (0,2% v/v). c 28% UAN-t (2,5 L·ha 𕒵 ) tartalmaz.

Ez a kutatás arra a következtetésre jutott, hogy az önkéntes RR/LL kukorica versenye megváltoztathatja a hibrid RR/LL kukorica növekedését és csökkentheti a termést. Glifozát (1800 g·ae·ha − 1 ), glufozinát (500 g·ae·ha − 1 ), glifozát + glufozinát (1800 + 500 g·ae·ha − 1 ), rimuron posztemergens alkalmazása (15 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), nikoszulfuron/rimszulfuron (25 g·ai·ha − 1 ), foramszulfuron (70 g·ai· ha − 1 ), és a primiszulfuron/dicamba (166 g·ai·ha − 1 ) gyengén szabályozza az RR/LL önkéntes kukoricát. Összefoglalva, az önkéntes RR/LL kukorica nagyon agresszív versenytárs lehet a hibrid RR/LL kukoricával. Az önkéntes RR/LL kukoricát a folyamatos kukorica vetése helyett változatos vetésforgókkal kell szabályozni. A termesztés továbbra is az egyetlen életképes lehetőség az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezésre hibrid RR/LL kukoricában. További vizsgálatokra van szükség az új posztemergens gyomirtó-lehetőségek értékeléséhez az önkéntes RR/LL kukorica elleni védekezésre hibrid RR/LL kukoricában.

A projekt finanszírozását részben az Ontariói Grain Farmers (GFO) és a Mezőgazdasági Alkalmazkodási Tanács Can Advance programja biztosította.


A glufozinát rezisztencia genetikai elemzése transzformált rizs (Oryza sativa) és vörös rizs (Oryza sativa) keresztezéseiben

Kölcsönösen ellenőrzött keresztezéseket végeztünk az üvegházban a bialaphos rezisztencia (BAR) génnel transzformált Gulfmont rizs és a vörös rizs, valamint a BAR-transzformált Koshihikari rizs és vörös rizs között, hogy felmérjük a glufozinát rezisztencia öröklődését. Minden F 1 növény rezisztens volt 2,2 kg ai/ha glufozináttal szemben. Az ammónia felhalmozódását a glufozinát rezisztencia mértékeként az F 1 hibridekben a kezelést követő 4. és 8. napon (DAT) vizsgáltuk. A hibridek ammónia felhalmozódása 4 DAT hasonló volt a glufozináttal kezelt, transzformált rizshez, míg a kezelt nem transzformált növények 14-23-szor több ammóniát halmoztak fel a hibridekhez képest. A glufozinát-rezisztencia öröklődésének természetét F 2 rizsnövényekben glufozinát-mártási teszttel, permetezési teszttel és ammóniavizsgálattal vizsgálták. Mindhárom teszt megerősítette, hogy a BAR gén által befolyásolt glufozinát rezisztencia 3 (rezisztens): 1 (érzékeny) arányban szegregált.


Transzgénikus szárazbab, amely toleráns a glufozinát ammónium gyomirtó szerrel szemben. (Sejtbiológia és molekuláris genetika).

BRAZÍLIÁBAN a szárazbab táplálkozási szempontból fontos, mert az alapvető étrend része, de ennek a növénynek a termelékenysége néhány régióban hanyatlik, az átlagos brazil terméshozam 600 kg [ha.sup.-1]. Ez a termés több mint 4000 kg [ha.sup.-1] termésre képes, a nyugat-ázsiai és észak-amerikai terméshozam 1100-1500 kg [ha.sup.-1], míg a latin-amerikai és afrikai országok terméshozama 500 és 600 kg között [ha.sup.-1]. Az alacsony terméshozamú régiókban a fő korlátozó tényezők a rossz mezőgazdasági gyakorlatok, betegségek, rovarok, táplálkozási hiányosságok, talajtípus, éghajlati korlátok, a javított fajták hiánya és a gyomok versenye.

A hagyományos ivaros nemesítési módszerekkel társított rekombináns DNS technológia felgyorsíthatja a hasznos tulajdonságokkal rendelkező növények termését. Valójában a P. vulgaris géntechnológiával történő fejlesztése valósággá vált (Russel et al., 1993 Aragao et al., 1996, 1998, 1999). Nemrég olyan transzgenikus eseményeket kaptunk, amelyek rezisztensek a Bean golden mosaic vírussal szemben. A vírusrezisztens fajták létrehozása érdekében ezeket az eseményeket beépítették a babnemesítési programokba.

A gyomnövények jelenléte a szántóföldeken a trópusi régiókban fontos termelékenységi korlát, és akadálya a P. vulgaris termesztésének és betakarításának. Praktikusnak és hasznosnak bizonyult a herbicidek herbicidtűrő transzgénikus kultúrákon történő kijuttatásán alapuló gyomirtás (Brasileiro et al., 1992 Padgette és mtsai, 1995, Enriquez-Obregon et al., 1998, Mohapatra et al., 1999 Carpenter). és Gianessi, 2000, Aragao et al., 2000).

A glufozinát ammónium (GA) egy nem szelektív gyomirtó, amelyet a növények fitotoxikus foszfinotricinné (PPT) alakítanak át. A Streptomyces hygroscopicusból származó bar gén a foszfinotricin-acetil-transzferázt (PAT) kódolja, amely acetilezi a PPT szabad N[H2] csoportját, és megakadályozza a GA toxicitását (Thompson és mtsai., 1987). A bar gén így GA toleranciát biztosíthat, és ezt a gént részecskebombázással juttattuk be a P. vulgarisba. Az ebben a cikkben közölt munka bemutatja az átalakítás hasznosságát egy mezőgazdaságilag fontos gyomirtószer-toleráns P. vulgaris kifejlesztésében.

Növényátalakítás, termesztés és kezelés

A transzgenikus P. vulgaris (Olathe és Carioca fajták) előállítása az Aragao és mtsai. (1996), összesen 11 607 embrionális fejszékből (5708 cv. Olathe és 5899 cv. Carioca) körülbelül 250 darabos tételben. Röviden, az érett magokat felületi sterilizáltuk és desztillált vízben áztattuk 16-18 órán át. Ezután az embrionális tengelyeket kivágtuk a magokból, és az apikális merisztémákat az elsődleges leveleik eltávolításával szabaddá tettek.Az embrionális tengelyeket az apikális régióval felfelé helyeztük bazális MS táptalajt (Murashige és Skoog, 1962) tartalmazó Petri-csészékbe közvetlenül a bombázás előtt. A bombázást a laboratóriumunkban épített nagynyomású héliummal hajtott részecskegyorsító berendezéssel végeztük. Az embrionális tengelyeket 44,3 µM 6-benzilaminopurint (BAP) tartalmazó MS táptalajon tenyésztettük, hogy több hajtást indukáljunk. Az alkalmazott vektor a pB5/35Sbar (az Aventis szállítója) volt, amely tartalmazza a bar gént, amelyet a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoter és a bakteriális kanamicin rezisztencia gént (neo) vezérel (1. ábra). 3 hét tenyésztés után a bombázott apikális merisztémák ([R.0] generáció) megnyúlt hajtásokat hoztak létre, amelyeket amikor elérték a 2-4 cm-es hosszúságot és meggyökeresedtek, egy műanyag edénybe helyezték, amely autoklávozott talajt: vermikulitot tartalmazott. (1:1) és műanyag zacskóval letakarva 1 hétig, hogy akklimatizálódjon. A glufozinát ammónium (GA) toleranciával kapcsolatos integrációs események kimutatására a 4537 túlélő [R.0] növényt (2308 cv. Olathe és 2229 cv. Carioca) glufozinát-ammónium vizes oldatával (Liberty, Aventis) permeteztük be a hőmérsékleten. 100 g GA-nak megfelelő kijuttatási mennyiség [ha.sup.-1]. A 24 túlélő GA-tűrő növényt (14 cv. Olathe és 10 cv. Carioca) 5-[m.sup.3] műanyag cserepekbe helyeztük, amelyek műtrágyázott talajt (haplustox) tartalmaztak, és üvegházban tartották [5-30 °C-on ]C, relatív páratartalom (RH) >gt70%], és hagyjuk megkötni a magot ([R.sub.1] generáció). Az [R1] generációs magot 5-[m.3] műanyag cserepekbe vetettük, amelyek műtrágyázott talajt tartalmaztak, és üvegházban tartották (25-30 °C, relatív páratartalom >70%). Amikor az [R.1] generációs növények megtermelték az első trifoliolát leveleket, a transzformációs eseményekre szűrték őket 500 g GA [ha.-1]-nek megfelelő kijuttatási arányú herbiciddel történő permetezéssel, és a két túlélő eseményt. PHV119 és PHV122. Ezeket a transzformált eseményeket láncreakcióval (PCR) vizsgáltuk a gének jelenlétére. A transzformáció megerősítése után a nómenklatúrát [R.sub.n]-ről [T.n]-re változtattuk.

A DNS-t levélkorongokból Edwards és munkatársai módszerével izoláltuk. (1991). Mindegyik PCR-reakciót 25 mikroliter reakcióelegyben hajtottuk végre, amely 10 mM Tris-HCl-t (pH 8,4), 50 mM KCl-t, 2 mM Mg[Cl2]-t, 160 uM dNTP-t tartalmazott, 200 nM mindegyik primerből, 2U Taq polimeráz (GIBCO BRL) és körülbelül 20 ng genomiális DNS. A keveréket ásványolajjal bevontuk, 5 percig denaturáltuk 95 °C-on termikus ciklusban (MJ Research, Watertown, MA), és 35 cikluson keresztül amplifikáltuk (95 °C 1 percig, 55 °C). 1 percig, 72 °C-on 1 percig) az utolsó 7 perces ciklussal 72 °C-on. A reakcióelegy egyik felét ezután közvetlenül 1 tömeg/térfogat%-os agarózgélre visszük, etidium-bromiddal megfestjük, és UV-fénnyel láthatóvá tettük. A P2510 és P2958 primerpárt (a bar génen belül, 1. táblázat) használjuk egy 448 bp hosszúságú szekvencia amplifikálására a transzgenikus növények szűrésére. Más primer párokat (1. táblázat és 1. ábra) használtunk annak meghatározására, hogy a pB5/35Sbar plazmid mely szekvenciái kerültek be a két transzgenikus eseménybe.

A genomi DNS-t Dellaporta et al. (1983). A genomiális DNS-t (15 mikrog) HindIII-mal emésztettük, 1%-os agarózgélen választottuk el, és nejlon HyBond membránra vittük át. A hibridizációt a PCR által generált 448 bp-os bar gén (a próba) és a 638 bp méretű neo gén (b) próbával végeztük (1. ábra). A próbákat [a-[sup.32]P]dCTP-vel (3000 Ci [mol.-1]) jelöltük random primer DNS-jelölő készlettel (Pharmacia Biotech) a gyártó utasításai szerint.

A [T.1] generációs elemzést a bar gén PCR-amplifikációjával végeztük az önbeporzó növényekben. Khi-négyzet ([chi square]) elemzéseket végeztünk Yates korrekciós tényezőjének felhasználásával (Steel és Torrie, 1980) annak meghatározására, hogy a megfigyelt szegregációs arány összhangban van-e a Mendel-aránnyal.

A PHV119 és PHV122 P. vulgaris eseményeket öntermékenyítettük, és az így kapott magvakat 5-[dm.sup.3]-os, műtrágyázott talajt tartalmazó műanyag edényekben csíráztattuk, és GA toleranciát vizsgáltunk úgy, hogy a növényeket az első háromlevelű leveles állapotban permeteztük. GA 500 g GA-nak megfelelő kijuttatási mennyiségben [ha.sup.-1].

A PHV119 esemény [T.sub.2] generációjának szántóföldi körülmények közötti rezisztenciájának értékelésére egy előzetes kísérletet végeztek 2000 novembere és 2001 februárja között Distrito Federalban, Brazíliában (Embrapa Recursos Geneticos e Biotecnologia). Mindegyik kezelést véletlenszerűen elosztott blokkokban ismételtük meg. Egy blokk négy, 4,5 m hosszú sorból állt, egymástól 0,5 m távolságra. A növényeket egymás mellé vetettük a sorban (körülbelül 5 mag [m.sup.-1]), és 0,400 (kereskedelmi dózis) és 800 g GA-val [ha.sup.-1] (Liberty, Aventis) permeteztük. az első háromlevelű levélstádiumban. A helyszíni kibocsátás a brazil törvények szerint történt, a Comissao Tecnica Nacional de Biosseguranca (Nemzeti Biológiai Biztonsági Bizottság) ajánlásai alapján, engedélyszám: 01200.001359/2000-19.

48 független transzformációs kísérlet eredményeit a 2. táblázat foglalja össze. A 11 607 bombázott embrionális tengelyből 4537 [R0] generációs palántát kaptunk, amelyek közül 24 élte túl a magot a herbiciddel történő permetezés után, az egyenértékű kijuttatási mennyiséggel. 100 g GA-ra [ha.sup.-1]. A PCR-elemzések megerősítették a bar gén jelenlétét ezekben a palántákban, amelyek mindegyike fenotípusosan normális növényekké fejlődött, amelyek termékenyek voltak, és hüvelyesek és magvak voltak. Számos növény kiméra volt, és kevés herbicidrezisztenciát mutató ágat tártak fel. Ezek a kiméra növények 5 héttel a herbicid kezelés után elpusztultak. Az összes toleráns eseményt (feltételezett [T1] generáció) elemeztük a gén jelenlétére PCR-rel, és GA-toleranciát vizsgáltunk úgy, hogy a növényeket 500 g GA-val [ha.-1] permeteztük. Négy esemény kivételével a PCR elemzések megerősítették a bar gén jelenlétét a [T1] generációban. A herbicid alkalmazása után a legtöbb PCR-pozitív [T.1] növény tipikus GA toxicitási tüneteket mutatott, és 2 héttel a GA kijuttatása után elpusztult, csakúgy, mint az összes kontroll (nem transzgenikus) növény. Az Olathe két transzgenikus eseménye, a PHV119 és a PHV122 azonban GA-toleráns volt (2. táblázat, 2. ábra), látható tünetek nélkül és a nem transzgenikus P. vulgarishoz hasonló növekedéssel.

Az [R0] és [R.1] transzgenikus generációkból izolált genomiális DNS Southern blot analízisét végezték el, beleértve a PHV119 és PHV122 eseményeket is, hogy értékeljék a bejuttatott bar és neo gének integrációját, és az eredmények az oszlopszekvencia jelenlétét mutatták mind a PHV119-ben, mind a PHV122-ben (3. ábra). Mivel a pB5/35Sbar egyedi HindIII restrikciós hellyel rendelkezik (1. ábra), az [R0] és [R.1] generációk Southern blot analízise lehetővé tette számunkra a plazmidintegráció megerősítését, valamint a szám becslését. A transzgenikus növényekben jelenlévő bar és neo gének integrációs helyei (3. ábra). A PHV119 esemény integrációs mintája mindkét generációban azonos volt, a bar gén egy integrációs helyével és a neo gén egyikével sem (3. ábra). A PHV122 esetében a bar és a neo gén két integrációs helye volt. A [T.sub.1] generáció Southern blot analízise ugyanazt a mintát mutatta mindkét próbánál, feltárva, hogy az integrált kópiák egymástól függetlenül szegregálódtak (3. ábra), és hogy a neo és bar gének összekapcsolódtak. A nem transzgenikus növényekből izolált DNS nem hibridizálódott sem a bar, sem a neo próbákkal (3. ábra).

A [T.0] PHV119 és PHV122 öntermékenyült, és utódaikat PCR-analízissel szűrték a bar gén jelenlétére, miközben a PHV119 és PHV122 is átvitte az idegen gént a [T.1] generációba. mendeli divat szerint. A szegregáció 3:1 volt a PHV119 esetében és 15:1 a PHV122 esetében (3. táblázat), az eredmények megegyeznek a Southern blot analízissel. A bar gén bármelyik másolatát tartalmazó növények magasabb GA toleranciát mutattak, ami azt jelzi, hogy mindkét kópia működőképes.

Több primerpárral PCR analízist végeztünk annak meghatározására, hogy mely szekvenciák kerültek be hatékonyan. A PHV119-ben a plazmidszekvencia megszakadt a 3937 és 637 bp, valamint a 870 és 1217 bp között, míg a PHV122-ben a plazmid két szekvenciája egymástól függetlenül integrálódott, az 1217 és 2100 közötti réssel. A PHV122 esemény Southern blot analízise feltárta a PHV122 eseményt. ugyanaz a minta mind a rúd, mind a neo szondák esetében (1. ábra). Ezek az eredmények a plazmidvektor átrendeződését jelezhetik az inszert transzformációja, integrációja vagy stabilizálása során (De Block, 1993). A PHV119-cel végzett előzetes szántóföldi kísérleti értékelés azt mutatta, hogy a növények jól tolerálják a 400 g GA-t [ha.sup.-1], látható tünetek nélkül. Amikor azonban a növényeket 800 g GA [ha.sup.-1] koncentrációval permeteztük, herbicid fitotoxicitási tüneteket észleltünk, azaz a kezelt levelek sárgulását. Általában minden nem transzgenikus növény elpusztult 1 héttel a 400 g GA [ha.sup.-1] alkalmazása után (2. ábra).

