Információ

Klonális és szubklonális mutációk a rákban

Klonális és szubklonális mutációk a rákban


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Valószínűleg ez hülye kérdésnek hangzik, de nem tudom, kit kérdezzek. Ok, itt van.

McGranahan és munkatársai azt találták, hogy a magas klonális antigénterhelésű daganatok nagyobb valószínűséggel reagálnak az immunellenőrzési pont blokkolására.

Bozic és munkatársai link (egyidejűleg) valószínűségi modellt javasoltak a klonális és szubklonális mutációk számának meghatározására. Azt találták, hogy a gyorsan növekvő ráktípusok (ahol a növekedés a sejtosztódás a sejthalál helyett) nagyobb valószínűséggel generálnak több szubklonális mutációt.

Tudva, hogy a melanoma és az NSCLC gyorsan növekvő ráktípusok, ezek az eredmények ellentmondanak egymásnak. Tudjuk, hogy gyorsak, és tudjuk, hogy a melanoma és az NSCLC is olyan ráktípus, ahol az immunterápia a leghatékonyabb.

Valószínűleg mennyire valószínű, hogy bizonyos rákos elváltozások sok közös mutációt tartalmaznak? Teljesen genetikailag homogén lézió, ágak nélkül, nagyon sok mutációval.

Vagy (sokkal valószínűbb) hiányzik valami.


Nem igazán mondanak ellent egymásnak; a neoantigének klonalitása plusz réteget ad a teljes mutációs terheléshez; de a teljes mutációs terhelés (és következésképpen a teljes neoantigénterhelés, mivel a fix szekvencia-kontextusban bekövetkező mutációk bizonyos sebességgel neoantigéneket generálnak) önmagukban is előrejelzők.

A nagy neoantigénterhelésű daganatok általában általában jobban reagálnak (lásd Snyder és mtsai, NEJM, Rizvi és munkatársai, Science és Van Allen és munkatársai, Science), valamint azt a tényt is, hogy az eltérést javító rákok általában általában reagálnak.

Tehát ha már eleve magas neoantigéntartalmú daganatokat szed (mind a tüdőben, mind a melanómában rendkívül nagy a mutációs terhelés), majd a neoantigén klonalitása alapján rétegzi őket, akkor hajlamos arra, hogy tovább rétegezze a betegeket az ellenőrzőpont blokáddal társított válasz alapján.

McGranahan és munkatársai lényege az volt, hogy rámutassanak arra, hogy lehetséges a megcélzott immunválaszok növelése összes a daganat sejtjeit, és hogy az erre való képesség általában a túlélést, és különösen az ellenőrzőpont blokád válaszát diktálhatja, de csak ha az antigénprezentáció és az immuninfiltráció sértetlen. McGranahan és munkatársai megjegyzik, hogy a klonális neoantigének a kimerült CD8-infiltráció és az I. osztályú MHC-expresszió miatt semmit sem tesznek a tüdőlaphámrákban, és van más munka is (Lásd: http://www.pnas.org/content/113/48/E7759.abstract)

Ami ezt a kicsit illeti

Valószínűleg mennyire valószínű, hogy bizonyos rákos elváltozások sok közös mutációt tartalmaznak? Teljesen genetikailag homogén lézió, ágak nélkül, nagyon sok mutációval.

Erre elég bonyolult válaszolni; de általános szabályként érdemes megjegyezni, hogy az osztódások számának és a mutációk (és ergo a leendő szubklónok) számának növekedésével a tumorok klonálisak maradásához rendkívül erős szelektív sweepekre van szükség, így egy adott időpontban nagyon kis szám a klónok dominálnak, és legalábbis a kezeletlen/kezelés előtti daganatoknál megfigyelhető a tendencia, hogy sok közülük hatékonyan semleges evolúciós mintákat mutat ( http://www.nature.com/ng/journal/v48/ n3/abs/ng.3489.html )


Trendek

A következő generációs szekvenálás feltárta a tumor evolúciójának összetettségét. A rákos megbetegedések általában több, egymással párhuzamosan fejlődő, genetikailag rokon szubklónból állnak. Ez elmozdulást jelent az egyre agresszívebb klón folyamatos fejlődésének hagyományos paradigmájától.

A heterogén daganatok evolúciós erői összetettek. A szubklónok között verseny és együttműködés is lehet. A legújabb bizonyítékok arra is utalnak, hogy a semleges evolúció gyakori lehet számos daganatban.

A szubklonális architektúra térben és időben változik. A térbeli heterogenitás kihívást jelent a mintavételi torzítás miatt, különösen akkor, ha az egyes szubklónok dominálnak a tumorrégiókban. A keringő tumor-DNS lehetővé teszi a betegségteher és a gyógyszerrezisztencia időbeli nyomon követését, potenciálisan megoldva a mintavételi torzítás problémáit és az ismételt tumormintavétel szükségességét.

