Információ

Hogyan reprezentálja az RT-PCR a sejt RNS-tartalmát?

Hogyan reprezentálja az RT-PCR a sejt RNS-tartalmát?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Például először összegyűjtjük az összes RNS-tartalmat egy emlős sejtvonalból. Tegyük fel, hogy például 80 ul RNS-t gyűjtünk össze 150 ng/ul koncentrációval. Ezután a cDNS előállításához 1000 ng RNS-t veszünk. Ez az 1000 ng azonban teljesen véletlenszerű mintavétel a rendelkezésünkre álló teljes RNS-ből. Hogyan reprezentálja ez a véletlenszerű RNS-minta a sejtjeinkben eredetileg található RNS-tartalmat?


Nem igazán világos, hogy pontosan mit kérdez a kérdező, de…

… az egyik módja ennek az, hogy megkérdezzük, mekkora a valószínűsége annak, hogy az RNS előkészítéséből vett mintából hiányzik az alacsony abundanciájú RNS. Ezáltal a minta minőségi szinten nem lesz reprezentatív.

A kérdésben az áll, hogy 12 000 ng RNS-t izolálnak. Mivel semmi más nincs megadva, feltételezem, hogy ez a teljes RNS. Az eukarióta sejtenkénti teljes RNS durva becslése 20 pg.

Ez azt jelenti, hogy a készítmény 6 x 10-ből származott5 sejteket. (100%-os hozamot feltételezek, de ez nem igazán befolyásolja a következtetést.)

Most tegyük fel, hogy egy alacsony abundanciájú mRNS sejtenként 10 kópiában van jelen. A teljes RNS-készítmény tehát 6 x 10-et tartalmaz6 annak az alacsony abundanciájú mRNS-nek a másolatai.

Az összes 12 000 ng-ból 1000 ng-os mintát veszünk. Más szavakkal, az RNS-készítmény 1/12-ét vesszük fel. Ha az RNS-készítmény 10-et tartalmaz6 az alacsony abundanciájú mRNS kópiái, mennyire valószínű, hogy véletlenül olyan mintát veszünk, amely nem tartalmazza az alacsony abundanciájú mRNS másolatait? Itt a matematikám megbukik, de ösztönösen azt mondom, hogy ennek a valószínűsége nagyon nagyon kicsi.

Nos, ha 1000 különböző alacsony gyakoriságú mRNS van a sejtben, akkor mindegyik hiányzik a valószínűsége. nagyon nagyon kicsi, de az egyik kihagyásának teljes valószínűsége 1000 x nagyon nagyon kicsi, talan nagyon kicsi.

Továbbra is azon gondolkodom, hogyan számoljam ki az értékét nagyon nagyon kicsi, de ha valaki segíteni akar - előre is köszönöm!


Mi a különbség a PCR, RT-PCR, qPCR és RT-qPCR között?


A polimeráz láncreakció (PCR) egy viszonylag egyszerű és széles körben alkalmazott molekuláris biológiai technika DNS és RNS szekvenciák amplifikálására és kimutatására. A hagyományos DNS-klónozási és -amplifikációs módszerekkel összehasonlítva, amelyek gyakran napokig is eltarthatnak, a PCR csak néhány órát vesz igénybe. A PCR nagyon érzékeny, és minimális templát igényel specifikus szekvenciák kimutatásához és amplifikálásához. Az alapvető PCR-módszerek tovább fejlődtek az egyszerű DNS- és RNS-detektáláshoz képest. Az alábbiakban áttekintést adunk a különböző PCR-módszerekről és a reagensekről, amelyeket az Enzo Life Sciences biztosít az Ön kutatási igényeihez. Célunk, hogy segítsük a tudósokat gyorsan hozzáférni a PCR-reagensekhez, amelyeket a következő kutatási projektjükben használhatnak fel!

A standard PCR-hez csak egy DNS-polimerázra, magnéziumra, nukleotidokra, primerekre, az amplifikálandó DNS-templátra és egy termociklerre van szüksége. A PCR-mechanizmus ugyanolyan egyszerű, mint a célja: 1) a kétszálú DNS-t (dsDNS) hővel denaturálják, 2) a primereket az egyes DNS-szálakhoz igazítják, és 3) a primereket DNS-polimeráz meghosszabbítja, így az eredeti két másolata keletkezik. DNS-szál. A denaturálási, lágyítási és nyúlási folyamatot egy sor hőmérsékleten és időtartamon keresztül egy amplifikációs ciklusnak nevezik. A ciklus minden lépését a használt sablonhoz és primerkészlethez kell optimalizálni. Ezt a ciklust körülbelül 20-40-szer megismételjük, majd az amplifikált terméket elemezhetjük. A PCR-t széles körben használják DNS amplifikálására későbbi kísérleti felhasználásra. A PCR-t genetikai vizsgálatokban vagy patogén DNS kimutatására is alkalmazzák.

Mivel a PCR rendkívül érzékeny módszer, és az egyes reakciókhoz nagyon kis térfogatok szükségesek, több reakcióhoz javasolt a master mix elkészítése. A mesterkeveréket jól össze kell keverni, majd a reakciók számával el kell osztani, biztosítva, hogy minden reakció azonos mennyiségű enzimet, dNTP-ket és primereket tartalmazzon. Számos beszállító, például az Enzo Life Sciences is kínál PCR-keverékeket, amelyek már mindent tartalmaznak, kivéve a primereket és a DNS-templátot.