A kísérlet első szakaszában nagyszámú transzgenikus és nem transzgenikus növényt kaptunk, mivel az [R0] generáció embrionális tengelyeinek tenyésztése során nem adtak szelektív szert a táptalajhoz. Ezenkívül néhány kiméra növényt is megfigyeltek. Annak érdekében, hogy a PCR-analízisben felhasznált palánták számát kezelhető számra csökkentsük, a palántákat előszelektáltuk a végső gyomirtószer-koncentráció 1/5-ével, ami 100 g GA [ha.sup.-1]-nek felel meg a GA-érzékeny növények eltávolítására. . Az in vitro feltörekvő hajtások herbicid alkalmazása a protokoll első szakaszában minimalizálhatja a nem transzgénikus vagy kiméra növények számát.

A 24 transzgenikus [R0] esemény közül, amelyek 100 g GA-val [ha-1] egyenértékűek voltak, csak két [R1] esemény volt toleráns, amikor a GA-koncentrációt ötszörösére növelték . Mivel a PCR analízis azt mutatta, hogy mind a 24 esemény tartalmazta a bar gén legalább egy kópiáját, a rezisztencia szint ebben a két eseményben a megfelelő transzgénexpresszió hiányának tudható be. Négy [T0] transzgenikus esemény kivételével minden 100 g GA [ha.sup.-1]-re toleráns esemény átvitte a transzgéneket a [T.1] generációba. A [T.sub.1] generációba való át nem adás jelenségét korábban a transzgenikus P. vulgaris (Aragao et al., 1996), a petúnia (Petunia x hybrida Vilm., Ulian és mtsai, 1994) és a kukorica (Zea) esetében figyelték meg. mays L., Register et al., 1994).

A közelmúltban a biológiai biztonsággal kapcsolatos kérdések merültek fel, mivel a transzgenikus növényekben antibiotikum-rezisztenciát okozó gének jelen vannak (Dale, 1999), és ennek következtében az antibiotikum-rezisztenciát kódoló szekvenciákat elkerülik az új fajták fejlesztésekor. Következésképpen az antibiotikum rezisztencia gént nem hordozó PHV119 eseményt választottuk az előzetes terepi nyomvonal értékeléshez. Ez az esemény hasonlóan viselkedett üvegházi és szántóföldi körülmények között, és bekerült az EMBRAPA rizs- és babnemesítési programjába.

Rövidítések: bp, bázispár(ok) GA, glufozinát ammónium PAT, foszfinotricin acetil transzferáz PCR, polimeráz láncreakció PPT, foszfinotricin.

A szerzők hálásak Josue Ignacio Lemosnak és Warley Silva Almeidának a technikai segítségért. Ezt a tanulmányt az Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (EMBRAPA), a Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) és az Aventis támogatta.

Aragao, F.J.L., L.M.G. Barros, A.C.M. Brasileiro, S.G. Ribeiro, F.D. Smith, J.C. Sanford, J.C. Faria és E.L. Rech. 1996. Idegen gének öröklődése részecskebombázással kotranszformált transzgenikus babban (Phaseolus vulgaris L.). Theor. Appl. Közönséges petymeg. 93, 142-150.

Aragao, F.J.L., L.M.G. Barros, M.V. Sousa, M.F. Grossi-de-Sa, E.R.P. Almeida, E.S. Gander és E.L. Rech. 1999. Brazília dióból (Bertholletia excelsa H.B.K., Lecythidaceae) származó metioninban gazdag tárolóalbumin expressziója transzgénikus babnövényekben (Phaseolus vulgaris L., Fabaceae). Gen. Mol. Biol. 22:445-449.

Aragao, F.J.L., S.G. Ribeiro, L.M.G. Barros, A.C.M. Brasileiro, D.P. Maxwell, E.L. Rech és J. C. Faria. 1998. A vírusos antiszensz RNS-ek expresszálására tervezett transzgenikus babok (Phaseolus vulgaris L.) késleltetett és gyengített tüneteket mutatnak a bab aranymozaik geminivírusával szemben. Mol. Fajta. 4:491-499.

Aragao, F. J. L., L. Sarokin, G.R. Vianna és E.L. Rech. 2000. A transzgenikus merisztematikus sejtek herbicid molekulát használó szelekciója a termékeny transzgénikus szójabab (Glycine max (L.) Merrill) növények nagy gyakoriságú visszanyerését eredményezi. Theor. Appl. Közönséges petymeg. 101:1-6.

Brasileiro, A.C.M., C. Tourneur, J.-C. Leple, V. Combes és L. Jouanin. 1992. A mutáns Arabidopsis thaliana acetolaktát szintáz gén expressziója klórszulfuron rezisztenciát biztosít a transzgenikus nyárfa növényeknek. Transg. Res. 1:133-141.

Dale, P. J. 1999. A nyilvánosság aggodalmai a transzgénikus növények miatt. Genome Res. 9:1159-1162.

De Block, M. 1993. A transzformáció sejtbiológiája: jelenlegi állapot, problémák, kilátások és következmények a növénynemesítésre. Euphytica 71:1-14.

Carpenter, J. és L. Gianessi. 2000. Gyomirtó szerek felhasználása kész terméseken. Science 287:803-804.

Dellaporta, S. L., J. Wood és J. B. Hicks. 1983. Egy növényi DNS minipreparátum: II. Mol. Biol. Rep. 1:19-21.

Edwards, K., C. Johnstone és C. Thompson. 1991. Egy egyszerű és gyors módszer növényi genomi DNS előállítására PCR analízishez. Nucleic Acids Res. 19:1349.

Enriquez-Obregon, G. A., R. I. Vazquez-Padron, D. L. Prieto-Samsonov, G.A. De la Riva és G. Selman-Housein. 1998. Herbicidrezisztens cukornád (Saccharum officinarum L.) növények Agrobacterium által közvetített transzformációval Planta 206:20-27.

Mohapatra, Egyesült Államok, M.S. McCabe, J. B. Power, F. Schepers, A. Van der Arend és M. R. Davey. 1999. A bar gén expressziója herbicid rezisztenciát biztosít transzgénikus salátában Transgenic Res. 8:33-44.

Murashige, T. és F. Skoog. 1962. Átdolgozott tápközeg gyors növekedéshez és dohányszövettenyészetekkel végzett biológiai vizsgálathoz. Physiol Plant 15:473-497.

Padgette, S.R., K.H. Kolacz, X. Delannay, D.B. Re, B.J. LaVallee, C.N. Tinius, W.K. Rhodes, Y.I. Otero, G.F. Barry, D.A. Eichholtz, V.M. Peschke, D.L. Nida, N.B. Taylor és G.M. Kishore. 1995. Egy glifozát-toleráns szójabab esemény kifejlesztése, azonosítása és jellemzése. Crop Sci. 35:1451-1461.

Register, J.C., D.J. Peterson, P.J. Bell, W.P. Bullock, I.J. Evans, B. Frame, A.J. Grönland, N.S. Higgs, I. Jepson, S. Jiao, C. J. Lewnau, J. M. Sillick és H.M. Wilson. 1994. Szelektálható és nem szelektálható transzgének szerkezete és működése kukoricában részecskebombázással történő bejuttatás után. Növény. Mol. Biol. 25:951-961.

Russel, D.R., K.M. Wallace, J.H. Bathe, B.J. Martinell és D.E. MacCabe. 1993. A Phaseolus vulgaris stabil átalakulása elektromos kisülés által közvetített részecskegyorsítással. Plant Cell Rep. 12:165-169.

Sambrook, J., E. F. Fritsch és T. Maniatis. 1989. Molekuláris klónozás: Laboratóriumi kézikönyv. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Steel, R.G.D. és J.H. Torrie. 1980. A statisztika alapelvei és eljárásai. McGraw-Hill, New York.

Thompson, C.J., N.R. Movva, R. Tizard, R. Crameri, J. E. Davies, M. Lauwereys és J. Botterman. 1987. A Streptomyces hygroscopicus herbicid-rezisztencia génsávjának jellemzése. EMBO J. 6:2519-2523.

Ulian, E. C., J. M. Magill és R. H. Smith. 1994. Két idegen gén expressziós és öröklődési mintázata petúniában. Theor. Appl. Közönséges petymeg. 88:433-440.

Francisco J. L. Aragao, * Giovanni R. Vianna, Margareth M. C. Albino és Elibio L. Rech


Transzgénikus növények alkalmazásai: 6 alkalmazás

Ez a cikk rávilágít a transzgenikus növények hat alkalmazására.

A hat alkalmazási terület a következő: (1) Biotikus stresszekkel szembeni rezisztencia (2) Abiotikus stresszekkel szembeni rezisztencia (3) A terméshozam és minőség javítása (4) Transzgénikus növények jobb táplálkozással (5) Kereskedelmi transzgénikus haszonnövények és (6) Transzgénikus növények, mint Bioreaktorok.

Leírták a növényekben a transzgenikus növények előállításához végzett genetikai manipulációkat. A transzgén végső célja (idegen gének bejuttatásával, integrációjával és expressziójával) a termés javítása a kívánt tulajdonságokkal.

A legfontosabbak közül néhányat felsorolunk:

én. A biotikus stresszekkel szembeni ellenállás, azaz ellenáll a rovarok, vírusok, gombák és baktériumok által okozott betegségekkel szemben.

ii. Ellenáll az abiotikus stressznek - gyomirtó szerek, hőmérséklet (hő, hűtés, fagy), szárazság, sótartalom, ózon, intenzív fény.

iii. Terméshozam, minőség javítása pl. tárolás, a gyümölcsök és virágok hosszabb eltarthatósága.

iv. Transzgénikus növények jobb táplálkozással.

v. Transzgénikus növények, mint bioreaktorok kereskedelmi termékek előállításához, pl. fehérjék, vakcinák és biológiailag lebomló műanyagok.

Környezeti stressz a növényeket:

A növény növekedését és fejlődését befolyásoló különböző típusú külső igénybevételek az 50.1. ábrán láthatók. Ezeket a feszültségeket jellemzőik alapján csoportosítjuk – biotikus és abiotikus feszültségek. A biotikus stresszt rovarok, kórokozók (vírusok, gombák, baktériumok) és sebek okozzák. Az abiotikus stressz okai a gyomirtó szerek, a vízhiány (amit a szárazság, a hőmérséklet és a sótartalom okoz), az ózon és az intenzív fény.

Szinte az összes feszültség, akár közvetlenül, akár közvetve, reaktív oxigénfajták (ROS) termelődéséhez vezet, amelyek oxidatív stresszt okoznak a növényekben. Ez károsítja a növények sejtes összetevőit, ami a növényi hozam csökkenésével jár.

A növényi biotechnológia fő célja olyan növények kifejlesztése, amelyek ellenállnak a biotikus és abiotikus stressznek.

1. alkalmazás. Biotikus stresszekkel szembeni ellenállás:

A növények géntechnológiája olyan növények kifejlesztéséhez vezetett, amelyek ellenállóbbak a biotikus stresszekkel szemben, amelyet három fő kategóriába sorolnak:

3. Gombás és bakteriális betegségekkel szembeni rezisztencia

1. Rovar (PEST) rezisztencia:

Becslések szerint a világ terméshozamának körülbelül 15%-a vész el rovarok vagy kártevők miatt. A gyakori rovarok és a károsodott növények válogatott listáját az 50.1. táblázat tartalmazza.

A termésben okozott károkat főként rovarlárvák és bizonyos mértékig kifejlett rovarok okozzák.

A termést károsító rovarok többsége a következő rendekbe tartozik (példákkal):

iii. Orthoptera (szöcskék).

Egészen régen a kémiai peszticidek jelentették a kártevők elleni védekezés egyetlen eszközét.

A tudósok a következő okok miatt kerestek alternatív módszereket a kártevőirtásra (azaz a növényvédő szerek használatának korlátai):

én. A kipermetezett növényvédő szer mintegy 95%-a lemosódik a növény felszínéről, és felhalmozódik a talajban.

ii. Nehéz a peszticideket eljuttatni a növények sérülékeny részeihez, például gyökerekhez, szárhoz és terméshez.

iii. A vegyi peszticidek nem bomlanak le hatékonyan a talajban, ami környezetszennyezést okoz.

iv. A peszticidek általában mérgezőek a nem célszervezetekre, különösen az emberekre és az állatokra.

Szerencsés, hogy a tudósok új biotechnológiai alternatívákat fedezhettek fel a vegyi növényvédő szerek helyett, ezáltal biztosítva a rovarellenállást a haszonnövényeknek. Rovarrezisztencia transzgénekkel rendelkező transzgenikus növényeket fejlesztettek ki. Körülbelül 40 magasabb rendű növények és állatok mikroorganizmusaiból nyert gént használtak fel a rovarokkal szembeni rezisztencia biztosítására haszonnövényekben. Röviden ismertetünk néhány megközelítést a rovarok biológiai védekezésére.

Mikroorganizmusokból származó rezisztencia gének:

Bacillus thuringiensis (Bt) toxin:

A Bacillus thuringiensist először Ishiwaki fedezte fel 1901-ben, bár kereskedelmi jelentőségét 1951-ig figyelmen kívül hagyták. A B. thuringiensis Gram-negatív talajbaktérium. Ez a baktérium parasporális kristályos fehérje toxint termel inszekticid hatással. A B. thuringiensis által termelt fehérjét inszekticid kristályos proteinnek (ICP) nevezik. Az ICP-k a sporuláló baktériumok által termelt endotoxinok közé tartoznak, és eredetileg a δ-endotoxinok közé sorolták őket (hogy megkülönböztessék őket az α-, β- és ƴ-endotoxinok többi osztályától).

A B. thuringiensis számos olyan törzsét azonosították, amelyek kristály (sírás) fehérjék széles skáláját termelik. Továbbá jellemezték a cry gének szerkezetét és a megfelelő toxin (δ-endotoxin) termékeiket. A cry géneket (legutóbb 1998-ban) nagyszámú (körülbelül 40) családba sorolják, amelyeket cry 1…… cry 40-nek neveznek, méretük és szekvenciahasonlóságuk alapján. És minden családon belül lehetnek alcsaládok. Így a Bt-toxinokat (Cry-fehérjéket) termelő gének teljes száma több mint 100.

A különböző Cry fehérjék szerkezetében bizonyos szekvencia-hasonlóságok mellett eltérések vannak. A Cry fehérjék molekulatömege nagy lehet (

70 kDa). A Cry fehérjékben mutatkozó különbségek ellenére három doménből álló közös aktív magjuk van.

A Cry fehérjék hatásmechanizmusa:

A Bt toxinok (Cry proteinek) többsége a Lepidoptera lárváival szemben aktív, míg egy részük specifikus a kétszárnyú és a hártyaszárnyú rovarok ellen. A Cry I toxincsoport protoxinjának molekulatömege 130 kilodalton (130 kDa).

Amikor ezt a parasporális kristályt lenyeli a célrovar, a protoxin aktiválódik a bélben a lúgos pH (7,5-8,5) és a proteolitikus enzimek kombinációjával. Ennek eredményeként a pro-toxin 68 KDa molekulatömegű aktív toxinná alakul (50.2. ábra).

A toxin fehérje aktív formája beépül a rovar bélhámsejtjeinek membránjába. Ennek eredményeként ioncsatornák képződnek, amelyeken keresztül a sejt ATP túlzott mértékű elvesztése következik be. Ennek következtében a sejtek anyagcseréje leáll, a rovarok abbahagyják a táplálkozást, kiszáradnak és végül elpusztulnak.

Néhány kutató az elmúlt években azt sugallja, hogy a Bt toxin kation-szelektív pórusokat nyit meg a membránokban, ami kationok beáramlásához vezet a sejtekbe, ami ozmotikus lízist és a hámsejtek pusztulását (és végül a rovarlárvák pusztulását) okozza. A Bt toxin nem mérgező emberre és állatra, mivel a pro-toxin toxinná való átalakulásához lúgos pH-ra és specifikus proteázokra van szükség (ezek nincsenek emberek és állatok).

Bt-toxin, mint biopeszticid:

A Bt-spórákból vagy izolált kristályokból készült készítményeket mintegy 50 éve használják szerves biopeszticidként.

Ez a megközelítés nem járt nagy sikerrel a következő okok miatt:

én. A toxin alacsony perzisztenciája és stabilitása (a napfény lebontja a toxint) a növények felszínén.

ii. A Bt toxin nem tud hatékonyan behatolni a növények különböző részeibe, különösen a gyökerekbe.

iii. Az előállítás költsége magas.

Növények Bt-alapú genetikai transzformációja:

Lehetővé vált a növények genetikai módosítása (CM) Bt-gének beillesztésével, és kártevőkkel szembeni rezisztenciát biztosítanak ezeknek a transzformált növényeknek. A hatékony kártevő-rezisztencia érdekében a transzgenikus növényekben a bakteriális génnek magas szintű expresszióval kell rendelkeznie. Ez nyilvánvalóan azt jelenti, hogy a transzgén transzkripciójának a promoter és terminátor szekvenciák hatékony ellenőrzése alatt kell lennie. A cry 1A és cry 3A fehérjék CaMV 35S vagy Agrobacterium T-DNS promóterek szabályozása alatti expresszálására tett korai kísérletek nagyon alacsony expressziót eredményeztek dohány-, paradicsom- és burgonyanövényekben.