A daganatok genetikailag heterogén szubklónokból állnak, amelyek a tumornövekedés korai szakaszában eltérhetnek egymástól. A betegek kezelésére és kimenetelének értékelésére vonatkozó stratégiáink azonban túlnyomórészt a rák evolúciójának klasszikus lineáris paradigmáján alapulnak. Egyre több tanulmány állapítja meg, hogy a kisebb szubklónok meghatározhatják a betegség klinikai lefolyását, és hogy a betegség kezelésénél figyelembe kell venni az időbeli és térbeli heterogenitást. Ebben a cikkben áttekintjük a rák klonális heterogenitásának bizonyítékait, értékelve a tumor szubklónok jelentőségét és növekedésüket a darwini és a semleges evolúció révén. A jelenlegi klinikai gyakorlatban és a vizsgálati tervekben jelentős változásokra lehet szükség, amelyek célja a rák evolúciójának betegenkénti megértése, a heterogén áttétes betegségek sikeresebb kezeléséhez.


Bevezetés: a rák evolúciója, mint többlépcsős folyamat az idő múlásával

A rák kialakulásának kockázata az egyén élete során folyamatosan növekszik, középkortól kezdve meredeken emelkedik. Az 1950-es években Armitage és Doll [1] azt javasolta, hogy a rák előfordulásának megfigyelt tendenciái összhangban legyenek a karcinogenezis hat-hét egymást követő sejtrendellenesség sorozatán keresztül történő előrehaladásával. A mutációk kumulatív hatását a rák kialakulása során ezt követően egyértelműen kimutatták a retinoblasztómával kapcsolatos alapmunkában, amelyben két mutációs esemény szükséges a tumorképződés elindításához, ami inspirálta Knudson „két találatos” hipotézisét [2]. Az 1970-es évek végére a rák kialakulásának átfogó képe kezdett kirajzolódni, amelyet a Nowell által javasolt, ma is széles körben elfogadott klonális tumorfejlődési modell formalizált [3]. Lényegében a rák evolúciója darwini folyamatnak tekinthető. A mutációk véletlenszerűen halmozódnak fel a normál sejtek genomjában, és ahol előnyös, a természetes szelekció eredményeként klonális expanziót eredményeznek [4].

Az elmúlt néhány évtizedben olyan kulcsgéneket azonosítottak, amelyek gyakran aberráltak a rák genomjában, akár hagyományos molekuláris genetikai megközelítések révén, akár újabban a következő generációs szekvenálás révén [5,6,7]. Keveset tudunk azonban a szomatikus mutációk időzítéséről, vagy a tumor evolúciója során bekövetkező sorrendről. 1990-ben Fearon és Vogelstein [8] volt az első, aki ezzel a kérdéssel foglalkozott egy mérföldkőnek számító kolorektális daganatok vizsgálatában, feltérképezve a pontmutációk megszerzését és a kópiaszám változásait a normál hámszövetből karcinómává és metasztatikus betegséggé való progresszió során. E munka óta mások megkísérelték rekonstruálni más szövettípusok tumorfejlődésének hasonló útjait, ugyanazt a megközelítést alkalmazva, jellemzően a különböző tumormintákban előforduló genomiális eltérések összehasonlításával, akár a prekurzor léziók és a keletkező daganatok között, akár a betegek csoportjai között a betegség különböző szakaszaiban [9,10,11,12].

Az utóbbi években az ilyen rákprogresszió-elemzések tovább fejlődtek matematikai modellek, például onkogenetikai fák és irányított aciklikus gráfok alkalmazásával [13]. A rák genom szekvenálása azonban most már sokkal közvetlenebb vizsgálatot tesz lehetővé a tumor evolúciójáról egyetlen páciensen belül, időben vagy térben elkülönített mintákból [14,15,16]. Ezenkívül a tumor evolúciós történetének rekonstruálására szolgáló algoritmusok kidolgozása lehetővé tette, hogy az egyes biopsziák teljes genomszekvenálásából következtessenek specifikus mutációk időpontjára, és jellemezzék az események sorozatát [17].

A daganatok kialakulása és előrehaladása során bekövetkező események időbeli sorrendjének megfejtése alapvető fontosságú a daganatképződés átfogó megértéséhez, és a tumor evolúciójának legkorábbi eseményeinek azonosításához. Ez markereket jelenthet a gyorsabb diagnózishoz és kezeléshez, valamint javíthatja a rák előrehaladásának előrejelzési képességét. Itt áttekintjük a tumor evolúciójának vizsgálatára szolgáló különféle megközelítéseket, beleértve a mutációk időzítésének jelenlegi módszereit, és leírjuk, hogy ez hogyan segítette elő a tumorbiológia megértését.