A guaninban/citozinban gazdag (GC-gazdag) régiók kihívást jelentenek a standard PCR technikákban. A GC-ben gazdag szekvenciák stabilabbak, mint az alacsonyabb GC-tartalmú szekvenciák. Ezenkívül a GC-ben gazdag szekvenciák hajlamosak másodlagos struktúrákat, például hajtűhurkokat képezni. Ennek eredményeként a GC-ben gazdag kettős szálakat nehéz teljesen szétválasztani a denaturációs fázisban. Következésképpen a DNS-polimeráz nem tudja akadály nélkül szintetizálni az új szálat. A magasabb denaturációs hőmérséklet javíthatja ezt, és a magasabb hőkezelési hőmérséklet és a rövidebb lágyítási idő felé történő beállítás megakadályozhatja a GC-ben gazdag primerek nem specifikus kötődését. További reagensek javíthatják a GC-ben gazdag szekvenciák amplifikációját. A DMSO, a glicerin és a betain elősegíti a GC kölcsönhatások által okozott másodlagos struktúrák felbomlását, és ezáltal elősegíti a kettős szálak szétválását.


RT-PCR és cDNS szintézis

Az RNS-templátból származó DNS szintézise reverz transzkripció útján komplementer DNS-t (cDNS) hoz létre. A reverz transzkriptázok (RT-k) egy RNS-templátot és egy, az RNS 3&prime végével komplementer primert használnak az első szál cDNS szintézisének irányítására, amely közvetlenül használható templátként a polimeráz láncreakcióhoz (PCR). A reverz transzkripció és a PCR (RT-PCR) ezen kombinációja lehetővé teszi a kis mennyiségben előforduló RNS-ek kimutatását egy mintában, és a megfelelő cDNS előállítását, ezáltal megkönnyítve az alacsony példányszámú gének klónozását. Alternatív megoldásként az első szálú cDNS kettős szálúvá tehető DNS-polimeráz I és DNS-ligáz alkalmazásával. Ezek a reakciótermékek amplifikáció nélkül használhatók közvetlen klónozásra. Ebben az esetben RNáz H-aktivitásra van szükség, akár az RT-ből, akár kívülről szállítva.

Sok RT beszerezhető a kereskedelmi beszállítóktól. A madár myeloblastosis vírus (AMV) reverz transzkriptáza és a Moloney rágcsáló leukémia vírus (M-MuLV, MMLV) reverz transzkriptáz olyan RT-k, amelyeket általában a molekuláris biológiai munkafolyamatokban használnak. A ProtoScript ® II reverz transzkriptáz egy rekombináns M-MuLV reverz transzkriptáz, csökkentett RNáz H aktivitással és megnövelt termostabilitással. Használható az első szál cDNS szintézisére magasabb hőmérsékleten, mint a vad típusú M-MuLV. Az enzim 50°C-ig aktív, nagyobb specificitást, nagyobb cDNS-hozamot és több teljes hosszúságú cDNS-terméket biztosít, 12 kb hosszúságig.

A módosított RT-k használata javítja a teljes hosszúságú termékképzés hatékonyságát, biztosítva az mRNS-transzkriptum 5&prime végének másolását, és lehetővé teszi egy RNS-szekvencia hű DNS-másolatának szaporítását és jellemzését. A hőstabilabb RT-k használata, ahol a reakciókat magasabb hőmérsékleten hajtják végre, hasznos lehet a másodlagos szerkezetet tartalmazó RNS reverz transzkripciójában.

Ha segítségre van szüksége a rendelkezésre álló RT-k és cDNS-szintézis reagensek összehasonlításához, tekintse meg az RT/cDNS-szintézis kiválasztási táblázatunkat.

Válassza ki a típust:

Ez a termék egy vagy több szabadalom, védjegy és/vagy szerzői jog hatálya alá tartozik, amelyek a New England Biolabs, Inc. (NEB) tulajdonában vagy ellenőrzése alatt állnak.

Míg a NEB különféle alkalmazásokhoz fejleszti és érvényesíti termékeit, a termék használata megkövetelheti a vevőtől, hogy bizonyos alkalmazásokhoz további, harmadik féltől származó szellemi tulajdonjogokat szerezzen.

A kereskedelmi jogokkal kapcsolatos további információkért forduljon a NEB globális üzletfejlesztési csapatához a [email protected] címen.

Ez a termék kizárólag kutatási célokra szolgál. Ez a termék nem alkalmas terápiás vagy diagnosztikai célokra embereken vagy állatokon.