A Bt cry 1A gén módosítása:

A vad típusú Bt cry 1A(b) transzgénről azt találtuk, hogy nagyon alacsony szinten expresszálódik transzgenikus növényekben. Ennek a génnek a nukleotid szekvenciáját módosították (a G+C tartalom megváltozott, több poliadenilációs szignál eltávolításra került, ATTTA szekvencia törölve stb.). Megfelelő szekvencia-változtatással a Bt toxin termékképződésének óriási (kb. 100-szoros) növekedése volt megfigyelhető.

Az USA a 90-es évek közepén engedélyezte az USA kereskedelmi forgalomba hozatalát a transzgénikus Bt-növények, amelyekről megállapították, hogy hatékony védelmet nyújtanak a rovarok okozta károk ellen (50.2. táblázat). Egyes biotechnológiai cégek saját márkanévvel több transzgénikus növényt vittek be a földekre. Ezek közül jelenleg csak kukorica és gyapot Bt-növények használatosak az USA-ban. A többi génmódosított növény különböző okok miatt kudarcot vallott.

A transzgénikus növények előnyei a Bt gének:

én. A Bt gének a növények minden részében expresszálhatók, beleértve a gyökereket és a szárak és a termések belső régióit is. Ez semmilyen vegyi növényvédő szerrel nem lehetséges.

ii. A növényekben mérgező fehérjék termelődnek, ezért környezetbarátak.

iii. A Bt-toxinok gyorsan lebomlanak a környezetben.

A rovarokkal szembeni ellenállás problémája Bt termények:

A transzgenikus növényeket hordozó Bf-gént tartalmazó fő korlát a Bt-rezisztens rovarok fejlődése. A Bf toxin egy fehérje, és a membránreceptor (a bélben), amelyen keresztül a toxin a hatását közvetíti, szintén fehérje. Lehetséges, hogy a receptorfehérjét kódoló rovargén megfelelő mutációi csökkenthetik a toxinkötést és hatástalanná tehetik azt. Ez néhány generáción belül megtörténhet a Bt-növények ismételt termesztésével.

Számos megközelítést alkalmaznak a rovarok rezisztencia kialakulásának elkerülésére:

én. Két különböző Bf toxin gén bejuttatása ugyanarra a célrovarra.

ii. Kétféle rovarrezisztencia génnel rendelkező transzgenikus növények fejlesztése pl. Bt gén és proteináz inhibitor gén.

iii. A Bt-kultúrák és a nem Bf-kultúrák közötti váltás szintén megakadályozhatja a rezisztencia kialakulását a rovarpopulációban.

A környezeti hatása Bt termények:

A Bt-növények környezetre gyakorolt ​​legsúlyosabb hatása a kártevő populáció rezisztenciájának kialakulása. 1999-ben egy másik kérdés is napvilágra került a Bt-növényekkel kapcsolatban. Azt jelentették, hogy a Bt-kukorica pollenje mérgező lehet a Monarch pillangó lárváira. Ez komoly ellenállást váltott ki a közvéleményben a Bt termésekkel szemben, hiszen a Monarch butterfly az USA egyik legszínesebb őslakója.

Később bebizonyosodott, hogy a Bt-növények uralkodólepkére gyakorolt ​​hatásával kapcsolatos félelmek a szükséges tudományos bizonyítékok nélkül voltak. Az uralkodólepke-epizód tanulsága az, hogy a CM-kultúrák kockázatait alaposan fel kell mérni, mielőtt jelentenék.

A Bt-t általában cry gént tartalmazó transzgénikus haszonnövényeknél használják, pl. Bt pamut. Ugyanígy a Cry fehérjéket Bt fehérjéknek is nevezik. Itt azt is meg lehet állapítani, hogy a szerzők négy különböző nevet használnak ugyanarra a fehérjecsoportra: δ-endotoxin, inszekticid kristályfehérje (ICP), Cry és most Bt.

Más mikroorganizmusokból származó rezisztencia gének:

Vannak más mikroorganizmusokból származó rovarrezisztens gének is. A legfontosabbak közül néhányat felsorolunk.

1. A Strepotmyces tenyészet szűrletének koleszterin-oxidáza toxikusnak bizonyult a zsizsik lárváira nézve. A koleszterin-oxidáz gént dohányba vitték transzgenikus növény kifejlesztése érdekében.

2. Az Agrobacterium tumefaciens izopentenil-transzferáz génjét dohányba és paradicsomba juttatták. Ez a gén egy fontos enzimet kódol a citokinin szintézisében. Az ezzel a transzgénnel rendelkező transzgénikus növényekről megállapították, hogy csökkentik a dohányszarvféreg levélfogyasztását és csökkentik az őszibarackburgonya-levéltetű túlélését.

Rezisztencia gének magasabb rendű növényekből:

Azt találták, hogy a magasabb rendű növényekből származó bizonyos gének is inszekticid hatású termékek szintézisét eredményezik. Egyes szerzők nem Bt inszekticid fehérjéknek tekintik őket. A rovarrezisztenciával rendelkező transzgenikus növények fejlesztésére használt növényi inszekticid (nem Bt) gének válogatott listája az 50.3. táblázatban található. Néhányat röviden ismertetünk.

Proteináz (proteáz) inhibitorok:

A proteináz inhibitorok azok a fehérjék, amelyek gátolják a proteináz enzimek aktivitását. Egyes növények természetesen proteináz inhibitorokat termelnek, hogy védelmet nyújtsanak a növényevő rovarok ellen. Ez azért lehetséges, mert a rovarok által lenyelt inhibitorok zavarják a rovar emésztőenzimjeit. Ennek eredményeként a tápanyaghiány a rovarok pusztulását okozza. Lehetőség van a rovarok elleni védekezésre úgy, hogy proteináz inhibitor géneket juttatunk be olyan kultúrnövényekbe, amelyek általában nem termelik ezeket a fehérjéket.

Cowpea tripszin inhibitor gén:

Megfigyelték, hogy az Afrikában termő vadon élő tehénborsó növényfajok ellenálltak a rovarok széles körének támadásának. A kutatási eredmények feltárták, hogy az inszekticid fehérje olyan tripszin inhibitor volt, amely képes volt elpusztítani a Lepidoptera (pl. Heliothis virescans), Orthaptera (pl. Locusta migratoria) és Coleoptera (pl. Anthonous grandis) rendbe tartozó rovarokat.

A cowpea tripszin inhibitor (CpTi) nincs hatással az emlős tripszinekre, ezért nem toxikus az emlősökre. A CpTi gént dohányba, burgonyába és olajrepcébe juttatták transzgenikus növények fejlesztése céljából. A rovarok túlélése és a növények károsodása sokkal alacsonyabb volt a CpTi gént tartalmazó növényekben.

A proteináz inhibitorok előnyei:

én. Számos, a Bt által nem ellenőrzött rovar hatékonyan védekezhet.

ii. A proteináz gén és a Bt gén együttes alkalmazása segít leküzdeni a Bt-rezisztencia kialakulását a növényekben.

A proteináz inhibitorok korlátozásai:

én. A Bt toxintól eltérően a rovarok elpusztításához magas szintű proteináz inhibitorokra van szükség.

ii. Szükséges, hogy az ember által fogyasztott növényi részekben a proteináz inhibitorok expressziója nagyon alacsony legyen, míg a rovarok által hasznosított növényi részeken magas legyen.

α-amiláz inhibitorok:

A rovarlárvák a keményítő emésztésére egy amiláz bélenzimet választanak ki. Ennek az enzimnek az α-amiláz inhibitorral történő blokkolásával a lárvák éheztethetők és elpusztíthatók. A babból izolált α-amiláz inhibitor gént (α-AI-Pv) sikeresen transzferálták és expresszálták a dohányban. Ellenállást biztosít a Coleoptera (pl. Zabrotes sub-fasciatus) ellen.

A lektinek növényi glikoproteinek, és toxinként működve rezisztenciát biztosítanak a rovarokkal szemben. A hóvirágból (Calanthus nivalis) származó lektin gént (CNA) átvitték és expresszálták burgonyában és paradicsomban. A lektin fő korlátai az, hogy csak a szúró és szoptató rovarok ellen hat, és nagy dózisokra van szükség.

Állatokból származó rezisztencia gének:

Emlősökből származó proteináz inhibitor géneket is átvittek és expresszáltak növényekben, hogy rezisztenciát biztosítsanak a rovarokkal szemben, bár a siker ebben az irányban nagyon korlátozott. Szarvasmarha pancreas tripszin inhibitor (BPTI) és α1A – antitripszin gének ígéretesnek tűnnek, hogy rovarrezisztenciát kínálnak a transzgenikus növényekkel szemben.

Rovarellenállás a Copy Nature Stratégián keresztül:

Az inszekticid gének (különösen a Bt) átvitele és a transzgenikus növények fejlesztése során tapasztalt korlátok arra késztették a tudósokat, hogy jobb alternatívákat keressenek. A Copy Natural Stratégiát 1993-ban vezették be (Boulter) azzal a céllal, hogy a rovarkártevők elleni védekezés viszonylag fenntartható és környezetbarát legyen.

A rovarrezisztens transzgenikus növények fejlesztésére irányuló másolási stratégia a következő szakaszokból áll:

1. A potenciális ügyfelek azonosítása:

A másolási természetvédelmi stratégia első lépése azon növények azonosítása (a világ minden tájáról), amelyek természetesen ellenállnak a rovarkárosításnak.

2. Fehérje izolálása és tisztítása:

Az inszekticid tulajdonságú fehérjét (a rezisztens növényekből) izoláljuk és tisztítjuk. Meghatározzák a fehérje szekvenciáját, és azonosítják a termeléséért felelős gént.

3. Izolált fehérje biológiai vizsgálata:

A fehérje célrovarokkal szembeni aktivitását laboratóriumi biológiai vizsgálattal határozzák meg.

4. Mérgező hatás vizsgálata emlősökön:

Feltétlenül szükséges tesztelni a fehérje toxicitását emlősökkel, különösen emberrel szemben. Ha a fehérjéről kiderül, hogy bármilyen káros hatása van, a másolat jelleg stratégiát meg kell szakítani.

A géntechnológia hagyományos technikáival a fehérjetoxinnak megfelelő izolált gént bejuttatják a haszonnövényekbe.

6. Transzgénikus növények kiválasztása:

A géntranszfer után a kifejlesztett transzgenikus növényeket tesztelni kell a transzgén öröklődése és megfelelő expressziója szempontjából. Az inszekticid fehérje rovarirtó hatását is értékelik.

7. Biológiai biztonság értékelése:

Szántóföldi nyomvonalakat kell végezni a terméshozam, a rovarkárosítás, a környezetre gyakorolt ​​hatás értékelésére a transzgénikus növény tekintetében. A természetmásolási stratégia, bár időigényes és sokszor sikertelen, figyelembe veszi a biológiai közösségek (növények, állatok, mikroorganizmusok) és a fizikai környezet összetett kölcsönhatását.

2. Vírusellenállás:

A haszonnövények vírusfertőzései a sejtosztódás elmaradását (hipoplázia), túlzott sejtosztódást (hiperplázia) és sejthalált (nekrózis) eredményezhetik. A vírusfertőzések általános hatásai a növekedés visszamaradása, a termékhozam csökkenése és néha a teljes terméskiesés. A különféle növényi kórokozók elleni védekezésre alkalmazott kémiai módszerek hatástalanok a növényi vírusok tekintetében, mivel a vírusok intracelluláris obligát paraziták.

Vannak azonban bizonyos biztonságos mezőgazdasági gyakorlatok a növények vírusfertőzésének ellenőrzésére/csökkentésére:

én. Vírus- – mentes magok használata.

ii. Irányítsd a növényi vírusokat terjesztő rovarokat.

iii. Irtsa le azokat a gyomnövényeket, amelyek alternatív gazdagazdaként szolgálnak a vírusok számára.

iv. Használjon olyan fajtákat, amelyek vírusrezisztenciával rendelkeznek.

Lehetőség van a növények immunizálására a vírusos károsodások ellen, ha vírusfehérjéket expresszálnak a növényi sejtekben. A géntechnológia fejlődésével valósággá vált a vírusrezisztens transzgenikus növények kifejlesztése.

Ez többnyire vírus által kódolt gének és vírusburok fehérjék, mozgási fehérjék, transzmissziós fehérjék, szatellit RNS, antiszensz RNS és ribozimek alkalmazásával történik. Az elmúlt években kísérletek történtek arra is, hogy állati gének felhasználásával vírusrezisztenciát biztosítsanak a növényeknek. Néhány fejleményt röviden ismertetünk.

A vírusburok fehérje által közvetített megközelítés a legsikeresebb a növények vírusrezisztenciájának biztosítására. 1986-ban fejlesztették ki először a dohánymozaik vírus (TMV) köpenyfehérje génjét expresszáló transzgenikus dohánynövényeket. Ezek a növények magas szintű rezisztenciát mutattak a TMV-vel szemben. Ezen a figyelemre méltó sikeren felbuzdulva a tudósok sokkal több vírussal dolgoztak (kb. 30), és olyan növényeket fejlesztettek ki, amelyek vírusburok-fehérje által közvetített védelemmel rendelkeznek.

A vírusköpeny-fehérje génforrásokkal rendelkező vírusrezisztens transzgenikus növények kiválasztott listáját az 50.4. táblázat tartalmazza. A vírussal szemben burokfehérje által közvetített rezisztenciát biztosító transzgénikus növények a rizs, burgonya, búza, dohány, földimogyoró, cukorrépa, lucerna stb. A használt vírusok közé tartozik a lucerna mozaikvírus (AIMV), az uborka mozaikvírus (CMV), a burgonya X vírus (PVX), burgonya Y vírus (PVY), citrus tristeza vírus (CTV) és R rizscsík vírus (RSV).

A vírusburok fehérjék előnyei:

Az egyik vírusból származó köpenyfehérje gén időnként rezisztenciát (keresztvédelmet) biztosít néhány más vírussal szemben, amelyek nem lehetnek rokonok, pl. A dohánynövény TMV-je rezisztenciát biztosít a burgonya X-vírussal, a lucerna mozaikvírussal és az uborka mozaikvírusával szemben.

A vírusburok fehérjéinek korlátozása:

A vírusburok fehérje által közvetített védelem sikeres az egyszálú RNS genommal rendelkező vírusok esetében. Ez a megközelítés azonban nem nagyon használható olyan vírusok esetében, amelyek genomja kétszálú RNS-t és egyszálú DNS-t tartalmaz.

A vírusburok fehérjéinek hatásmechanizmusa:

Mivel a transzgénikus növény egy adott vírus burokfehérjéjének génjét expresszálja, ugyanazon vírus azon képessége, hogy újra megfertőzze a növényeket, drasztikusan csökken. A vírusburok fehérje által közvetített védelemben elért figyelemre méltó siker ellenére a védelem molekuláris mechanizmusa nem ismert egyértelműen.

Mozgásfehérjék:

Mivel a vírus megfertőzi a növényi sejteket, gyors terjedése az érszövet sejtközötti csomópontjain (plazmadezma) keresztül a vírusok által termelt mozgási fehérjék részvételével megy végbe. A mozgási fehérjék jó példái a dohánymozaik vírus (TMV) 30 kDa fehérje és a brómmozaik vírus (BMV) 32 kDa fehérje.

Olyan transzgenikus dohánynövényeket fejlesztettek ki, amelyek mutáns 30 kDa mozgási fehérjét expresszálnak. Ezeknél a növényeknél sokkal kisebb a TMV fertőzés. Úgy gondolják, hogy a mutált mozgásfehérje verseng a vad típusú TMV által kódolt fehérjével, ezáltal csökkentve a vírus (TMV) terjedését.

Az elmúlt években az aranymozaikvírus és az afrikai manióka mozaikvírus komponenseit tartalmazó rekombináns mozgásfehérjét fejlesztettek ki. Ez a fehérje hatékonyan gátolja mindkét vírus terjedését. A mozgásfehérje stratégia előnye, hogy alkalmazható egyszálú DNS vírusokra (Gemini vírusok) is.

Transzmissziós fehérjék:

Jó a koordináció és a kölcsönhatás a növényi vírusok és a rovarvektorok között a vírusok egyik növényről a másikra való terjedéséhez. Bizonyos vírus által kódolt transzmissziós fehérjék hatékonyan végzik ezt a feladatot. Lehetőség van mutált transzmissziós fehérjék előállítására és a vírusok terjedésének blokkolására. Így a rovarok által terjesztett vírusok terjedése megakadályozható úgy, hogy a növényeket úgy alakítják át, hogy hibás vírusátviteli fehérjét expresszáljanak.

A növényi vírusszatellit RNS-ek kis RNS-molekulák, amelyek specifikus helper vírusok segítségével szaporodnak a gazdasejtekben. Ezeket a szatellit RNS-eket a megfelelő helper vírusokkal együtt kapszulázzák. Általánosságban elmondható, hogy a szatellit RNS-ek jelenléte csökkenti a vírusos betegség súlyosságát és a tüneteket, ezáltal csökkenti a vírus hatását.

A szatellitszekvenciákat tartalmazó transzgenikus növényeket úgy fejlesztették ki, hogy rezisztenciát biztosítsanak a vírusbetegségekkel szemben. Itt egy példát mutatunk be. Amikor az uborka mozaikvírus (CMV) megfertőzi a paprikanövényeket, súlyos tünetek jelentkeznek. Ezeket a tüneteket minimálisra lehet csökkenteni magasabb növényi terméssel, ha a CMV-t egy szatellit RNS-sel együtt oltják be.