A qPCR és az RT-qPCR áttekintése

A kvantitatív PCR-t, akár reverz transzkripciós lépést tartalmaz, akár nem, rutinszerűen alkalmazzák a molekuláris biológiai laboratóriumokban, és viszonylag egyszerű folyamatának köszönhetően forradalmasította a kutatások végzésének módját (2. ábra). A szabványos PCR-rel szembeni előnyei közé tartozik, hogy képes valós időben és agarózgél nélkül megjeleníteni, mely reakciók működtek. Valóban kvantitatív elemzést is lehetővé tesz. A qPCR egyik legáltalánosabb felhasználási módja a kérdéses DNS-szekvencia kópiaszámának meghatározása. Az abszolút mennyiségi meghatározás segítségével a felhasználó minden eddiginél sokkal pontosabb módon tudja meghatározni a célmásolatszámot a meghatározott koncentráció standard görbéje alapján. Az RT-qPCR viszont lehetővé teszi a génexpressziós változások vizsgálatát modellrendszerek inhibitorokkal, stimulánsokkal, kis interferáló RNS-ekkel (siRNS-ekkel) vagy knockout modellekkel stb. történő kezelésekor. Ezt a technikát rutinszerűen alkalmazzák az expresszió változásainak kimutatására is. az RNS-Seq kísérletek előtt (minőség-ellenőrzésként) és után (a változás megerősítése).

Egy szabványos qPCR és RT-qPCR kísérlet munkafolyamata. A minta izolálása után az integritást a cDNS létrehozása és a qPCR vizsgálat megkezdése előtt elemzik, interkaláló festékek vagy hidrolízis próbák segítségével. A fluoreszcenciát a PCR-ciklusok során detektálják, és amplifikációs görbét állítanak elő, amelyet a célminta mennyiségi meghatározására használnak az adatelemzés során.

Minta előkészítés

A qPCR és RT-qPCR folyamat legdöntőbb lépése vitathatatlanul a minta izolálása. Nem számít, milyen jó a vizsgálati terv, ha a kiindulási anyag szennyezett vagy lebomlott, nem kap pontos eredményeket. A jó minőségű minta a jó minőségű adatok kiindulópontja. Amikor a DNS-t qPCR-hez izoláljuk, elengedhetetlen, hogy az mentes legyen a reakciót gátló szennyeződésektől. Az extrakciót leggyakrabban a kereskedelemben kapható készletekkel végzik, amelyek előnye, hogy felhasználóbarát, egyszerűek és gyorsak, különösen robotrendszerbe integrálva. Az elvégzett RNS-kivonás típusa a szükséges RNS típusától függ. A leggyakrabban használt extrakciós módszer a teljes RNS extrakciós készlet. Ez izolálja a hírvivő RNS-t (az mRNS a fehérjeszintézis előfutára), transzfer RNS-t (a tRNS dekódolja az mRNS-t a riboszómával történő transzláció során) és a riboszómális RNS-t (az rRNS leolvassa az aminosavak sorrendjét a transzláció során, és összekapcsolja őket a riboszómával), de gyakran (nem mindig) ) nem képes elkülöníteni a kisebb RNS-eket, például a nem kódoló RNS-t (DNS-ből átírt, de fehérjékké nem transzkripciós ncRNS funkcionális RNS) és a mikro RNS-eket (a miRNS-ek az mRNS transzláció gátlásával szabályozzák a génexpressziót). Mivel az enhanszer RNS-ek (az eRNS-ek, az enhanszerekből átírt kis RNS-ek) iránti érdeklődés robbanásszerűen megnőtt, amelyek hossza jelentősen változhat, alapvető fontosságú, hogy az extrakciós módszereket alaposan átgondolják, hogy biztosítsák a kérdéses RNS izolálását. Az extrakciós megfontolások mellett elengedhetetlen, hogy az RNS ne legyen szennyezett DNS-sel, mivel ez a qPCR reakcióban nem különböztethető meg a cDNS-től. Ennek kiküszöbölésére a legtöbb protokoll olyan DNáz I kezelésen alapul, amely bármilyen DNS-t emészt.

Az izolálás során a minta lebomlása mindig lehetséges. Ennek megfelelően minden jó csővezeték minőség-ellenőrzési lépést tartalmaz a minta integritásának értékelésére. Ez gyorsan megtehető az A260/280 arány (a 260 és 280 nm abszorbancia összehasonlítása, a fehérjeszennyeződés mértéke) és az A260/230 arány (260 vs 230 nm, szerves szennyeződések jelenlétének jelzése) értékelésével. Ez azonban nem túl pontos, és számos tényező befolyásolhatja. Pontosabb mérés egy virtuális gélelektroforézis rendszer, például az Aligent Bioanalyser használata. Ez a rendszer egy chip segítségével működik, amely méret alapján választja el az RNS-t, és fluoreszcens festékekkel érzékeli az RNS-t. Ezt azután lefordítják egy számítógépre, amely egy algoritmus segítségével egy RNS integritásszámot (RIN) állít elő, amely a minta minőségét reprezentálja, ahol a 10 a legmagasabb.

Az RT-qPCR minta-előkészítésének utolsó lépése a cDNS előállítása. A cDNS RT-PCR-t (1. ábra) használ, hogy cDNS-t állítson elő az RNS-templátból reverz transzkriptáz segítségével. Ez megtehető oligo(dT) primerek alkalmazásával, amelyek az RNS poliA-farokhoz kapcsolódnak, vagy véletlenszerű hexamerek (hat-kilenc bázis hosszúságú primerek, amelyek az RNS-transzkriptum több pontján kapcsolódnak egymáshoz) alkalmazásával. Általában a két primer keverékét tartják a legjobbnak, mivel ez lehetővé teszi a poliA farok RNS (főleg mRNS) és a poliA-t nem tartalmazó RNS (tRNS, rRNS stb.) amplifikációját. A primer megfontolása mellett a cDNS létrehozása része lehet a qPCR-kísérletnek (amelyet egylépéses RT-qPCR-nek neveznek), vagy a qPCR-től elkülönítve (kétlépcsős RT-qPCR) jön létre, amint az a 3. ábrán látható. Az egylépcsős RT-qPCR kevesebb kísérleti eltérést és szennyeződési kockázatot jelent, valamint nagy áteresztőképességű szűrést tesz lehetővé, ezért ezt a lehetőséget általában klinikai szűrésre használják. Ez azonban azt jelenti, hogy a minta csak korlátozott számú alkalommal használható fel, míg a kétlépcsős RT-qPCR több reakciót tesz lehetővé mintánként, és rugalmas beindítási lehetőségeket tesz lehetővé, és általában ez az előnyben részesített lehetőség széles körű génexpressziós elemzéshez, de több optimalizálást igényel.


Az emberi és egér eozinofilek vírusellenes hatással bírnak a parainfluenza vírus ellen

A légúti vírusok asztma súlyosbodását okozzák. Mivel az asztmában szenvedő betegek 60-70%-ánál az eozinofilek a legjelentősebb leukociták a légutakban, értékeltük az eozinofilek hatását egy gyakori légúti vírusra, a parainfluenza 1-re a tüdőben. A vad típusú egerek légútjaiba ovalbumin-szenzitizációt követően toborzott eozinofilek szignifikánsan csökkentették a parainfluenza vírus RNS-szintjét a tüdőben 4 nappal a fertőzés után, összehasonlítva a nem szenzitizált állatokkal. Ez az antivirális hatás a légúti eozinofilek bőségével rendelkező IL-5 transzgenikus egerekben is megfigyelhető volt (NJ.1726), de elveszett a transzgenikus eozinofil hiányos egerekben (PHIL) és az IL-5 transzgenikus egerekben, amelyeket eozinofil hiányos egerekkel kereszteztek (NJ). .1726-PHIL). Az eozinofil granulátum fehérje, az eozinofil peroxidáz elvesztése eozinofil peroxidáz-hiányos transzgenikus egerek alkalmazásával nem csökkentette az eozinofilek vírusellenes hatását. Az eozinofil antivirális mechanizmusokat is feltárták in vitro. Az izolált humán eozinofilek jelentősen csökkentették a parainfluenza vírus titerét. Ez a hatás nem járt a vírus RNS lebontásával az eozinofil granulátum RNázok által. A nitrogén-monoxid-szintáz inhibitorral kezelt eozinofilek azonban elvesztették vírusellenes aktivitásukat, ami arra utal, hogy az eozinofilek nitrogén-monoxid-termelés révén gyengítik a vírusfertőzést. Következésképpen az eozinofil nitrogén-monoxid termelést intracelluláris fluoreszcens szondával mértük. Az eozinofilek nitrogén-monoxidot termeltek válaszul a vírusra és a vírusérzékelő veleszületett immunreceptor szintetikus agonistájára, a Toll-like receptor (TLR) 7-re. Az IFNγ növelte az eozinofil TLR7 expresszióját, és fokozta a TLR7 által kiváltott nitrogén-monoxid termelést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az eozinofilek elősegítik a vírus kiürülését a tüdőben, és hozzájárulnak a veleszületett immunválaszokhoz a légúti vírusfertőzések ellen emberekben.

Az emberi és egér eozinofilek antivirálisak a parainfluenza vírus ellen nitrogén-monoxid-termelés révén, és zsákutcaként szolgálnak a vírusfertőzésben, de nem eozinofil granulátum RNázok vagy eozinofil peroxidáz termelése révén. Az eozinofileknek alulértékelt vírusellenes szerepük lehet az emberek légúti fertőzéseiben.

Az eozinofileket az asztmás betegek körülbelül kétharmadánál találták beszivárogni (1), és kísérletileg összefüggésbe hozták a légúti hiperreaktivitással (2) és a légutak átalakulásával (3). Ez érthető módon ahhoz a feltételezéshez vezetett, hogy az eozinofilek kizárólag rosszul alkalmazkodnak asztmában, és ezért sok asztmakezelést az eozinofil gyulladás csökkentésére terveztek (4–7). Ez a stratégia változó eredményeket hozott. Sok asztmás beteg a maximális terápia ellenére is rosszul kontrollálható (8). Az asztmás tünetek súlyosbodása továbbra is jelentős morbiditást, egészségügyi kiadásokat és halálozást okoz (9, 10). Ezenkívül az asztma súlyosbodásának leggyakoribb oka, a légúti vírusfertőzések megelőzése és kezelése gyakorlatilag nem létezik (11). Ezek a hiányosságok rávilágítanak az eozinofil biológiával kapcsolatos korlátozott ismereteinkre, és olyan tanulmányokat indítottak, amelyek megpróbálják meghatározni az eozinofilek szerepét a légúti vírusfertőzések során az asztmában. Például az emelkedett szisztémás eozinofilekkel rendelkező IL-5 transzgenikus egerekben a légúti syncytial vírus (RSV) titere alacsonyabb volt, mint a vad típusú egerekben (12), míg az IL-5 transzgenikus egerekben, amelyek légúti eozinofíliában szenvedtek, alacsonyabb volt a tüdőgyulladás vírus titere egerekben összehasonlítva. kezelőszervekkel (13). Hasonlóképpen azt találtuk, hogy az ovalbumin szenzibilizáció után a légutakba toborzott eozinofilek kevesebb parainfluenza 1 vírussal társultak a tengerimalacok tüdejében, bár ezeket a kísérleteket nem az eozinofilek okozati szerepének megállapítására tervezték (14). Ezek a vizsgálatok összességében azt sugallják, hogy az eozinofilek hozzájárulnak a tüdő vírusellenes immunitásához.