A műhold-RNS megközelítést nem használják széles körben, számos korlát miatt:

én. A szatellit RNS egy része egyes növényekben fokozhatja a betegség tüneteinek súlyosságát.

ii. A szatellit RNS-ek nagyon gyorsan mutálódnak, ami néha erősen virulens ágenst eredményezhet.

iii. Újrakombinációkat észleltek a szatellit RNS-ek között. Ez súlyos következményekhez vezethet.

Az antiszensz RNS megközelítést úgy tervezték, hogy specifikusan zavarja a vírus replikációját.A géntechnológia segítségével egy gén komplementer DNS-szála (DNS-szekvencia) fordított orientációban illeszthető be (3′ → 5′, szemben az 5′ → 3′-vel), és ezt antiszensz génnek nevezik. .

Az antiszensz gén által termelt mRNS komplementer a normál gén által szintetizált mRNS-sel. Ennek eredményeként mindkét mRNS hibridizálódik, és így az mRNS normál transzlációja blokkolva van. Egy antiszensz gén sejtbe történő alkalmazásának az a nettó hatása, hogy blokkolja egy specifikus génexpressziót.

Lehetőség van vírusos antiszensz gének bejuttatására a növényekbe, és a vírusreplikációban részt vevő vírusszekvenciákkal komplementer mRNS-ek előállítására. Az antiszensz mRNS-ek blokkolhatják a vírusok replikációját (50.3. ábra). Kezdetben az antiszensz RNS megközelítést egyszálú RNS-vírusokban hajtották végre. Ennek a megközelítésnek a sikere azonban valószínűleg a következő okok miatt korlátozott volt.

én. Nagy koncentrációjú antiszensz mRNS-re lehet szükség.

ii. Az mRNS-sel való fehérje asszociáció megzavarja a hibridizációt (a szensz mRNS és az antiszensz mRNS között).

Az antiszensz RNS megközelítés hasznosabb lehet DNS-vírusok esetében. Valójában a paradicsom aranymozaik vírus (TGMV) replikázt kódoló szekvenciáját antiszensz orientációban klónozták, és dohánynövényekbe vitték be. A transzgenikus dohánynövények a TGMV replikáz antiszensz RNS-ét expresszálták. Ezek a növények rezisztensek voltak a TGMV fertőzéssel szemben.

A ribozimok kis RNS-molekulák, amelyek elősegítik az RNS katalitikus hasítását. A vírusrezisztencia biztosítására antiszensz RNS-ek formájában ribozimeket fejlesztettek ki, amelyek képesek a vírus (szensz) cél RNS-ek hasítására. A ribozim (antiszensz RNS) egy kis vírus-RNS-szekvenciához kötődik, és felhasad (50.4. ábra).

Ily módon blokkolható a vírus RNS replikációja. A ribozim-megközelítés azonban nem volt túl sikeres a növényekben.

3. Gombás és bakteriális betegségekkel szembeni rezisztencia:

A növények általános védekezési rendszerrel rendelkeznek a behatoló kórokozók ellen. Ez azonban nem igazán hasonlítható össze az állatok immunrendszerével. Valahányszor kórokozók (gombák, baktériumok) és növényi kártevők által okozott sejtkárosodás lép fel, a növények általános védekező rendszere arra készül, hogy bizonyos mértékű védelmet nyújtson a növénynek. A növények természetes betegségekkel szembeni ellenálló képessége nem megfelelő.

A növényi rezisztencia természetes rendszereivel kapcsolatos ismeretek azonban hasznosak a betegségekkel szembeni rezisztencia fejlesztésének biotechnológiai megközelítéseiben. Röviden ismertetjük a növények védelmét és a biotechnológiai megközelítéseket.

Patogenezissel kapcsolatos (Pr) fehérjék:

A behatoló kórokozók (gombák és baktériumok) elleni védekezés érdekében a növények alacsony molekulatömegű fehérjéket halmoznak fel, amelyeket együttesen patogenezishez kapcsolódó (PR) fehérjéknek tekintenek. A PR fehérjék különböző típusait és tulajdonságaikat az 50.5. táblázat tartalmazza. Leírunk néhányat a legfontosabbak közül.

A kitin a gomba sejtfalának alkotóeleme, amelyet a kitináz enzim hidrolizál. Bizonyos növényekből származó kitináz géneket izoláltak és jellemeztek. Egy talajbaktériumból (Serratia marcescens) nyert bakteriális kitináz gént vittek be és expresszáltak dohánylevelekben. Más munkások kitináz gént izoláltak babból (Phaseolus vulgaris), és ezzel a génnel transzgénikus dohány- és Brassica napus növényeket fejlesztettek ki. A transzformált dohánynövények rezisztensnek bizonyultak a Rhizoctonia solani kórokozó fertőzésével szemben. A B. napus esetében azonban a védettség viszonylag kisebb volt.

A glükanáz egy másik enzim, amely számos gomba sejtfalát lebontja. A legszélesebb körben használt glukanáz a β-1,4-glükanáz. A β-1, 4-glükanázt kódoló gént árpából izolálták, bejuttatták és transzgenikus dohánynövényekben expresszálták. Ez a gén jó védelmet nyújtott a talajban terjedő Rhizoctonia solani gombakórokozó ellen.

A gombás kórokozókkal szembeni rezisztencia sokkal nagyobb, ha kitináz és glükanáz termelő gének egyaránt jelen vannak a transzgénikus növényekben. Ezzel a megközelítéssel gombákkal szemben ellenálló dohányt, paradicsomot és sárgarépát fejlesztettek ki.

Ribosome-In Activating Proteins (RIP):

A riboszómákat inaktiváló fehérjék védelmet nyújtanak a gombás fertőzések ellen. Hatnak az eukarióta és prokarióta riboszómák nagy rRNS-ére (eltávolítanak egy adenint egy adott helyről), és így gátolják a fehérje bioszintézist.

Bizonyos RIP-eket azonosítottak, amelyek nem gátolják a növényi riboszómákat, és a megfelelő géneket felhasználták transzgenikus növények kifejlesztésére, pl. Az I-es típusú árpa RIP-et a gombás fertőzésekkel szembeni rezisztencia biztosítására használják. Egyes szerzők az antimikrobiális fehérjék kifejezést használják a RIP-ekre. Az antimikrobiális fehérjék további példái a lektinek, defenzinek, lizozim, tioninok stb.

A lizozim lebontja a sejtfal kitint és peptidoglikánját, így csökkenthető a gombás fertőzés. Eswinia carotovora elleni rezisztenciát biztosító lizozim gént tartalmazó transzgenikus burgonyanövényeket fejlesztettek ki.

A defenzinek antimikrobiális peptidek (26-50 aminosav), amelyek minden növényi sejtben megtalálhatók. Megtámadják a mikrobiális plazmamembránt, de ez nem elegendő a kórokozókkal szembeni rezisztencia biztosításához. Az elmúlt években mesterséges defenzin gént fejlesztettek ki és vittek be a burgonyába. Ezek a burgonyák rezisztenssé váltak az Eswinia carotovora baktériummal szemben.

A tionin fehérjék védelmet nyújtanak a baktériumok ellen is. A tionint kódoló géneket bevitték a dohányba, és az így kifejlesztett transzgenikus növény Pseudomonas syringae-vel szemben rezisztenciát mutatott.

A fitoalexinek másodlagos metabolitok, amelyek a növényekben a fertőzésre válaszul képződnek. Alacsony molekulatömegűek és antimikrobiális természetűek. Az általában speciális sejtekben vagy organellumokban jelenlévő fitoalexinek mobilizálódnak, amikor fertőzés következik be. Továbbá a fertőzés során gének indukciója következik be a fitoalexinek fokozott termelésére.

A sztilbén-szintáz kulcsenzim a közönséges fitoalexin szintézisében. A sztilbén-szintázt kódoló gént földimogyoróból izolálták, és bejutottak dohányba, rizsbe és Brassica napusba. A sztilbén-szintáz gént hordozó transzgenikus növények rezisztensek voltak egyes gombákkal szemben. A kifejlesztett transzgenikus növények válogatott listája, az átvitt génekkel és a kontrollált kórokozókkal együtt az 50.6. táblázatban található.

Fonálférgek Ellenállás:

A fonálférgek egyszerű férgek, amelyek a talajban találhatók. Teljes emésztőrendszerrel rendelkeznek. A világon a fonálférgek (orsóféreg) fertőzés miatti éves termésveszteség nagyon magas. Egyes munkások azonosítottak és klónoztak egy fonálféreg rezisztencia gént vadon élő répanövényekből.

Feltételezik, hogy ez a gén olyan fehérjét kódol, amely kimutatja a kártevőket (fonálférgeket), és védekező reakciókat vált ki a növényben. Úgy gondolják, hogy olyan kémiai vegyületek keletkeznek, amelyek elpusztítják a fonálféreg bélrendszerét. Kísérleteket tettek a fonálféreg rezisztencia gén cukorrépába történő átvitelére is. Nem sok sikerről számoltak be, a fő korlát a cukorrépa génmódosított sejtjeinek tenyésztésének nehézsége.

2. alkalmazás. Abiotikus stresszekkel szembeni ellenállás:

A növények folyamatosan környezeti igénybevételnek vannak kitéve, ami a kultúrnövények állapotának romlását és nagyon alacsony vagy akár teljes hozam hiányát is eredményezheti. A növények a különféle feszültségekkel szembeni tolerancia finom belső mechanizmusaitól függenek.

A kultúrnövények in situ toleranciája, ha jelen vannak, nem megfelelő, ezért nem tud védelmet nyújtani a stressz ellen. Stratégiák széles skálájára van szükség ahhoz, hogy a növényeket egy bizonyos típusú stressztűrő képesség ellen tervezzük. Leírunk néhány abiotikus stresszt és az ezek leküzdésére kidolgozott rekombináns stratégiákat.

Herbicid rezisztencia:

A gyomok (vad gyógynövények) nemkívánatos és haszontalan növények, amelyek a haszonnövényekkel együtt nőnek. A gyomok a csapdákkal versenyeznek a fényért és a tápanyagokért, amellett, hogy különféle kórokozókat hordoznak. Becslések szerint a világ terméshozama 10-15%-kal csökken a gyomok jelenléte miatt.

A gyomok problémájának kezelésére a modern mezőgazdaság a gyomirtó szerek széles skáláját fejlesztette ki, amelyeket összefoglalóan gyomirtóknak neveznek. Általában a gyomirtó szerek többsége széles spektrumú, mivel a gyomok széles skáláját képesek elpusztítani.

Egy jó vagy ideális gyomirtónak a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie:

én. Képes a gyomok elpusztítására anélkül, hogy károsítaná a haszonnövényeket.

ii. Nem mérgező állatokra és mikroorganizmusokra.

iii. Gyorsan áthelyezhető a cél üzemen belül.

iv. Gyorsan lebomlik a talajban.

A kereskedelemben kapható gyomirtó szerek egyike sem felel meg a fenti kritériumoknak. A gyomirtó szerek fő korlátja, hogy nem tudják megkülönböztetni a gyomnövényeket a haszonnövényektől. Emiatt a növényeket a gyomirtó szerek is érintik, ezért herbicidrezisztens növényeket kell kifejleszteni. Így ezek a növények lehetőséget adnak a gyomok hatékony elpusztítására (herbicidekkel), anélkül, hogy a kultúrnövényeket károsítanák.

Stratégiák a mérnöki herbicid-rezisztenciára:

Számos biológiai manipulációt alkalmaznak, amelyek különösen géntechnológiát foglalnak magukban a gyomirtószer-rezisztens növények fejlesztésére.

1. A célfehérje túlzott expressziója:

A gyomirtó hatású célfehérje nagy mennyiségben állítható elő, így a herbicid hatása elenyésző. A túlzott expressziót a gének több másolatának integrálásával és/vagy erős promóter használatával érhetjük el.

2. Javított növényi méregtelenítés:

A növények rendelkeznek természetes védekező rendszerrel a mérgező vegyületek (herbicidek) ellen. A méregtelenítés során a mérgező gyomirtó szert nem mérgező vagy kevésbé mérgező vegyületté alakítják át. A növényi méregtelenítő rendszer fokozásával a gyomirtó hatását csökkenteni lehet.

3. Herbicid méregtelenítése idegen gén használatával:

Idegen gén bejuttatásával a kultúrnövénybe a gyomirtó hatásosan méregteleníthető.

4. A célfehérje mutációja:

A herbicid által érintett célfehérje megfelelően módosítható. A megváltozott fehérjének képesnek kell lennie a natív fehérje funkcióinak betöltésére, de ellenáll a herbicid gátlásnak.

A rezisztens célfehérje gén azonosítása után bejuttatható a növényi genomokba, és így herbicidrezisztens növények fejleszthetők ki. A herbicidrezisztens növények fejlesztésének sikeréhez a célfehérje és a herbicidek hatásának alapos ismerete szükséges.

Röviden ismertetjük a növények herbicidrezisztenciájában elért néhány fejlesztést:

Glifozát rezisztencia:

A glifozát egy glicin-származék. Széles spektrumú gyomirtóként működik, és a világ 78 legrosszabb gyomnövénye közül 76 ellen hatékony. A glifozát kevésbé mérgező az állatokra, és a mikroorganizmusok gyorsan lebontják. Ezenkívül rövid felezési ideje van. A Monsanto amerikai vegyipari vállalat Round up néven forgalmazza a glifozátot.

A glifozát hatásmechanizmusa:

A glifozát gyorsan eljut a növények növekedési pontjaira. Alacsony koncentrációban is képes elpusztítani a növényeket. A glifozát az 5-enoil-piruvil-szikimát-3-foszfát-szintáz (EPSPS) enzim kompetitív inhibitoraként működik. Ez egy kulcsenzim a sikiminsav-útvonalban, amely aromás aminosavak (triptofán, fenilalanin és tirozin), fenolok és bizonyos másodlagos metabolitok képződését eredményezi (50.5. ábra).

Az EPSPS enzim katalizálja az 5-enoil-piruvil-szikimát-3-foszfát szintézisét sikimát-3-foszfátból és foszfoenoil-piruvátból. A glifozát szerkezete hasonló a szubsztráthoz, a foszfoenol-piruváthoz (50.6. ábra). Következésképpen a glifozát erősebben kötődik az EPSPS-hez, és blokkolja a normál sikiminsav útvonalat. Így a glifozát herbicid gátolja az aromás aminosavak és más fontos termékek bioszintézisét.

Ez a fehérje bioszintézis gátlását eredményezi (aromás aminosavak hiánya miatt). Ennek következtében a sejtosztódás és a növények növekedése gátolt. Ezenkívül a növényi növekedést szabályozó indol-ecetsavat (egy auxint) szintén triptofánból állítják elő. A glifozát nettó eredménye a növények elpusztulása. A glifozát mérgező a mikroorganizmusokra, mivel ezek is tartalmaznak shikimate útvonalat.

A glifozát nem mérgező az állatokra (beleértve az embereket is), mivel nem rendelkeznek shikimate útvonallal. A három (ebben az úton szintetizálódó) aromás aminosav közül a triptofán és a fenilalanin nélkülözhetetlen, és ezeket a táplálékkal kell ellátni, míg a tirozin fenilalaninból képződhet.

A glifozát-rezisztencia stratégiái:

Három különböző stratégia létezik a növények glifoszfát rezisztenciájának biztosítására:

1. A haszonnövény EPSPS génjének túlzott expressziója:

Az EPSPS túltermelő génjét Petúniában mutatták ki. Úgy találták, hogy ez az expresszió a génamplifikációnak köszönhető, nem pedig a gén fokozott expressziójának. A petúniából származó EPSPS gént izoláltuk és más növényekbe juttattuk be. Az EPSPS fokozott szintézise (körülbelül 40-szeresére) a transzgenikus növényekben rezisztenciát biztosít a glifozáttal szemben. Ezek a növények a vad típusú növények elpusztításához szükségesnél 2-4-szer nagyobb dózisban tolerálják a glifozátot.

2. Mutáns EPSPS gének használata:

A glifozáttal szembeni rezisztenciát biztosító EPSPS mutáns gént először a Salmonella typhimurium baktériumban mutatták ki. Azt találtuk, hogy egyetlen bázis szubsztitúció (C-7) egy aminosav változását eredményezte prolinról szerinre az EPSPS-ben. Ez a módosított enzim nem tud kötődni a glifozáthoz, így rezisztenciát biztosít.

A mutáns EPSPS gént Agrobacterium Ti plazmidvektorok segítségével vittük be dohánynövényekbe. A transzgén nagy mennyiségben termelte az EPSPS enzimet. A transzformált dohánynövények azonban csak marginális rezisztenciát mutattak a glifozáttal szemben. Ennek okát nem azonosították azonnal.

Később kiderült, hogy a shikimát útvonal a kloroplasztiszokban fordul elő, míg a glifozát-rezisztens EPSPS csak a citoplazmában termelődik. Ez az enzim nem transzportálódott a kloroplasztiszokhoz, ezért a probléma a rezisztencia biztosítása. Ez az epizód arra késztette a tudósokat, hogy felismerjék a kloroplasztiszok fontosságát a géntechnológiában.

A későbbi években a mutáns EPSPS gént egy kloroplaszt-specifikus tranzit peptid szekvenciával jelölték meg. Ezzel a megközelítéssel a glifozát-rezisztens EPSPS enzimet arra irányították, hogy szabadon bejusson a kloroplasztiszba, és rezisztenciát biztosítson a herbiciddel szemben.