Az eozinofilek számos mechanizmuson keresztül észlelik a behatoló vírusokat, beleértve a Toll-like receptor (TLR)–ligandum kölcsönhatásokat (15). A TLR7 egyszálú RNS-t köt, amely számos légúti vírus gyakori genomi motívuma (16). A TLR7 ligálása mieloid differenciálódási elsődleges válasz 88 (MyD88) adapter fehérjefüggő jelátvitelt vált ki, amely elősegíti az eozinofil antivirális választ (12). Az eozinofilek antivirális aktivitásáért felelős közvetítők azonban vita tárgyát képezik. Az eozinofilek az aktiválás után különféle granulátumfehérjéket szabadítanak fel, amelyek vírusellenesek lehetnek. Az eozinofil kationos fehérje és az eozinofil eredetű neurotoxin az RNáz A szupercsalád tagjai, és a feltételezések szerint virucid hatást fejtenek ki a vírus RNS genomjainak lebontásával (13, 17, 18). Az eozinofil peroxidáz az eozinofil granulátumokból is felszabadul, és hozzájárul az antimikrobiális reaktív oxigénfajták képződéséhez (19). További vizsgálatokra van szükség, hogy az eozinofilek ezekkel a fehérjékkel vagy egyedi mechanizmusokkal célozzák-e meg az összes vírust.

A parainfluenza vírus egyike azon számos vírusnak, amelyekről ismert, hogy asztma súlyosbodását okozzák (20). A parainfluenzát a felnőttek 18%-ánál mutatják ki az akut asztma exacerbációi során (21). Prevalenciája hasonló az influenzához és a koronavírushoz, és jelentősen nagyobb, mint az RSV felnőtteknél. Tekintettel arra, hogy a becslések szerint évente 16 millió asztma exacerbáció miatti akut ellátási vizit fordul elő (22), a parainfluenza által kiváltott exacerbációk jelentős betegségtehert jelentenek, a parainfluenza vírus és az eozinofilek közötti kölcsönhatás azonban nem egyértelműen meghatározott.

Ebben a tanulmányban azt a hipotézist vizsgáltuk, hogy az eozinofilek gátolják a parainfluenza vírus fertőzését a tüdőben. Az itt leírt kísérletek az eozinofilek hatását értékelték a parainfluenza vírus kiürülésére in vivo és felmérte a lehetséges antivirális mediátorok szerepét. Megvizsgáltuk továbbá az IFNγ hatásait az eozinofilek antivirális válaszaira, mint az eozinofil által közvetített antivirális aktivitás fokozásának lehetséges mechanizmusát.

A légúti epitéliumban IL-5-öt expresszáló egereket (NJ.1726) (23), eozinofil-deficiens egereket (PHIL) (24) és eozinofil-peroxidáz-hiányos egereket (25) C57BL/6 háttéren való visszakeresztezéssel tartottunk fenn. Az állatokat az Egyesült Államok állatjóléti törvényének megfelelően kezelték. A protokollokat az Oregon Health & Science University (Portland, OR) és a Mayo Clinic (Scottsdale, AZ) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságai hagyták jóvá.

A parainfluenza vírust (Sendai virus ATCC, Manassas, VA) rhesus majomvese (RMK) sejt monorétegekben szaporították, szacharóz sűrűség centrifugálással tisztították, és RMK sejtekben titrálták (26) (26)lát az online M anyagok és Módszerek). A titereket az 50%-os szövettenyészet fertőző dózisának többszöröseként fejeztük ki (TCID50 az RMK egyrétegű rétegek 50%-ának megfertőzéséhez szükséges vírus mennyisége).

A 6–8 hetes nőstény egereket 0,04 μg és 0,2 μg ovalbuminnal (Sigma, St. Louis, MO) intraperitoneális injekcióval szenzibilizáltuk timsóval az 1. és 14. napon. A 24., 26. és 28. napon az egereket ketaminnal (45 mg/kg) és xilazinnal (8 mg/kg) érzéstelenítettük, és intratracheális 2%-os ovalbuminnal fertőztük. Az egereket parainfluenzával fertőzték meg (2,8 × 104 TCID50 Egység) intranazálisan a 27. napon. A 31. napon a tüdőt mossuk és homogenizáljuk (lát az online M anyagok és Módszerek).

A tüdő homogenizátumokban lévő parainfluenza mátrix fehérje RNS-ét valós idejű RT-PCR-rel amplifikáltuk és 18S-re normalizáltuk. A relatív RNS-expressziót abszolút RNS-replikátummá alakítottuk át egy parainfluenza RNS standard görbe segítségével (lát az online M anyagok és Módszerek).

Egészséges önkéntesek véréből 99%-nál nagyobb tisztaságú és 99%-nál nagyobb életképességű eozinofileket izoláltak sűrűségcentrifugálással Ficoll-Paque Plus (Sigma) alkalmazásával és negatív szelekcióval (lát az online M anyagok és Módszerek). A jegyzőkönyvet az intézményi felülvizsgálati bizottság jóváhagyta. Az alanyok írásos beleegyező nyilatkozatot adtak.

A humán eozinofileket egy éjszakán át inkubáltuk IFNy-val (300 U/ml) vagy anélkül. A táptalajt eltávolítottuk és a parainfluenzát (1 × 105 TCID50) adtuk hozzá 2 órán át. Egyes tenyészeteket nitrogén-monoxid-szintáz inhibitorral, Nω-Nitro-L-arginin-metil-észter-hidrokloriddal ([l) kezeltek -NÉV] 100 μM Sigma) 30 perccel az oltás előtt. A vírus fertőzőképességét RMK sejtekben hemadszorpciós vizsgálattal határoztuk meg. A fertőző titereket TCID-ben fejezzük ki50 U/ml tenyészet felülúszó.

A humán eozinofileket nitrogén-oxidot detektáló fluoreszcens szondával (Strem, Newburyport, MA) töltöttük, és parainfluenzának vagy szintetikus TLR7 agonistának tették ki, lát az online M anyagok és Módszerek . A fluoreszcenciát 60 perccel később lemezleolvasóval mértük.

Humán eozinofileket oltottak be parainfluenzával (1 × 10 5 TCID50) 2 órán át, mossuk a meg nem kötött vírus eltávolítására, és friss tápközegben tartjuk 72 órán át. A tenyészet felülúszójában lévő vírus RNS mennyiségét 24 óránként valós idejű RT-PCR segítségével határoztuk meg.lát az online M anyagok és Módszerek).

Az eozinofil TLR7 expresszióját valós idejű RT-PCR-rel és immunfluoreszcenciával értékelték.lát az online M anyagok és Módszerek).

Az adatokat egyutas ANOVA-val hasonlították össze Bonferroni-féle módszerrel post hoc teszt. Az adatokat átlagban (±SEM) adjuk meg. A P 0,05-nél kisebb értéket tekintettük szignifikánsnak.

A szenzitizált és ovalbuminnal provokált C57BL/6 egerek tüdejében szignifikánsan (-90%-kal) csökkent a parainfluenza vírus RNS-e a fertőzés után 4 nappal a nem érzékeny állatokhoz képest (1A. ábra). Az ovalbumin szenzitizáció és provokáció jelentős növekedést okozott az eozinofilek számában a bronchoalveoláris mosófolyadékban, valamint a makrofágokban és a neutrofilekben (1B. ábra).

1.ábra. Az ovalbumin szenzibilizáció és a kihívás fokozza a parainfluenza vírus fertőzés kiürülését a tüdőben in vivo. (A) A C57BL/6 egereket szenzibilizáltuk (intraperitoneálisan, 1. és 14. nap), és ovalbuminnal provokáltuk (intratracheális, 24., 26. és 28. nap), majd parainfluenza vírussal fertőztük (intranazálisan, 27. nap). A parainfluenza vírus RNS-ét valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 4 nappal a fertőzés után. A szenzitizált és fertőzött egerek tüdejében szignifikánsan csökkent a parainfluenza RNS szintje a nem érzékeny, parainfluenzával fertőzött kontroll egerekhez képest. (B) Az ovalbumin szenzitizáció és provokáció növelte az összes gyulladásos sejtet, makrofágokat (MΦ), eozinofileket (Eos) és neutrofileket (Neut) a bronchoalveoláris mosófolyadékban a nem szenzitizált kontrollokhoz képest. Nem volt különbség a limfocitákban (Lymph) a csoportok között (n = 5). *P < 0,05, összehasonlítva a nem érzékeny, parainfluenzával fertőzött kontroll egerekkel. Az adatokat átlagként (±SEM) adjuk meg.