3. A glifozát méregtelenítése:

A talaj mikroorganizmusai rendelkeznek a glifozát-oxidáz enzimmel, amely a glifozátot glioxiláttá és aminometil-foszfonsavvá alakítja. A glifozát-oxidázt kódoló gént egy Ochrobactrum anthropi talajszervezetből izolálták. Megfelelő módosításokkal ezt a gént kultúrnövényekbe juttatták be pl. repce. A transzgénikus növényekről azt találtuk, hogy a szántóföldön nagyon jó glifozát-rezisztenciát mutatnak.

Kombinált stratégia alkalmazása:

A növények glifozáttal szembeni hatékonyabb rezisztenciája kombinált stratégia alkalmazásával biztosítható. Így rezisztens (azaz mutáns) EPSPS gént glifozát-oxidáz génnel kombinálva alkalmaznak. Ezzel a megközelítéssel glifozátrezisztencia (a mutáns EPSPS gén miatt), valamint annak méregtelenítése (a glifozát-oxidáz gén miatt) jelentkezik.

Foszfinotricin rezisztencia:

A foszfinotricin (vagy glufozinát) szintén széles spektrumú gyomirtó, mint a glifozát. A foszfinotricin hatásosabb a széles levelű gyomok ellen, de legkevésbé az évelő növények ellen. (Megjegyzés: A foszfinotricin és a glufozinát ugyanazon gyomirtó szer két neve. A glifozát és a glufozinát összetévesztésének elkerülése érdekében azonban gyakrabban használják a foszfinotricint. A Basta Aventis és a Liberty a foszfinotricin kereskedelmi nevei).

Foszfinotricin – természetes gyomirtó:

A foszfinotricin egy szokatlan gyomirtó, amely egy természetes termék, nevezetesen a bialafosz származéka. A Streptomyces bizonyos fajai bialafoszt termelnek, amely két alanin-maradékhoz kötött foszfinotricin kombinációja, amely tripeptidet alkot. A peptidáz hatására a bialafosz aktív foszfinotricinné alakul (50.7. ábra).

A foszfinotricin hatásmechanizmusa:

A foszfinotricin a glutamin-szintáz enzim kompetitív inhibitoraként működik (50.7. ábra). Ez azért lehetséges, mert a foszfinotricin szerkezeti hasonlóságot mutat a glutamát szubsztráttal. A glutamin-szintáz gátlása következtében az ammónia felhalmozódik és elpusztítja a növényi sejteket. Ezenkívül a glutaminszintézis zavara a fotoszintézist is gátolja. Így a foszfinotricin herbicid hatása az ammónia toxicitás és a fotoszintézis gátlás együttes hatásának köszönhető.

A foszfinotricin rezisztencia stratégiája:

A Streptomyces sp-ben megfigyelt foszfinotricin természetes méregtelenítő mechanizmusa arra késztette a tudósokat, hogy ellenálló növényeket fejlesszenek ki ezzel a gyomirtó szerrel szemben. A foszfinotricin acetil-transzferáz enzim (a Streptomyces sp) acetilezi a foszfinotricint, és így inaktiválja a herbicidet.

A foszfinotricin-acetil-transzferáz (bar gén) kódolásáért felelős gént a Streptomyces hygroscopicusban azonosították. Néhány sikerről számoltak be a transzgénikus kukorica és olajrepce fejlesztésében a bar gén bevezetésével. Úgy találták, hogy ezek a növények rezisztensek a foszfinotricinnel szemben.

Szulfonilureákkal és imidazolinonokkal szembeni rezisztencia:

A herbicidek, nevezetesen a szulfonil-karbamidok és imidazolinonok gátolják az acetolaktát-szintáz (ALS) enzimet, amely az elágazó láncú aminosavak, nevezetesen az izoleucin, leucin és valin szintézisében kulcsenzim. Ennek az enzimnek a mutáns formáit és a megfelelő géneket izolálták, azonosították és jellemezték. Az ALS mutáns génjeit tartalmazó transzgenikus növények rezisztensnek bizonyultak szulfonil-karbamidokkal és imidazolinonokkal szemben, pl. kukorica, paradicsom, cukorrépa.

Ellenállás más gyomirtó szerekkel szemben:

A fentieken kívül néhány más gyomirtószer-rezisztens növényt is kifejlesztettek, pl. bromoxinil, atrazin, fenokarbonsavak, ciánamid. A géntranszferrel rendelkező herbicidrezisztens növények kiválasztott példáinak listája az 50.7. táblázatban található.

Megjegyzendő azonban, hogy néhány herbicidrezisztens transzgenikus növény a szántóföldi kísérleti szakaszban van. Környezetvédelmi aggályok miatt néhány ilyen növényt visszavonnak, pl. atrazin-rezisztens növények.

A herbicid-rezisztens növények környezeti hatásai:

A géntechnológiával módosított (GM) herbicidrezisztens növények fejlesztése kétségtelenül hozzájárult a növények terméshozamának növekedéséhez. Emiatt a gazdálkodók különösen a fejlett országokban (például az USA-ban) elkezdték használni ezeket a GM-növényeket. Így az USA-ban termesztett herbicidrezisztens szójanövények aránya az 1997-es 17%-ról 2001-re 68%-ra nőtt.

A gazdálkodó óriási hasznot húz, mivel csökkennek a gyomirtó szerek használatának költségei. Úgy gondolják, hogy a gyomirtószer-rezisztens növények környezetre gyakorolt ​​hatása sokkal kisebb, mint a gyomirtó szerek nagy mennyiségben történő közvetlen alkalmazása.

Vannak azonban más környezetvédelmi aggályok is:

én. A biodiverzitás megzavarása a gyomnövények kiirtása miatt.

ii. A gyomirtószer-rezisztens gyomok gyors fejlődése, amely végül szupergyomok kialakulásához vezethet.

Tolerancia a vízhiányos stresszekkel szemben:

A környezeti feltételek, mint a hőmérséklet (hő, fagy, hűtés), a víz rendelkezésre állása (szárazság miatti hiány) és a sótartalom befolyásolják a növények növekedését, fejlődését és termését.A hőmérséklet, a szárazság és a sótartalom miatti abiotikus stresszeket együttesen vízhiányos stressznek tekintik (lásd 50.1. ábra).

A vízhiány okai:

A vízhiány a következő okok miatt fordulhat elő:

én. Csökkentett talajvízpotenciál.

ii. Fokozott vízpárolgás (száraz, meleg és szeles körülmények között).

iii. Magas sókoncentráció a talajban (csökkenti a talaj vízpotenciálját).

iv. Alacsony hőmérséklet jégkristályok képződését eredményezi.

A vízhiány hatásai:

én. Ozmotikus stresszt eredményez.

ii. Gátolja a fotoszintézist.

iii. Növeli a toxikus ionok (reaktív oxigénfajták) koncentrációját a sejtekben.

iv. Vízvesztés a sejtből, ami plazmolízist és végül sejthalált okoz.

Ozmotikus stressztűrés:

A növényi sejtek erős ozmotikus stressznek vannak kitéve a vízhiány miatt. Az ozmotikus stressz leküzdésére azonban bizonyos vegyületeket termelnek, amelyeket együttesen ozmoprotektánsoknak vagy ozmolitoknak neveznek. Az ozmoprotektorok nem toxikus, kompatibilis oldott anyagok, és két csoportra oszthatók.

1. Cukor és cukoralkoholok pl. mannit, szorbit, pinitol, ononitol, trehalóz, fruktánok.

2. Ikerionos vegyületek: Ezek az ozmoprotektorok pozitív és negatív töltéseket hordoznak pl. prolin, glicin-betain.

Egy adott ozmoprotektáns termelése fajfüggő. A mannit, a prolin és a glicin-betain képződése szorosabban kapcsolódik az ozmotikus toleranciához.

Stratégiák vízhiánytűrő növények fejlesztésére:

Amint azt fentebb kifejtettük, az ozmoprotektánsok jó védelmet nyújtanak a növényeknek az ozmotikus stresszel és ezáltal a vízhiánnyal szemben. Ezért logikus géntechnológiai stratégiákra gondolni az ozmoprotektánsok fokozott termelésére.

Ebben az irányban történt némi előrelépés. Számos ozmoprotektáns előállításához szükséges bioszintetikus útvonalakat létrehozták, és a kulcsenzimeket kódoló géneket izolálták. Valójában némi előrelépés történt a magas ozmoprotektáns termelésű transzgenikus növények fejlesztésében.

Transzgénikus növények glicin-toetusin termeléssel:

A glicin-betain egy kvaterner ammóniumvegyület, és elektromosan semleges. A glicin-betain amellett, hogy sejtozmolitként működik, stabilizálja a fehérjéket és a membránszerkezeteket. A glicin-betain előállításához szükséges kulcsenzimek közül néhányat azonosítottak, pl. kolin-mono-oxigenáz, kolin-dehidrogenáz, betain-aldehid-dehidrogenáz.

Az ezeket az enzimeket kódoló géneket transzgenikus növények kifejlesztéséhez vitték át. Az Arthrobacter sp-ből származó kolin-oxidáz gén felhasználásával olyan transzgénikus rizst fejlesztettek ki, amely magasabb glicin-betaint termel (amely toleranciát biztosít a vízhiányos stresszel szemben).

Jégmagképző baktériumokkal szembeni ellenállás:

A jég képződése a növényi sejteken (külső membrán) összetett kémiai folyamat. Az elmúlt években felismerték a jégmagot képező baktériumok fontosságát. E baktériumok előfordulását a legtöbb növényben – gabonafélékben, gyümölcsökben és zöldségfélékben – jelentették. A jégmagot képző baktériumok fehérjéket szintetizálnak, amelyek vízmolekulákkal egyesülve jégkristályokat képeznek 32 °F körüli hőmérsékleten. Ahogy a jégkristályok nőnek, átszúrhatják a növényi sejteket, és súlyosan károsíthatják a növényeket.

Növények kémiai kezelése a jégképződés elleni védekezés érdekében:

A növényeket réztartalmú vegyületekkel lehet kezelni a baktériumok elpusztítására. Egy másik megközelítés a karbamid oldat használata, hogy a jégképződés minimális legyen.

A jégmínusz baktériumok ellenállnak a növényeknek a hideg hőmérsékletnek:

A Pseudomonas syringae baktérium a természetben az egyik legelterjedtebb jégképző organizmus. Genetikai manipulációkkal eltávolították azt a gént, amely a jéggel rokon bakteriális fehérjék szintézisét irányítja a P. syringae-ben. Ezeket az újonnan kifejlesztett baktériumokat jégmínusz baktériumoknak nevezik.

A kutatók azt javasolták, hogy a transzgénikus jégmínusz baktériumokat fiatal növényekre permetezzék. A cél az volt, hogy ezek a baktériumok fagytűrést biztosítsanak a növényeknek, és ezáltal növeljék a terméshozamot. A DNS-technológia ellenzői ellenezték ezt a megközelítést – a fő félelem az, hogy a bakteriális mutánsok egészségügyi komplikációkat okozhatnak az emberekben.

A kutatók azzal érveltek és igazolták, hogy a P. syringae-be nem kerül be új genetikai információ, és minden tekintetben szorosan összefügg a már a környezetben lévő szülővel. Az Egyesült Államokban elhúzódó bírósági eljárás után engedélyt adtak a jégmínusz baktériumok szántóföldi permetezésére.

1987-ben történt, hogy jégmínusz baktériumokat permeteztek a burgonya- és epernövényekre. A P. syringae másik törzse kereskedelmileg jelölt, mivel a Frostban-t később kifejlesztették és haszonnövényeken használták. Itt megjegyzendő, hogy a P. syringae jégmínusz baktériumai voltak az első transzgénikus baktériumok, amelyeket laboratóriumon kívül alkalmaztak. A kísérletek szerencsére biztató eredménnyel zárultak, mivel a fagyképződés miatti terméskárok csökkentek.

Arabidopsis hidegtűrő génekkel:

A tudósok sikeresen tudtak hidegtűrő géneket (körülbelül 20) kifejleszteni az Arabidopsis-ben, amikor ezt a növényt fokozatosan tették ki a lassan csökkenő hőmérsékletnek. Egy fehérjét kódoló koordináló gént is azonosítottak, amely transzkripciós faktorként működik a hidegtűrő gének expressziójának szabályozásában. A koordináló gén bejuttatásával a hidegtűrő gének expresszióját váltották ki, ami megvédte a növényeket a hidegtől. Ebben az irányban több munka folyik.

3. számú alkalmazás. A terméshozam és a minőség javítása:

A növényi géntechnológia fejlődésével a terméshozam és a minőség javulása valósággá vált. A terméshozam elsősorban a fotoszintetikus hatékonyságtól és a betakarítási indextől (a termés betakarított részéhez jutó szárazanyag hányadától) függ. A termés minősége a kívánatos tulajdonságok széles skálájától függ – az ehető részek táplálkozási összetételétől, ízétől, feldolgozási minőségétől, eltarthatóságától stb.

Zöld forradalom:

A Borlaug, Swaminathan és Khus által vezetett "zöld forradalom" lehetővé tette a világ élelmiszerellátásának megháromszorozását a 20. század utolsó három évtizedében. Ezt a genetikailag javított növényfajták elfogadása tette lehetővé, a termésgazdálkodás fejlődésével párosítva.

A magas hozamú búza- és rizsfajták fejlesztése lehetővé tette számos fejlődő országnak (jó példa erre India), hogy az élelmiszerhiányos helyzetből e gabonafélék nettó exportőre lehessen.

A zöld forradalom valósággá vált, amikor a gazdálkodók új kalászos vetőmagokat alkalmaztak, amellett, hogy nagy ráfordítást igénylő mezőgazdasági módszereket alkalmaztak - nitrogén-műtrágyák, gyomirtó szerek, növényvédő szerek használata, modern mezőgazdasági berendezések stb.

Válogatott példák terményekre a minőség és a hozam érdekében:

A növények széles skáláját manipulálták a tudósok a jobb hozam és minőség érdekében. Csak a kiválasztott példákat ismertetjük röviden.

Géntechnológia a gyümölcsök meghosszabbított eltarthatóságához:

A gyümölcsérés genetikai manipulálása a növényi géntechnológia fontos kereskedelmi szempontjává vált.

A gyümölcsérés késleltetése számos előnnyel jár:

én. Meghosszabbítja az eltarthatóságot, sértetlenül megőrzi a gyümölcs minőségét.

ii. A nagy távolságú szállítás egyszerűvé válik a gyümölcs sérülése nélkül.

iii. A lassú érés javítja az ízt.

Paradicsomban kiterjedt géntechnológiai munkát végeztek, és a fejlesztések egy részét ismertetik.

Biokémiai változások a paradicsom érés során:

A gyümölcsérés aktív folyamat. Megnövekedett légzés jellemzi, amelyet az etilénszintézis gyors növekedése kísér. A klorofill lebomlásával a gyümölcs zöld színe eltűnik, és egy vörös pigment, a likopin szintetizálódik (50.8. ábra).

A gyümölcs meglágyul a sejtfalat lebontó enzimek, nevezetesen a poligalakturonáz (PG) és a pektin-metil-észteráz aktivitása következtében. A fitohormon etilén termelése szorosan kapcsolódik a gyümölcs éréséhez, mivel beindítja a gyümölcs érési folyamatát. Az exogén etilén hozzáadása elősegíti a gyümölcs érését, míg az etilén bioszintézis gátlása drasztikusan csökkenti az érést.

A keményítő cukrokká történő lebomlása és nagyszámú másodlagos termék felhalmozódása javítja a gyümölcs ízét, ízét és illatát. Három, a paradicsom érésében részt vevő gént izoláltak és klónoztak. Az e gének által kódolt enzimeket és a gyümölcsérésben betöltött szerepüket az 50.8. táblázat tartalmazza.

A gyümölcsérés genetikai manipulációi:

A tudósok megpróbálták genetikailag manipulálni és késleltetni a gyümölcs érési folyamatát. Szinte minden kísérlet antiszensz RNS megközelítést tartalmaz.

A poligalakturonáz enzim manipulálása (Flavr Savr paradicsom kifejlesztése):

Amint már említettük, a gyümölcs megpuhulása nagyrészt a sejtfal (pektin) poligalakturonáz (PG) enzim általi lebomlásának köszönhető. A PG-ért felelős gént, a rothadó enzimet klónozták (pTOM 6). A poligalakturonáz antiszensz RNS-megközelítéssel történő genetikai manipulációja a Flavr Savr paradicsom kifejlesztéséhez (Calgene Company, USA) az 50.9. ábrán látható, és főként a következő szakaszokból áll.

1. A poligalakturonáz (PG) enzimet kódoló paradicsomból származó DNS izolálása.

2. PG gén átvitele vektorbaktériumba és komplementer DNS-molekulák előállítása.

3. Komplementer DNS bejuttatása friss paradicsomnövénybe transzgenikus növény előállításához.

A PG antiszensz RNS mechanizmusa megközelítés:

A normál paradicsomnövényben a PG gén egy normál (érzéki) mRNS-t kódol, amely a poligalakturonáz enzimet termeli, amely aktívan részt vesz a gyümölcsérésben. A PG komplementer DNS-e antiszensz mRNS-t kódol, amely komplementer a normál (szensz) mRNS-sel. A szensz és antiszensz mRNS-ek közötti hibridizáció hatástalanná teszi a szensz mRNS-t. Következésképpen nem termelődik poligalakturonáz, így a gyümölcs érése késik.