Az NJ.1726 egerek (↑Eos↑IL-5) konstitutívan expresszálják az IL-5-öt a tüdőhámban, és emelkedett eozinofilszámuk van a tüdőben (23). A fertőzés után 4 nappal a parainfluenza RNS szignifikánsan csökkent az NJ.1726 egerek tüdejében a vad típusú alomtárs kontrollokhoz képest (2A. ábra). NJ.1726 IL-5 transzgenikus egereket kereszteztünk PHIL egerekkel (ØEos), amelyek veleszületetten mentesek az eozinofilektől, hogy megkülönböztessék az eozinofilek hatását az IL-5-től. Az IL-5-öt expresszáló eozinofil-deficiens NJ.1726-PHIL egerek (ØEos ↑IL-5) tüdejében a parainfluenza RNS-tartalma hasonló volt a fertőzött vad típusú egerekéhez, ami azt jelzi, hogy nem az IL-5, hanem az eozinofilek közvetítik a vírusellenes hatás. Hasonlóképpen, az eozinofil hiányos PHIL egerek önmagukban parainfluenza RNS-szintje hasonló volt a fertőzött vad típusú egerekhez (2A. ábra). A bronchoalveoláris mosás megerősítette az eozinofilek számának szignifikáns növekedését a légutakban NJ.1726 egerekből a vad típusú alomtárs kontrollokhoz képest, és az eozinofilek hiányát PHIL és NJ.1726-PHIL egerekben (2B. ábra). Nem volt szignifikáns különbség a teljes leukociták vagy más gyulladásos sejtalcsoportok között a bronchoalveoláris mosásban a csoportok között (2C. ábra).

2. ábra. Az eozinofilek elősegítik a parainfluenza vírus kiürülését az egértüdőben in vivo. Vad típusú (WT) kontroll egerek (C57BL/6), magas tüdőeozinofilekkel rendelkező transzgenikus egerek az IL-5 tüdő-specifikus promoter általi túlzott expressziója miatt (NJ.1726 ↑Eos ↑IL-5), transzgenikus egerek magas tüdővel Az IL-5, de eozinofilektől mentes (NJ.1726-PHIL ØEos ↑IL-5), és az eozinofil hiányos egereket (PHIL transzgenikus egerek ØEos) parainfluenza vírussal fertőzték (intranazálisan). (A) A tüdő parainfluenza RNS-tartalmát valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 4 nappal a fertőzés után. Az NJ.1726 egerek (↑Eos↑IL-5) parainfluenza RNS-e szignifikánsan csökkent a kontroll egerekhez (WT) képest. Az NJ.1726-PHIL egerek (ØEos↑IL-5) és PHIL egerek (ØEos) parainfluenza RNS-szintje hasonló volt a WT-hez. (B) A parainfluenzával fertőzött NJ.1726 egerek (↑Eos ↑IL-5) bronchoalveolaris öblítése szignifikánsan több eozinofilt tartalmazott az összes többi csoporthoz képest. PHIL (ØEos) vagy NJ.1726-PHIL (ØEos ↑IL-5) egerekben a bronchoalveoláris öblítésben nem mutattak ki eozinofileket. (C) Más gyulladásos sejttípusokban nem volt különbség a csoportok között (n = 7–10). *P < 0,05. Az adatokat átlagként (±SEM) adjuk meg.

Az eozinofil peroxidáz egy granulátum fehérje, amelyet az eozinofilek bocsátanak ki. A vad típusú és transzgenikus eozinofil-peroxidáz-hiányos egereket ovalbuminnal érzékenyítettük és provokáltuk, valamint parainfluenza vírussal fertőztük meg. A parainfluenza vírus RNS-ét a homogenizált tüdőből valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 4 nappal a fertőzés után. Az ovalbumin szenzitizáció és a provokáció szignifikánsan csökkent parainfluenza RNS-sel társult mind a vad típusú, mind az eozinofil peroxidáz hiányos egerekben a nem szenzitizált kontrollokhoz képest (3A ábra), ami azt jelzi, hogy az eozinofil által közvetített antivirális hatás nem függ az eozinofil peroxidáz felszabadulásától. Szenzitizált és provokált vad típusú és eozinofil peroxidáz-hiányos egerekben szignifikánsan megemelkedett a légúti eozinofilek száma a nem szenzitizált vad típusú és eozinofil peroxidáz-hiányos egerekhez képest (3B. és 3C. ábra).

3. ábra. Az eozinofil peroxidáz nem szükséges az eozinofilek vírusellenes hatásához in vivo. (A) WT egereket és eozinofil peroxidáz knockout egereket (EPX −/− ) szenzibilizáltunk és ovalbuminnal fertőztünk (S/C), és parainfluenza vírussal fertőztük meg. A vírus RNS-t valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 4 nappal a fertőzés után. A szenzitizált és fertőzött WT (WT S/C) és EPX −/− egerek (EPX −/− S/C) szignifikánsan csökkentette a parainfluenza RNS-szintjét a tüdőben, összehasonlítva a nem érzékeny, parainfluenzával fertőzött kontroll egerekkel. (B) Az ovalbumin szenzitizáció és a provokáció növelte az eozinofilek számát a bronchoalveoláris mosófolyadékban WT és EPX -/- egerekben a nem szenzitizált kontrollokhoz képest. (C) Más gyulladásos sejttípusokban nem volt különbség a csoportok között (n = 4–5). *P < 0,05. Az adatokat átlagként (±SEM) adjuk meg.

Az izolált humán eozinofileket 2 órán át oltottuk be parainfluenzával, majd mostuk, hogy eltávolítsuk a meg nem kötődő vírust, és friss tápközegben tenyésztjük 72 órán át, hogy kiértékeljük, hogy a parainfluenza közvetlenül megfertőzi-e az eozinofileket, és ha igen, akkor az eozinofilek támogatják-e a vírus utódainak termelését. A tenyészet felülúszójából származó, valós idejű RT-PCR-rel kvantifikált parainfluenza RNS mennyisége 72 óra alatt fokozatosan növekedett (4. ábra, bal tengely), ami azt jelzi, hogy a vírus képes megfertőzni az eozinofileket és vírusátiratokat termelni. A replikáció ellenére azonban a hemadszorpciós vizsgálattal meghatározott parainfluenza vírus titerek ezekben az időpontokban kimutathatatlanok maradtak (4. ábra, jobb tengely), ami azt jelzi, hogy az eozinofilek nem támogatják a fertőző vírus termelését.

4. ábra. A parainfluenzával fertőzött eozinofilek olyan vírus utódokat termelnek, amelyek nem fertőzőek. Humán eozinofileket izoláltunk a perifériás vérből, és 2 órán át parainfluenza vírussal fertőztük, mostuk a meg nem kötött vírus eltávolítására, és 72 órán át tenyészetben tartottuk. Az eozinofil felülúszóból származó parainfluenza RNS mennyiségét valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 24 óránként (tömör négyzet, bal tengely). Ezzel párhuzamosan a fertőző parainfluenza vírus titereit hemadszorpciós vizsgálattal határoztuk meg rhesus majom vesesejtek felhasználásával, és 50%-os szövettenyészet fertőző dózisként (TCID) fejeztük ki.50) U/ml (nyitott kör, jobb tengely) (n = 4). Az adatokat átlagként (±SEM) adjuk meg.

A három parainfluenza vírus szerkezeti fehérjét (azaz mátrix fehérjét, fúziós fehérjét és nukleoproteint) kódoló RNS szintjét a beoltás után 2 órával összehasonlították a vírussal fertőzött eozinofil tenyészetek és a vírussal oltott táptalajt tartalmazó tenyészetek között, hogy meghatározzák, az eozinofil által közvetített vírusellenes hatás az eozinofil granulátum RNázok felszabadulásának eredménye. Ezzel egyidejűleg a parainfluenza vírus titereit ezen az időponton mértük az RMK sejtekben hemadszorpciós vizsgálattal. Az eozinofilek szignifikánsan csökkentették a parainfluenza vírus titerét a vírussal beoltott, eozinofileket nem tartalmazó tenyészetekhez képest, ami azt mutatja, hogy az eozinofilek csökkentik a parainfluenza vírus fertőzőképességét (5A. ábra). A vírustiterek további csökkenése volt megfigyelhető, amikor az eozinofileket IFNγ-val előkezelték. Mindazonáltal az RNS mennyisége mindhárom parainfluenzavírus szerkezeti fehérjére hasonló volt a vírussal fertőzött eozinofileket tartalmazó tenyészetekben és a vírussal beoltott, eozinofilektől mentes tenyészetekben (5B. ábra), ami azt mutatja, hogy a csökkent fertőzőképesség nem a vírus RNS genomjának lebomlásának volt köszönhető. az eozinofil granulátum RNázok által.

5. ábra. Az eozinofilek parainfluenza elleni antivirális aktivitása nem érinti a szemcsés RNázokat. A humán eozinofileket perifériás vérből izolálták, és parainfluenza vírussal fertőzték meg. (A) A vírus fertőzőképességét a beoltás után 2 órával hemadszorpciós vizsgálattal értékeltük, és vírus TCID-ként fejeztük ki50 U/ml. A tenyésztett eozinofilek (Eos) és az IFNγ-val előkezelt eozinofilek (Eos + IFNγ) felülúszójában a parainfluenza fertőzőképesség szinte nem volt kimutatható, összehasonlítva az eozinofileket nem tartalmazó tápközegben (Media + IFNγ) tenyésztett parainfluenza vírussal. (B) A parainfluenza vírus szerkezeti fehérjéit, mátrixát, fúzióját és nukleoproteint (NP) kódoló RNS mennyiségét eozinofil felülúszókban valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg 2 órával az oltás után. A három gén egyike között sem észleltek különbséget, ami arra utal, hogy a parainfluenza fertőzőképességének csökkenése nem a vírus RNS-nek az eozinofil granulátum RNázok általi lebomlásának volt köszönhető.n = 4–7). *P < 0,05. Az adatokat átlagként (±SEM) adjuk meg.

A parainfluenza vírust izolált humán eozinofilek jelenlétében 2 órán át inkubáltuk, majd a vírus fertőzőképességét RMK sejtekben történő titerezéssel (hemadszorpciós vizsgálattal) számszerűsítettük. Amint a 6A. ábrán látható, az eozinofilek szignifikánsan csökkentették a parainfluenza vírus titerét az eozinofileket nem tartalmazó tápközegben inkubált parainfluenzához képest. Az eozinofileket nitrogén-monoxid szintáz inhibitorral, l -NÉV, annak megállapítására, hogy az eozinofil által közvetített vírusellenes hatás a nitrogén-monoxid-termelés következménye-e. l-vel kezelt eozinofilek -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

6. ábra. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (A) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (n = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. l -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (n = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. l -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

7. ábra. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (A) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (n = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (n = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways in vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia in vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase in vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect in vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Következtetések

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Kulcsszavak: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Ábrák

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…