A Flavr Savr Tomato felemelkedése és bukása:

A génmanipulált paradicsomot, amelyet Flavr Savr (ejtsd: ízmentő) néven PC antiszensz RNS alkalmazásával használnak, az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága 1994. május 18-án hagyta jóvá. Az FDA kimondta, hogy a Flavr Savr paradicsom ugyanolyan biztonságos, mint a hagyományosan tenyésztett paradicsom. jelenti, ezért nincs szükség külön címkézésre. Az új paradicsom hűtés nélkül szállítható túl távoli helyekről, mivel több mint három hétig volt képes ellenállni a rothadásnak (a hagyományos paradicsom duplája).

Bár a Flavr Savr nagy felhajtással indult 1995-ben, a következő okok miatt nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket:

én. A transzgénikus paradicsomot nem lehetett megfelelően termeszteni az Egyesült Államok különböző részein.

ii. A paradicsom termése alacsony volt.

iii. A Flavr Savr ára magas volt.

Azzal érvelnek, hogy a Flavr Savr-t kifejlesztő cég túlzott lelkesedésében, hogy az első biotechnológiai vállalattá váljon, amely biotechnológiával előállított élelmiszert forgalmaz, nem fordított kellő gondot a transzgénikus növény fejlesztésére. És sajnos a belépés után egy éven belül a Flavr Savr-t visszavonták, és mára szinte feledésbe merült!

Az etilén bioszintézisének manipulálása:

Egyértelműen megállapították, hogy az etilén kulcsszerepet játszik a gyümölcsök érésében. Az etilén bioszintetikus útját az 50.10. ábra mutatja be. Az etilént S-adenozil-metoninból szintetizálják egy intermedier, nevezetesen 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav (ACC) képződésével, amelyet az ACC-szintáz enzim katalizál. A következő lépés az ACC etilénné történő átalakítása ACC oxidázzal.

Három különböző stratégiát fejlesztettek ki az etilén bioszintézisének blokkolására, és ezáltal a gyümölcs érésének csökkentésére.

1. Az ACC oxidáz antiszensz génje:

Az ACC-oxidáz antiszensz génjével transzgénikus növényeket fejlesztettek ki. Ezekben a növényekben az etiléntermelés körülbelül 97%-kal csökkent, a gyümölcsérés jelentős késéssel.

2. Az ACC szintáz antiszensz génje:

Az etilén bioszintézisét 99,5%-ban gátolta az ACC szintáz antiszensz génjének beépítése, és a paradicsom érése jelentősen késett.

3. ACC dezamináz gén beépítése:

Az ACC deamináz egy bakteriális enzim. Hat az ACC-re (eltávolítja az aminocsoportot), és ennek következtében csökken az etilén bioszintéziséhez szükséges szubsztrát elérhetősége. Az ACC-deaminázt kódoló bakteriális gént átvitték és paradicsomnövényekben expresszálták. Ezek a transzgenikus növények körülbelül 90%-ban gátolták az etilén bioszintézisét. A gyümölcs érése körülbelül hat héttel késett. Az 1. és 2. stratégiát antiszensz etilén technológiának nevezhetjük.

A gyümölcsök és zöldségek hosszabb eltarthatósága:

A gyümölcsök, zöldségek romlása és a leszedett virágok elöregedése, amit összefoglalóan betakarítás utáni romlásnak nevezünk, a mezőgazdaságban komoly gondot okoz. Ez különösen akadályozza az elosztórendszert, ha a szállítást távoli helyekre végzik. A különböző élelmiszerek érésének, öregedésének és romlásának késleltetését célzó sikeres manipulációk jelentősen hozzájárulnak a megfelelő élelmiszer-elosztáshoz és ezáltal a helyes mezőgazdasági gyakorlathoz.

Az etilén bioszintézisének visszaszorítása ígéretes területnek tűnik a gyümölcsök, zöldségek romlásának és a virágok öregedésének csökkentésére. Leírták a paradicsomban az etilénszintézis blokkolására szolgáló három különböző stratégiát. Valójában ugyanezek a megközelítések sikeresen alkalmazhatók más gyümölcsöknél, zöldségeknél stb., a hosszabb eltarthatóság érdekében.

Géntechnológia az elszíneződés megelőzésére:

A gyümölcsök és zöldségek elszíneződése a betakarítás utáni jelentős probléma az élelmiszeriparban. Bizonyos élelmiszer-adalékanyagokat adnak hozzá, hogy megakadályozzák az elszíneződést. Ezek az adalékanyagok azonban egészségügyi szövődményeket okozhatnak az emberekben.

Biokémiai szempontból a gyümölcsök és zöldségek elszíneződése főként a fenolok (mono- és difenolok) kinonokká történő oxidációjának köszönhető, amelyet egy enzimcsoport, nevezetesen a polifenol-oxidázok katalizálnak. Ezek az enzimek a mitokondriumok és a kloroplasztiszok membránjaiban lokalizálódnak. A polifenol-oxidáz szintézisének gátlására antiszensz megközelítést alkalmazó genetikai manipulációkat végeztek. Bizonyos sikerekről számoltak be a burgonya elszíneződésének megakadályozásában ezzel a stratégiával.

Génsebészet a virágpigmentációhoz:

A virágiparban folyamatosan próbálkoznak a díszvirágok vonzóbbá tételével (javítással vagy új színek létrehozásával), a betakarítás utáni élettartam meghosszabbítása mellett. A vágott virágipart nagyrészt (körülbelül 70%-ban) négy növény – rózsa, tulipán, krizantém és szegfű – uralja.

A virágpigmentek leggyakoribb típusa az antocianin’, a flavonoidok egy csoportja. A fenilalanin aminosavból kiinduló reakciósorozat során szintetizálódnak (50.11. ábra). A virág színe a keletkező antocianin kémiai természetétől függ.

én. Pelagonidin 3-glükozid – téglavörös/narancs.

ii. Cianidin 3-glükozid – vörös.

iii. Delfinidin-3-glükozid – kéktől liláig.

Az antocianin útvonal manipulálása enzimek:

Azonosították az antocianin reakcióút különböző reakcióiért felelős enzimeket. Genetikai manipulációkkal és mutációkkal a kívánt színű virágokat lehet előállítani. A legtöbb virág (rózsa, szegfű krizantém) nem rendelkezik kék színnel, mivel hiányzik a 3′, 5′-hidroxiláz (F 3′ 5′ H) kulcsenzim, amely delfinidin-3-glükozidot termel. Egy Florigene nevű cég genetikailag manipulálta és bevitte az F 3′ 5′ H enzimet kódoló gént (a Petunia hybrida-ból) a következő növényekbe.

A világ első genetikailag módosított (GM) virágát 1996-ban mutatták be. Mályva (kékes) színű szegfű volt, Moondust™ márkanévvel. Ezt követően sok más virágot állítottak elő és hoztak forgalomba.

Lehet-e enni a GM-virágokat?

A legtöbb országban a virágokat díszítő célokra használják, és általában nem eszik. Néhány országban, például Japánban azonban a virágszirmokat élelmiszerek díszítésére használják, és gyakran fogyasztják is. Ez fontos kérdést vet fel a GM-virágok biztonságával kapcsolatban, mivel emberi fogyasztásra nem szűrik őket alaposan. A jelenlegi hiedelem azonban az, hogy az antocianinok (a színező kémiai molekulák) természetes növényi anyagok, és fogyasztásuk valójában jótékony hatással lehet az egészségre.

Génsebészet a férfisterilitásért:

A növények a hímsterilitást akár a sejtmagból, akár a citoplazmából örökölhetik, a citoplazmatikus hímsterilitást (cms) a mitokondriális genom hibái okozzák. A hímsterilitást genetikai manipulációkkal lehet bevezetni, miközben a nőivarú növények fenntartják a termékenységet.

Dohánynövényekben a hímsterilitást a ribonukleáz enzimet kódoló mitokondriális mutáns gén segítségével vezették be. A ribonukleázt kódoló gént, nevezetesen a Bacillus amyloliquefaciens barnáz génjét dohánynövényekbe vitték át.

A ribonukleáz mérgező a tapetalis sejtekre, és így megakadályozza a pollen kialakulását, ami végső soron hímsterilitáshoz vezet. Ezzel a megközelítéssel hímsterilitású transzgenikus dohány, karfiol, gyapot, paradicsom, kukorica, saláta stb. növényeket fejlesztettek ki. A fenti növények hímsterilitása helyreállítható úgy, hogy keresztezzük őket egy második, ribonukleáz inhibitor gént tartalmazó transzgenikus növénykészlettel.

4. számú alkalmazás. Transzgénikus növények jobb táplálkozással:

A növényi termékek táplálkozási minőségének javítását célzó genetikai manipulációk nagy jelentőséggel bírnak a növényi biotechnológiában. Ebben az irányban a növények hagyományos keresztezése révén sikerült némi sikert elérni. Ez a megközelítés azonban nagyon lassú és nehéz, és sokszor nem adja meg a kívánt tulajdonságokat a táplálkozási minőségben. A géntechnológia válogatott példáit ismertetjük javított tápanyagtartalommal.

A magtározó fehérjék aminosavai:

Az emberben jelenlévő 20 aminosavból 10 esszenciális, míg a másik 10-et a szervezet képes szintetizálni. A 10 esszenciális aminosavat (EAA) a táplálékkal kell ellátni. A gabonafélék (rizs, búza, kukorica, kukorica) az EAA-k meghatározó szállítói. A gabonafélék azonban nem tartalmaznak megfelelő mennyiségben a lizin esszenciális aminosavat.

Másrészt a hüvelyesek (bengáli gramm, vörös gramm, szójabab) gazdagok lizinben és korlátozottak a kéntartalmú aminosavakban (az esszenciális a metionin). Transzgénikus utakat fejlesztettek ki a különféle kultúrnövények vetőmag-tároló fehérjéinek esszenciális aminosav-tartalmának javítására.

Lizin túltermelése deregulációval:

A négy esszenciális aminosavat, nevezetesen a lizint, metionint, treonint és izoleucint egy nem esszenciális aminosavból állítják elő aszparaginsavból (50.12. ábra). A lizin képződését az aszpartokináz (AK) és a dihidrodipikolinát-szintáz (DHDPS) enzimek visszacsatolásos gátlása szabályozza. Elméletileg lehetséges a lizin túltermelése a visszacsatolási szabályozás eltörlésével. Ez az, ami megvalósult.

Az AK és DHPDS enzimeket kódoló lizin-visszacsatolás érzéketlen géneket E. coliból és Cornynebacteriumból izoláltuk megfelelő genetikai manipulációkkal, ezeket a géneket szójabab és repce növényekbe juttattuk be. Az így kifejlesztett transzgénikus növények nagy mennyiségű lizint termeltek.

Metioninban gazdag fehérjéket kódoló gének átvitele:

Számos metoninban gazdag fehérjéket kódoló gént azonosítottak:

én. Kukoricában 21 KDa zein 28% metioninnal.

ii. A rizsben 10 kDa prolamin 20% metioninnal.

iii. Napraforgóban magalbumin 16% metioninnal.

Ezeket a géneket bevitték egyes terményekbe, például szójába, kukoricába és repcébe.

A transzgénikus növények magas kéntartalmú aminosav tartalmú fehérjéket termeltek.

Lizinben gazdag glicinin előállítása rizsben:

A glicinin a szójabab lizinben gazdag fehérje. A glicinint kódoló gént bevitték a rizsbe, és sikeresen expresszálták. A transzgenikus rizsnövények magas lizintartalmú glicinint termeltek. A glicinin további előnye, hogy emberben történő fogyasztása a szérum koleszterinszintjének csökkenésével jár (hipokoleszterinémiás hatás).

Mesterséges gének felépítése EAA-kban gazdag fehérjék előállítására:

Olyan mesterséges géneket próbálnak létrehozni, amelyek az esszenciális aminosavakat a kívánt arányban tartalmazó fehérjéket kódolják. Némi sikerről számoltak be egy 13% metioninmaradékot tartalmazó szintetikus fehérje előállításában.

Géntechnológia az élelmiszerek ízletességének javítására:

Az élelmiszerek tápértékén túl az íze is fontosabb az ember vonzásához. Só, cukor, aromák és sok más hozzávaló hozzáadásával szokás ízletessé tenni az ételeket. Jó lenne, ha egy étel eredendően étvágygerjesztő jellegű lenne.

Egy afrikai növényből (Dioscorephyllum cumminsii) izolált monellin fehérje moláris alapon körülbelül 100 000-rel édesebb, mint a szacharóz. A monellin gént paradicsom- és salátanövényekbe vitték be. Néhány sikerről számoltak be a monellin termelésben ezekben a növényekben, ami javítja az ízletességet.

Aranyrizs – Az A-provitaminnal dúsított rizs:

A világ lakosságának körülbelül egyharmada a rizstől, mint alapvető élelmiszertől függ. Az általában fogyasztott őrölt rizsben szinte hiányzik a P-karotin, az A-provitamin. Mint ilyen, az A-vitamin-hiány (éjszakai vakságot okoz) világszerte jelentős táplálkozási zavar, különösen a rizsből táplálkozó embereknél.

Az A-vitamin-hiány leküzdésére javasolták a rizs genetikai manipulálását, hogy β-karotint termeljenek a rizs endospermiumában. A rizsben lévő β-karotin jelenléte jellegzetes sárga/narancssárga színt ad, ezért az A-pro-vitaminnal dúsított rizst megfelelő módon aranyrizsnek kell tekinteni.

Az 50.13. ábra a P-karotin képződésének bioszintetikus útvonalát mutatja be. Az Aranyrizs előállításához szükséges genetikai manipuláció három, a fitoén-szintáz, a karotin-deszaturáz és a likopin β-cikláz enzimeket kódoló gén bevezetését követelte meg. Körülbelül 7 évbe telt három gén beillesztése a Golden Rice kifejlesztéséhez.

A Golden Rice szinte minden kifogásnak eleget tett a génmódosított élelmiszerek ellenzőinek. Sokan azonban továbbra is ellenzik az Aranyrizs nagyüzemi előállítását, mivel ez számos más GM-élelmiszer piacra lépését nyitja meg.

Az Aranyrizs fogyasztása ellen felhozott másik érv az, hogy a napi A-vitamin szükségletnek csak körülbelül 20%-át tudja kielégíteni. Ám a támogatók azt igazolják, hogy mivel a rizs a vegyes étrend része (sok más élelmiszer mellett), Az A-pro-vitamin hozzájárulása a Golden Rice révén meglehetősen jelentős.

Nemrég (2004-ben) brit tudósok egy csoportja kifejlesztette az Aranyrizs továbbfejlesztett változatát. Az új törzs, a Golden Rice 2 több mint 20-szor annyi A-vitamint tartalmaz, mint elődje. Azt állítják, hogy napi 70 g rizs fogyasztása megfelel az ajánlott A-vitamin-bevitelnek.

Géntechnológia a vitaminok és ásványi anyagok mennyiségének növelésére:

A magas A-pro-vitamin tartalommal kifejlesztett transzgénikus rizst (Golden Rice) fentebb ismertettük. A transzgénikus haszonnövényeket más vitaminok és ásványi anyagok fokozott termelésére is fejlesztik. Kifejlesztettek egy transzgenikus Arabidopsis thaliana-t, amely tízszer magasabb E-vitamint (α-tokoferol) képes termelni, mint az őshonos növény. Ez újszerű megközelítéssel valósult meg. Az A. thaliana rendelkezik azzal a biokémiai géppel, amely az α-tokoferolhoz hasonló szerkezetű vegyületet állít elő.

Egy gén is jelen van, amely végül képes α-tokoferolt termelni, de nem expresszálódik. Ezt az alvó gént egy baktériumból származó szabályozó gén beillesztésével aktiválták. Ez az E-vitamin hatékony termelését eredményezte. Egyes munkások megpróbálják növelni az ehető növények ásványianyag-tartalmát azáltal, hogy javítják a talajból való felszívódásukat. Némi sikerről számoltak be a megnövekedett vaskoncentráció tekintetében.

5. számú alkalmazás. Kereskedelmi transzgenikus kultúrnövények:

A transzgénikus növények termelésének éppen az a célja, hogy kereskedelmi jelentőséggel bírjanak a magas termelékenység mellett. 1995–1996-ban kerültek először a transzgénikus növények (burgonya és gyapot) a gazdálkodók rendelkezésére az Egyesült Államokban. 1998 és 1999 között öt fő transzgénikus növény (gyapot, kukorica, szójabab, repce és burgonya) terjedt el széles körben. Az USA-ban beültetett teljes terület mintegy 75%-át tették ki.

Az 50.9. táblázat tartalmazza a kereskedelmi használatra szánt (USA-ban engedélyezett) transzgénikus haszonnövények kiválasztott listáját. A fejlődési stádiumban lévő transzgénikus haszonnövényekre az 50.10. táblázatban található néhány példa. Ezeket a növényeket gondosan úgy tervezték, hogy olyan termékeket hozzanak létre, amelyek javítják az emberi egészséget és növelik a terméshozamot.

A növények biotechnológiai fejlesztésének céljai:

Körülbelül 30-40 olyan növény van, amelyet genetikailag módosítottak, és még sok mást is hozzáadnak. Közülük azonban csak nagyon kevesen kaptak engedélyt kereskedelmi használatra. Egy kiválasztott lista már szerepel az 50.9. táblázatban.

A genetikailag módosított (CM) haszonnövények végső céljait az alábbiakban soroljuk fel:

én. Betegségekkel szembeni ellenállás (rovarok, mikroorganizmusok).

ii. Javított nitrogénmegkötő képesség.

iii. Nagyobb termőképesség.

iv. Szárazsággal és a talaj sótartalmával szembeni ellenállás.

v. Jobb táplálkozási tulajdonságok.

vi. Jobb tárolási minőség.

vii. Gyógyszerészetileg fontos vegyületek előállítása.

viii. Allergének hiánya.

ix. Módosult érzékszervi tulajdonságok pl. fokozott édesség, mint a taumatinnál.

A transzgénikus növényekkel kapcsolatos aggodalmak:

A transzgénikus növények káros környezeti és egészségkárosító hatásaival kapcsolatos félelmek továbbra is fennállnak, annak ellenére, hogy ez idáig nem érkezett jelentés erről. Szinte az összes transzgénikus növény laboratóriumból a termőföldre történő átvitele a társadalmi és gazdasági szempontok mellett változatlanul jogi és szabályozási akadályokkal is jár.

A közvélemény által kifejezett fő aggodalom (amelyet a biotechnológusok is elismernek) a rovarok rezisztencia gének fejlődése, szupergyomok stb.

A fejlődő országok gazdáit nagyon aggasztja a vetőmag terminátor technológia, amely arra kényszeríti őket, hogy minden új növényhez vetőmagot vásároljanak. Ezek a gazdálkodók hagyományosan hozzászoktak az előző termés vetőmagjának felhasználásához, ami a vetőmag terminátor technológia miatt ma már nem lehetséges.

6. számú alkalmazás. Transzgénikus növények, mint bioreaktorok:

A genetikailag transzformált növények másik fontos alkalmazása bioreaktorként való felhasználásuk metabolikus és ipari termékek széles körének előállítására.


Rovarellenállás a növényekben | Genetika

Ebben a cikkben a növények rovarellenállásáról fogunk beszélni.

A rovarirtás komoly és legnagyobb kihívás a mezőgazdasági növények számára. Komoly aggodalomra ad okot a rovarok által okozott terméskár globális helyzete. A modern mezőgazdaság újszerű megoldásokat kínál a régi problémákra. A rovarirtó szerek széles körének használata ellenére a károk mértéke messzemenő következményekkel jár.

A kártevőirtás és a rovarok elleni vegyszeres irtás éves szinten több mint 12 milliárd dollár, és a teljes termelés 25-30%-át teszi ki a teljes veszteség. Ezen túlmenően, a kártevőkkel szemben ellenálló rovarok infestans tönkretehetik a termést. Emellett környezeti problémák is társulnak a rovar- és shyticid válogatás nélküli használatához.

Ebben a túlzott mértékű gyakorlatban néhány figyelemre méltó kivétel a rovarirtás biológiai módszereinek alkalmazása, azaz a Bacillus thuringiensis által termelt rovartoxinok alkalmazása. Bár a B. thuringiensis rovarirtásban való felhasználása újszerű megközelítésnek tűnik, de a valóságban ez már ősrégi gyakorlat, mert már több mint 40 éve használják biológiai rovarirtó szerként.

A rovarellenállás Ge­netic technológiája vonzó megközelítést kínál, és felülírhat minden hagyományos védekezési módszert. A Bt kristályfehérjéken kívül számos más biotechnológiai megközelítés, mint például a proteáz inhibitor, az α-amiláz inhibitorok, a kitináz és a koleszterin-oxidáz ésszerű sikert hozott a transzgénikus növények rovarirtási stratégiájában.

Számos kereskedelmi és géntechnológiával módosított rovarrezisztens növény jelent meg: transzgénikus kukorica, gyapotburgonya, amely Bt toxinokat expresszál. Észak-Amerikában ezek a növények már hatalmas területen nőnek, és sok transzgénikus növény más országokban történő kibocsátása is készül.

Bacillus Thuringiensis – Rovarirtás fegyvere:

A Bacillus thuringiensis spóraképző Gram-pozitív baktériumok számos helyen előfordulnak, például talajban, növényi felületen, porban és gabonatárolókban. Ezeket négy évtizede biorovarölő szerként használják. A baktériumokat először 1901-ben fedezték fel beteg selyemhernyó-lárvákból. Dr. Berliner izolálta ezeket a gyilkos baktériumokat beteg lisztmolylárvákból. Specifikus toxicitást mutatnak a mediterrán lisztmoly (Ephestia kuhnella) lárváira, és nem a lisztféreg lárváira.

A Bacillus fajokat a B, thuringiensis jelenléte alapján lehet megkülönböztetni a rokon parasporális crys­taloktól, amelyek a sporuláció során keletkeznek. A vegyi peszticidek válogatás nélküli használata és a környezetvédelem miatt az első Bt törzs 1960-ban kereskedelmi forgalomba került.

A Thuricid, a Bt kereskedelmi neve a lepidopteron rovarok irtására szolgál. Később több más törzset is teljesen újratelepítettek turiciddel, és közvetlenül a növényekre permetezték, hogy bizonyítsák rovarölő hatásukat.

1977-ig azt hitték, hogy a Bt csak a lepkék ellen tud fellépni. Ez a nézet megváltozott, amikor Goldberg izolálta a Bacillus thuringiensis Israelensis törzset a tóból, amelyben a szúnyogok kiterjedten szaporodnak. További vizsgálatok feltárták potenciális rovarölő szerepét más rovaroknál, például a szillevélbogárnál és a Colorado burgonyabogár lárvánál. A Bt ódeszájában több száz törzset izoláltak és jellemeztek sikeresen.

A B. thuriengensis különböző törzsei inszekticid hatásuk szerint különböznek egymástól. A legtöbb Bt aktív lepkék ellen, és néhány törzs a Diptorára specifikus, és a coleoptera törzseket is megfigyelték. A Bt kristályfehérje gyilkos fehérje.

A Bt növényekre történő permetezése a kristályfehérje UV-fény hatására gyors lebomlásához és aktivitásuk lazulásához vezet. Ezeket a problémákat hatékonyan és félénken kezelik olyan transzgenikus növények előállításával, amelyek folyamatosan expresszálnak kristályos toxikus fehérjét, és védettek a lebomlás ellen.

A Bacillus thuringiensis inszekticid fehérjéket képez, amelyek a spórák képződése során kristályos természetűek. A kristályfehérje teljes száraz tömege a spórák száraz tömegének 30%-át teszi ki. A kristályfehérje egy vagy több protoxinból áll, tömegük elérte a 160 000 daltont. A protoxinok proteolízissel történő lehasítása 55 000-70 000 peptidet eredményez, amelyek kifejezetten toxinok a lepkék és kétszárnyú rovarok számára.

A Bacillus thuringiensis parasporal crys­tal egy vagy több 8-endotoxinból vagy 130 kDa tömegű kristály (cry) fehérjéből áll. A δ-endotoxinok feloldódnak lúgos körülmények között vagy a rovarok középbélében, és 65 000 és 160 000 molekulatömegű fehérjéket bocsátanak ki, amelyek az endotoxinok aktív formáivá válnak, amelyeket aztán proteázok dolgoznak fel kisebb toxinfragmensek előállítására a bélhámsejtekhez kötődve. és ozmolitikus lízist okoz a sejtmembrán pórusképzésén keresztül.

A Bt kristályfehérje 130 kD méretű egyetlen polipeptidből áll, amelyből a toxinpeptid fele ekkora. A kristályfehérjéket kódoló gének nem a baktérium kromoszómájában, hanem a plazmidban helyezkednek el, például a HD-1 törzsben a baktériumokban két plazmid található, amelyek inszekticid toxin gént tartalmaznak. A B. thuringiensis toxinjai rendkívül specifikusak, így nem mérgezőek más szervekre. Ezekkel az egyedülálló tulajdonságokkal rendelkeznek, biztonságos rovarölő szerként és a kémiai rovarirtó szerek hatékony alternatívájaként is használhatók.

Az inszekticid kristályok nagy fehérjékből állnak, amelyek lényegében inaktívak, amikor egy rovar lenyeli a rovarirtó kristályfehérjék egy részét. A rovar középbélének lúgos környezete (pH 7,5-8,0) a kristályok feloldódását és protoxinjuk felszabadulását idézi elő.

Ebben a szakaszban a kristályfehérje inaktív, de a specifikus proteáz jelenléte a rovarok bélszakaszában N-terminális 65-70 kDa csonka formává válik, és az inaktív fehérjét azonnal aktív fehérjévé alakítják (20.6. ábra).

A feldolgozott aktív fehérje ezután a középbelet bélelő sejtek határmembránján lévő specifikus receptorhoz kötődik, és a rovar bejut a sejtmembránokba. Amikor ezek közül körülbelül nyolc aggregálódik, ez pórust vagy csatornát képez a membránon keresztül, ennek eredményeként a sejttartalom folyamatosan szivárog, ami a sejtek pusztulását okozza, és végül kolloid vagy ozmotikus lízissel elpusztul. Ezek a rendszerek nélkülözhetetlenek a tápanyagok felszívódásához. A károkozást követően a rovarok azonnal abbahagyják a táplálkozást, és végül éhen halnak, valószínűleg 24 órán belül.

A Bt gén pontos elhelyezkedése a plazmidban vagy a kromoszómális DNS-ben nélkülözhetetlen az izolálás előtt. A toxin gén konformációja úgy érhető el, hogy a Bt törzset konjugáljuk más, inszekticid hatástól mentes törzzsel. A Bt törzseket a plazmid és a kromoszómális DNS frakciók elválasztása követi a plazmid és a kromoszómális DNS elválasztásával.

Ha a toxin gén a plazmidban van kódolva, akkor szacharóz sűrűség centrifugálásnak vetjük alá, és frakcionálást követünk a plazmid DNS-hez. A tápközeget és a nagyobb plazmidot endonukleázokkal kezeljük, és a pBR322 plazmidba irányítjuk. A klónozott bankokat E coli-ba transzformáltuk. és immunológiai módszerrel szűrjük.

A kristályfehérjék osztályozása:

Nagyszámú Bt inszekticid σ endotoxin protein e gént is klónoztak és szekvenáltak. Eddig több mint 130 gént azonosítottak. A Bt inszekticid fehérjék általában cry gének néven ismertek, a fehérje aminosavszekvenciája alapján.

A cry I gének által kódolt fehérje csak a hernyóra toxikus. A cry I gének által kódolt fehérjék toxikusak a lepkékre vagy kétszárnyúakra (szúnyoglegyekre), míg a cry IV fehérjék csak kétszárnyúakkal szemben aktívak. A cry III gén azonban olyan fehérjéket termel, amelyeket fel lehet fegyverezni a bogarak, azaz a coleoptera lárvák ellen (20.2. táblázat).

A különböző sírócsoportokat tovább osztották alcsaládokra, például a cry I csoportot cry IA, lb, Ic csoportokra osztották, és hasonlóképpen öt alcsaládot készítettek a cry IA-ra.

Transzgénikus (Bt) növények első generációja:

A legkorábbi kísérletek némelyikében mind a teljes hosszúságú, mind a csonkolt sírás géneket sikerrel vitték be modellnövényekbe, például dohányba és burgonyába oly módon, hogy olyan növényi expressziós vektort terveztek, mint például a módosított Agrobacterium tumeifaciens, amely konstitutív promotert, teljes hosszúságú géneket, csonkolt géneket és terminált tartalmaz. jelet, jó védelmet nyújtanak a rovarok elleni védekezésben.

A későbbi vizsgálatok egyértelműen kimutatták, hogy a módosítatlan cryA gének expressziója túl alacsony volt ahhoz, hogy teljes védelmet biztosítson. A Bt-odesyben a toxin módosítását kényszerítették ki a rovarokkal szembeni rezisztencia fokozása érdekében. Elemeztük a Bt 2 gén klónozását B-thuringenesisből és a bakteriális E. coli rendszerben expresszált polipeptid jellemzését.

A jellemzett Bt 1155 aminosav hosszú, és erős toxint jelent számos lepkék lárvájára, mint például a dohánykártevőre (Maduca sexta), a paradicsomkártevőre (Heliothis vivescence és Helicoverpa). Bt2 egy protoxin generál legkisebb fragmentumot, amely még mindig rendelkezik teljes toxikus feltérképezéssel az NH-ban2-a fehérje terminális fele a 29. és a 607. aminosav között. A transzgenikus növények inszekticid aktivitását a transzgenikus növények leveleinek M. sexta lárvákkal való táplálása bizonyította, és a lárvák 75-100%-os mortalitását igazolja.

Több kutatócsoport folytatta munkáját, és terepi kísérleteket végzett Bt fehérjéket expresszáló transzgenikus növényekkel. Vizsgálatuk eredménye két fontos és félelmetes tényezőt tükrözött. Az egyik az, hogy kimutatták, hogy a Bt-gén szisztematikusan expresszálható transzgenikus növényekben. Egy másik a Bt toxin fehérje expressziós szintje. Kimutatták, hogy az inszekticid fehérje szintje a kivételesen kevés transzgenikus növényekben viszonylag alacsony volt, általában nem elegendő ahhoz, hogy védelmet nyújtson a növénynek a rovarfertőzés ellen.

A Bt Cry gének tervezése:

Az alacsony Bt génexpresszió rejtélye számos rovarirtással foglalkozó kutatócsoport célpontjává vált, és nagyobb figyelmet fordítottak a Bt gén expressziójának felgyorsítására és megszilárdítására, hogy a teljes védelem megvalósulhasson. A Bacillus thuringiensis cry gének tipikusan bakteriális gének. DNS-szekvenciájuk magas A/T tartalommal rendelkezik, mint a növényi gének, amelyekben a G/C arány magasabb, mint az A/T.

Az A/T összértéke a bakteriális gének esetében 60-70%, a növényi géneknél pedig 40-50%. Ennek következtében a cry gének kodonhasználatában a GC arány szignifikánsan nem elegendő az optimális szintű expresszióhoz. Ezenkívül az A/T-ben gazdag régió tartalmazhat transzkripciós terminációs helyeket (AATAAA poliadeniláció), mRNS instabilitási motívumot (ATTTA) és rejtélyes mRNS splicing helyeket.

Ezeket a régiókat a növényi transzkripciós rendszer destabilizáló szekvenciaként vagy intronként ismerheti fel. Néhány kritikus értékelést végeztek a cry gének, például a crylAb és a crylAc gének génmódosításával kapcsolatban transzgénikus dohányban, paradicsomban és gyapotban. A cry IAb részleges módosítása magában foglalja a 18 poliadenilációs helyből hét és a 13 ATTTA szekvenciából hét eltávolítását.

Ennek következtében a növények védettsége jelentősen, a Bt fehérje koncentrációja pedig tízszeresére nőtt a nem módosított génekhez képest. A Bt fehérje termelésének további 100-szoros növelését sikerült elérni a fennmaradó poliadenilációs helyek és az ATTA szekvencia eltávolításával, valamint a 615 kodonból összesen 356 kodon módosításával.

A Bt gén bizonyos szekvencia eltávolításával történő módosítása mellett a magasabb G/C tartalmú gének újraszintézise megoldotta az alacsony expresszió egyik fő problémáját. Ez lehetővé tette a kodonhasználat megadását egy adott terményhez. A szintetikusan módosított gén pontosan pro­portion, mint natív gén.

Ennek a Bt génnek a kifejeződése jelentős növekedést mutatott a cry 3A gén expressziójában transzgenikus burgonyában, és ezt úgy érték el, hogy teljes G/C-tartalmát 36%-ról 49%-ra növelték, ami a Colorado burgonyabogár elleni kiváló védelmet eredményezi. lárvák.A cry 1Ab vagy cry 1AC 100-szoros növekedését mutató transzgénikus gyapot teljesítményét 1990-ben megerősítették a gyapotkártevők, például a gyapotgomba-féreg elleni hatékony védekezés.

Ezt a magas szintű expressziót úgy értük el, hogy erős 35S promótert használtak megkettőződött enhanc­erekkel és szekvenciamódosítással a gén bizonyos régióiban, előre jelzett mRNS másodlagos szerkezettel. Innakone (1997) a cry 3B endotoxin gén szekvenciamódosításáról számolt be, amely magas szintű expressziót eredményezett. Amikor a cry 3B natív gént tojásnövénybe (Solanum melongena) vittük át, a toxin fehérje alacsony expresszióját és rezisztenciát nem észleltünk.

A cry 3 osztályba tartozó Bt 43 nukleotid szekvenciája részben módosult négy célrégió helyettesítésével rekonstruált szintetikus fragmensekkel. A Bt 43 wt (vad típusú) kódoló szekvenciáját részben újratervezték, és kilenc DNS-fragmenst azonosítottak a szubsztitúció (módosítás) célpontjaként.

A szintetikus Bt géneket úgy tervezték meg, hogy módosított régiójukban a kutatók szándékosan kerülik az olyan szekvenciákat, mint az ATTA szekvencia, poliadenilációs szekvencia és splicing helyek, amelyek destabilizálhatják a hírvivő RNS-t. Ezenkívül a kodonhasználatot az AT-ről a magas GC-arányra javították a jobb expresszió érdekében.

A módosított gén négy változatot eredményezett (BtE, BtF, BtH és Btl). A Btl gén módosított változatában a teljes G + C arány a vad típusú gén 34%-áról 45%-ra nőtt (20.7. ábra). Módosított változatokkal nyert transzgénikus növények. A BtH és a Btl teljesen rezisztensek voltak a Leptinotorsa decemlivel szemben.

A pontozott négyzeteket a nukleotidszekvencia helyettesítése jelzi.

Módosított szintetikus cry IA (b) gént vittek át a káposztafajtába, és ex­pressziójuk jelentős inszekticid hatást eredményezett a transzgénikus káposztanövényben a gyémántmoly lárváival szemben. Ezek az eredmények azt is megmutatják, hogy az egyszikű kodonhasználaton alapuló szintetikus gén kétszikű növényekben expresszálható rovarfertőzés céljából.

A módosított Bt gén hatékony expressziója az erős CamV 35S szabályozása alatt jól dokumentált. Ezenkívül más promotereket is alkalmaztak, mint például seb indukálható promotereket, kémiailag indukálható promotereket és szövetspecifikus promotereket. Egyes esetekben a Bt pro­teint a dohány kloroplasztjában expresszálták a Rubisco kis alegység promóterével, amely műanyag szignálpeptidhez fuzionált.

Meglepő módon kloroplaszt transzformáció is végrehajtható még a módosítatlan Bt fehérje jobb expressziója érdekében. Ez azt mutatja, hogy a plasztidok transzkripciós és transzlációs gépezete hasonló a kloroplasztiszokhoz. Ezért a crylAc se­quence módosítását sok esetben szükségtelennek találtuk.

A kétszikűeken kívül az egyszikűek több tagját is transzformáltuk Bt kristályfehérjével. A csonka cry 1A6 gént tartalmazó kukorica átalakítása a kodonok kukorica kodonokkal való teljes helyettesítésével a gén GC-tartalmának százalékos növekedését eredményezte (37%-ról 65%-ra). Ennek következtében a transzgénikus kukorica kiváló védelmet nyújtott az európai kukoricabogár ellen.

Egy másik esettanulmány az egyszikűek közül a szintetikus Cry IA (b) gén expressziója Indica rizsben. A transzgénikus rizsnövények leveleikben magas szintű expressziót mutattak, és hatékonyan védekeznek a rizs kártevői ellen Ázsiában. A sárga szárfúró (YSB) és a csíkos szárfúró (SSB) és két levélhajtogató faj táplálkozásgátlása.

A rovarrezisztens transzgenikus növények második generációja:

A transzgenikus inszekticid növények első generációja δ-endotoxinokból áll, amelyeket jelenleg nagy mennyiségben használnak a mezőgazdaságban. Bár a Bt toxin egy figyelemre méltó fehérje, mivel védelmet nyújt számos gazdaságilag fontos növénynek a rovarok elleni küzdelemben.

Általános teljesítményükről kiderült, hogy nem hatékonyak egyes gazdaságilag fontos rovarkártevők ellen, mint például az északi és nyugati kukoricagyökér-férgek, valamint a zsizsik. Ennek eredményeként alternatív és shytive stratégiákat fejlesztettek ki az új rovarölő fehérjék jellemzésére.

A legjobb módszer az inszekticid fehérjék bakteriális termelésének szűrése a bakteriális növekedés fiziológiás szakaszaiban, kivéve a fehérje és a sporulációs szakasz keresését, ahol a Bt fehérje termelése normálisan megy végbe. Ezen túlmenően, még a növényi mintákban is szűrik az új rovarölő fehérjeforrásokat, különösen a trópusi növényekben. Az alábbiakban bemutatunk néhány nem Bt rovarölő fehérjét, amelyek védelmet nyújtanak számos kártevő ellen.

VIP’s Toxin Protein (vegetatív inszekticid fehérje):

A Bt inszekticid fehérje alternatíváinak újszerű rovarirtó szerek kutatása során felfedezték, hogy bizonyos Bacillus fajok új rovarölő fehérjét termelnek a tenyészetben a növekedés vegetatív szakaszában (lag fázis). Jelenlétüket bacillussal tisztított tenyészetből nyert felülúszóban igazoltuk.

A Bacillus cereus felülúszó folyadékai a tesztelés során erős inszekticid hatást mutatnak a kukoricagyökérférgek ellen. Az inszekticid fehérjét VIP-ként azonosították1 és VIP2. Ezen kívül VIP3Az inszekticid fehérjék egy új osztálya nem mutat szekvenciahomológiát az ismert Bt cry fehérjékkel, és specifikusan kötődik a nem Bt receptorokhoz a rovarok középbélében.

Jelenleg VIP3 felülvizsgálat alatt áll a rovarrezisztencia kialakulásának sebességének csökkentésében való hatékonysága szempontjából. Ez a három vip fehérje számos pozitív töltésű maradékot mutat, amelyet egy hidrofób magrégió követ. A vip-fehérjék rovar- és shycid-hatékonysága azt mutatja, hogy akut bioaktivitást mutatnak érzékeny rovarokkal szemben (ng/ml étrend).

A Bt toxin fehérje a vip fehérjék azonos koncentrációjával mutat bioaktivitást. A jobb rovar- és shyticid aktivitás a VIP 2A fehérjéhez kapcsolódik, különösen, mivel rovarölő hatást fejt ki a lepkék rovarok széles spektruma ellen, mint például a céklaféreg, a vágott féreg és a seregféreg. Az érzékeny rovaroknál a vip 3A fehérje bélbénulást okoz, miután specifikusan kötődik a bélhámhoz, majd e sejtek teljes lízisét követi.

Proteináz inhibitorok:

Ezek az inhibitor fehérjék, amelyek csökkentik a rovarok táplálkozási hatékonyságát az emésztőenzim inaktiválásával. Ezzel megfosztották a rovarokat a táplálkozástól. A transzgénikus növények expresszálják a szégyenlős proteináz inhibitorokat a rovarok növekedésének késleltetéseként, amikor a növényekkel táplálkoznak. Számos növény, különösen a hüvelyesek jelentős mennyiségű inhibitor fehérjét tartalmaznak.

Amint ezek a pro­teinek bejutnak a rovarok emésztőrendszerébe, megbénítják a fehérje emésztőenzimeket. Ezeknek a fehérjéknek a génjét a növényekben jellemezték és felhasználták a transzgenikus technológiában rovarrezisztens növények előállítására. Az egyik klasszikus példa a jól jellemzett tripszin inhibitor gén klónozása. Ennek a génnek a növényekbe történő átvitele jelentős védelmet nyújt a sev­eral rovarok ellen.

A kitináz enzimet inszekticid fehérjeként tárták fel. A dohányban lévő kitinázokat kivonó transzgénikus növények védelmet nyújtanak a dohányrügyféreg ellen, miután a rovarok elkezdik táplálni a szöveteket. A kitináz enzim a peritróf membránként ismert kitin szerkezetet célozza meg, amely a rovarok középbél lumenében van jelen. A hatékony védekezés érdekében a növényben nagy mennyiségű kitinázt kell termelni, mivel a rovarokban a peritróf membrán folyamatosan regenerálódik.

Ezek sok növényben jelenlévő haeme agglutinin fehérjék, amelyeket hatékony rovarölő tulajdonságuk miatt rovarok elleni védekezésre használnak. Egyszer azt hitték, hogy a lektinek a Bt 6 endotoxin alter&synatíva lehet. Jól jellemezhető a lektin azon képessége, hogy megköti a glikozilált fehérjéket a rovarok középbélén. Rovarölő hatása azonban csak akkor igazolódik, ha a rovarok nagy mennyiségben vannak kitéve az étrendben.

Számos jelentés érkezett lektint kódoló géneket expresszáló transzgenikus növényekről. De rovarölő fehérjeként való teljesítményüket minimális expressziós szintjük miatt nem találták kielégítőnek. Számos jelentés érkezett azonban a búzacsíra lutint, jakalint vagy rizslektint expresszáló transzgénikus kukoricáról, amikor az európai kukoricabogárra tesztelték a lárvák minimális növekedését.

Ez az aciszterol-oxidáz nagy családjába tartozó fehérje, ahol a koleszterin-oxidázt (CO) tartalmazó táplálékkal táplált zsizsiklárvák szerkezeti elváltozást mutattak a bélközéphámsejtekben. A ‘CO’-nek való kitettség után sejtgyengülést mutatott, amelyet helyi citolízis kísért. Ezek a citológiai tünetek arra utalnak, hogy a ‘CO’ megváltoztatja a membránba beépült koleszterint.

A koleszterin nélkülözhetetlen az összes sejtmembrán szerkezeti integritásához és normál működéséhez. A koleszterin-oxidáz katalizálja a koleszterin oxidációját, és ezzel elősegíti a ketoszteroidok és a hidrogén-peroxid képződését. Ezért a koleszterin membránba való beépülésének bármilyen beavatkozása veszélyeztetheti a sejtmembrán integritását, és végül a sejt lízisét és elhalását.

Az aktív koleszterin-oxidázt expresszáló transzgenikus növényeket natív koleszterin-oxidáz génnel transzformált dohányprotoplasztban démonizálták. Amint a rovarok elkezdenek táplálkozni transzgénikus növényekkel, úgy tűnik, hogy a bélhámjuk a CO elsődleges célpontja, és ennek következtében a rovarok halálához vezet.

A fotorabdus lumineszcenciából származó toxin A (TcdA) expressziója transzgenikus növényekben fontos lépést jelent a rovarok elleni küzdelemhez szükséges új gének keresésében. Történetesen ez volt a klasszikus példa a természetben a rovarok elleni védekezésben részt vevő szimbiotikus baktériumok kiaknázására.

A Photorabdus luminiscence egy baktérium, amely szimbiotikusan él a Heterorhabditis fonálférgében. Ez a fonálféreg rovarok parazitája, és nagyszámú rovarra rendkívül patogén. A rovarok patogenitása elsősorban a symbi­otic baktériumok fotorabdus luminiscencia jelenlétének köszönhető.

Amikor a numatoda behatol egy rovarba, és visszaveri a baktériumokat, amelyek aztán A toxint termelnek, amely elpusztítja a rovarokat. A bakteriális eredetű toxin A kiváló hatást fejt ki legalább egy lepkék kártevő (Manduca sexta) ellen, összehasonlítva a Bt rovarölő aktivitásával. Bizonyos aktivitást mutatott a déli kukoricagyökérféreg, a kukorica fontos kártevője ellen is.

Beszámoltak a tcdA gén, a 283 kDa fehérjét kódoló toxin A expressziójáról Arabidopsis thaliana-ban. A tcdA gén 7548 bp-ból áll, és az A toxint kódolja, amely az egyik legnagyobb transzkriptum, amelyet valaha transzgenikus növényben készítettek.

Azt találták, hogy az expressziós szint megnőtt a nagy dózisú stratégia alkalmazásával, amelyben a dohány ozmotin gén 5′ és 3′ untranslated region (UTR) hozzáadása tízszeresére növelte a toxin A termelést. Ezek a vizsgálatok segíthetnek csökkenteni a rezisztencia kialakulásának sebességét, és ennek következtében a kártevőkkel szembeni rezisztencia kezelését.


Anyagok és metódusok

Plazmidok és klónozás

A génösszeállítást ben végezték el E. coli DH5α a BioBrick 23-as összeállítási szabványt [26] használva, és az összes leírt alkatrészt benyújtották a BioBrick Registry-nek. Az Arabidopsis pORE sorozatú vektorokat a The Arabidopsis Information Resource (TAIR) biztosította, és úgy tervezték, hogy támogassa a BioBrick klónozást PCR-alapú módszerekkel (lásd 1. további fájl: S1 táblázat). A pORE Open Series O1 és O2 vektorokat Spel és SacII enzimekkel emésztettük, és a BioBrick többszörös klónozási helyet (MCS) tartalmazó Nhel és SacII túlnyúlókkal ligáltuk a V1 és V2 vektorok létrehozására. A pORE Expression Series E3 és E4 vektorokat HindIII-mal és Spel-gyel emésztettük, és a pENTCUP2-promótertől 5'-irányban található HindIII-helyet és a BioBrick MCS-t, valamint egy Nhel-helyet tartalmazó expressziós vektorokból amplifikált inszert PCR-el ligáltuk, hogy létrehozzuk a V3 és V4 vektorokat. A gusA riportert tartalmazó R1 és az smGFP riportert tartalmazó R3 pORE Reporter Series vektorokat HindIII-mal és Spel-gyel emésztettük, és a riportergént tartalmazó inszertekkel ligáltuk, PCR-rel amplifikáltuk HindIII helyet tartalmazó primerekkel, majd a BioBrick MCS upstream és Nhel-gyel. lefelé, a V5 és V6 vektorokat eredményezve.

A brazzeint és a miraculint kodonra optimalizálták az Arabidopsis-ban való expresszióhoz, kereskedelmi forgalomban szintetizálták (Mr. Gene, Regensburg, Németország), és összeállították a pENTCUP2 promoterrel és a NosT transzkripciós terminátorral. Az elkészült konstrukciókat a BioBrick V0120 összeállítási vektorból BioBrick módosított pORE vektorokba szubklónoztuk EcoRI és PstI emésztéssel.

Az üzem karbantartása

Vad típusú Col-0 Arabidopsis thaliana A magvakat 70%-os etanollal, 0,1%-os Triton X-100-zal végzett mosással, majd kétszer 95%-os etanolos mosással és két steril dH-val sterilizáltuk.2Ó mosok. A magokat ezután 1X Murashige & Skoog (MS) táptalajra szélesztettük 0,7% agarral, kiegészítve 150 uM karbenicillinnel, és sötétbe helyeztük 4 °C-on három napra, majd 16 órán át 20 °C-on és 8 órán át megvilágított inkubátorba vittük. Sötétben 15°C-on naponta, hogy a magvak kicsírázhassanak. Miután a növények másodlagos leveleket hoztak létre, a talajba kerültek, és hagyták érni, és magokat termelni. A magokat összegyűjtöttük és 4 °C-on tároltuk.

Növény átalakítás

AgrobacteriumA -mediált transzformációt a korábban ismertetett technikák szerint hajtották végre [23]. Röviden, Agrobacterium hideg steril vízben történő mosással és 10%-os glicerinben való újraszuszpendálásával elektro-kompetenssé tették. A vektor-DNS-t dializáltuk, hogy eltávolítsuk a felesleges sót, és elektroporációval eltávolítjuk Agrobacterium. A kanamicin-rezisztens telepeket YEB tápközegben növesztjük, YEB-tányérokra terítjük, és hagyjuk gyepet kialakítani. A pázsitot lekapartuk és 20% YEB, 4% szacharóz (w/v) és 0,024% Silwet L-77 felületaktív anyag (Helena Chemical Company, Collierville, TN) oldatában felfüggesztettük. A vad típusú Col-0 Arabidopsis virágait a Agrobacterium oldatot, és hagyjuk növekedni és maghüvelyeket fejlődni. A magokat érett növényekről gyűjtöttük, és 1x MS táptalajra szelektáltuk, amely 0,7% agart tartalmazott, kiegészítve 5 mg/l glufozináttal vagy 50 μg/ml kanamicinnel.

E. coli és élesztő fehérje expressziója

A BL21(DE3) E. coli, StrepII-címkézett brazzeint és miraculint inszertáltunk egy BioBrick-módosított pET-duet vektor 1. többszörös klónozási helyére [31]. A sejteket a log fázis közepéig növesztjük, és 1 mM IPTG végkoncentrációval indukáljuk. A fehérje expressziót Western blot módszerrel mértük.

PSY580a élesztőben S. cerevisiaeA StrepII-vel jelölt brazzeint a konstitutív TEF-promoterrel vagy a rézzel indukálható CUP1-promóterrel klónoztuk, és a LEU2-lókuszba integráltuk. A transzformánsokat 0,3 mM CuSO-t tartalmazó YEPD tápközegben növesztettük4 fehérje expresszió indukálására, amit Western blot-tal mértünk.

Genomi transzgének ellenőrzése

A genomi DNS-t az Arabidopsisból DNEasy kit (Qiagen) segítségével extraháltuk, és PCR-rel amplifikáltuk (lásd 1. további fájl: S2 táblázat). A teljes sejt RNS-t a növényi RNEasy kit (Qiagen) segítségével gyűjtöttük össze. A cDNS-t a SuperScript III First-Strand szintéziskészlettel (Invitrogen) szintetizáltuk. A qPCR-t primerpárokkal végeztük (lásd 1. további fájl: S2 táblázat), amely 100 bázispár amplikont amplifikált a célgéneken belül, hogy azonosítsa a heterológ gének expresszióját vagy az endogén gén leütését.

SDS-oldal és Western blot

A fehérjemintákat Arabidopsisból vonták ki, E. coli, és élesztővel, és Bradford vizsgálattal (Bio-Rad, Hercules, CA) normalizáltuk. A mintákat SDS-PAGE töltőpufferrel hígítottuk, és 4-20%-os Tris/glicin/SDS akrilamid gélre vittük. α-Strep-tag II antitestet (HRP-konjugált, Novagen, Gibbstown, NJ) használtak a brazzein és a miraculin fehérje expressziójának mérésére E. coli és élesztőt, valamint α-miraculin antitestet [18] (Tadayoshi Hirai, Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Japán) használták a miraculin expressziójának kimutatására Arabidopsisban. Monoklonális anti-β-tubulin antitestet (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) használtunk a tubulin kimutatására Arabidopsis-ben.


Nézd meg a videót: AGRON: 313 Lecture 16 Herbicide Selectivity To Plants (Augusztus 2022).