A szubklonális mutációk evolúciója és hatása papilláris pajzsmirigyrákban

Sok rákkal ellentétben a papilláris pajzsmirigyrák (PTC) tumorfejlődésének mintázata és a relapszusban betöltött lehetséges szerepe nem tisztázott. Ebben a vizsgálatban többrégiós teljes exóm szekvenálást (WES) végeztek korai stádiumú PTC daganatokon (n = 257 tumorrégió) 79 egyénből, köztük 17 személynél, akiknél relapszus alakult ki, hogy megértsék a szubklonális időbeli és térbeli keretet. mutációk katalizálják a tumor evolúcióját és annak lehetséges klinikai jelentőségét. A párosított primer-relapszusos daganatszövetek is rendelkezésre álltak az egyének egy részében. Az így létrejött változatkatalógust elemezték az evolúciós történetek feltárása, a klonális és szubklonális események meghatározása, valamint a tumoron belüli heterogenitás és a relapszusmentes túlélés közötti kapcsolat felmérése érdekében. A többrégiós WES megközelítés kulcsfontosságú volt a szubklonális mutációk helyes osztályozásában, amelyek 40%-át egyébként tévesen klonálisnak tekintették volna. Lineáris és elágazó evolúciós mintákat is megfigyeltünk PTC kohorszunkban. A szubklonális mutációk nagyobb terhelése szignifikánsan összefüggött a visszaesés kockázatával. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a PTC relapszusa, bár általában ritka, nem követ előre megjósolható evolúciós utat, és hogy a szubklonális mutációs teher prognosztikai tényezőként szolgálhat. A megfigyelések megerősítéséhez nagyobb vizsgálatokra van szükség, amelyek többrégiós szekvenálást alkalmaznak relapszusos PTC-esetekben egyező elsődleges szövetekkel rendelkező alanyokon.

Kulcsszavak: evolúció exome szekvenálás többszövet papilláris pajzsmirigyrák filogenezis recidíva szubklonális mutációk.

Copyright © 2019 American Society of Human Genetics. Kiadó: Elsevier Inc. Minden jog fenntartva.


A rák genomika és a klonális architektúrák

A rák genomjainak szekvenálása, amelyet a második generációs teljes genom szekvenálás megjelenése könnyített meg, új ablakot nyitott a rákos sejtek genetikájának és evolúciós biológiájának összetettsége előtt 2 . Mivel mind a transzformáció, mind a metasztázisok valószínűleg a legtöbb esetben klonálisak 2 , amelyek egyetlen sejtből származnak, a tumor összes sejtjében jelenlévő mutációk azonosítása rekonstruálhatja az alapító sejt genotípusát. Ezek az alapító események korlátozzák a daganatok genetikai és klonális összetettségét. A kromoszómatörések finom feltérképezése, a jelölt génszekvenálás és a tumorokból származó tömeges minták funkcionális szűrése révén már hosszú listánk volt a visszatérő (a funkció növekedésével vagy elvesztésével járó) vezetőmutációkról. Ami most megjelent a genomiális szűrésekben, az egy portré arról, hogy a rákgenomok általában milyen összetettek. Az egyes rákos megbetegedések több száz vagy százezer mutációt és kromoszóma-elváltozást 2 tartalmazhatnak, amelyek túlnyomó többsége feltételezhetően genetikai instabilitásból eredő semleges mutáció. A kromoszómális instabilitás (amplifikációk, deléciók, transzlokációk és egyéb szerkezeti változások) a legtöbb rákos megbetegedés közös jellemzője, azonban nem világos, hogy a pontmutációk aránya megnövekedett-e a rákban 2,21,23,52. Az evolúciós szempontból semleges elváltozások feltehetően a szelektíven előnyös elváltozások, illetve a sodródás által vezérelt klonális terjeszkedések stoppolásának eredményeként jelentkeznek a képernyőkön. Ezen túlmenően az adatok élénken megerősítik, hogy minden egyes betegnél minden rák egyedi genomiális profillal rendelkezik. Előfordulhat, hogy csak szerény számú fenotípusos tulajdonságra van szükség ahhoz, hogy megbirkózzunk minden kényszerrel, és teljes malignus vagy metasztatikus státuszba fejlődjünk 25, de a következtetés az, hogy ez az evolúciós pályák szinte végtelen sokféleségével és többféle, különböző kombinációjával érhető el. driver mutációk 44 .

Paradox módon a genomprofilok alábecsülik a bonyolultságot. Ezek a mai napig többnyire egyszeri pillanatfelvételek, amelyeket egyetlen mintából, egyetlen diagnosztikai időpontban készítettek. A sorozatos vagy párhuzamos mintavétel hagyományosabb genetikai elemzés révén feltárja a genetikai sokféleséget. A párosított primer tumor és a metasztázis minták teljes genomszekvenálása a mai napig korlátozott, de feltárta, hogy az egyes áttétes léziók klonális eredetűek és genetikailag egyediek, ugyanakkor klonális őseik az elsődleges daganatig visszavezethetők 2 . A rák "genomjának" leírása egy másik szempontból talán félrevezető. A genetikai változatokat általában a leolvasások 5%-ában azonosítják, ami a legtöbb mutáció szubklonális eloszlására utal 53 . De kritikus szempont, hogy a szubklónokon belüli mutációk szegregációja elveszik, amikor a DNS-t kivonják a teljes sejtpopulációból. Ez a tulajdonság fontos, ha a betegspecifikus genomi profilok platformot biztosítanak a terápiás célpontok kiválasztásához. A szubklonális genetikai sokféleség vitathatatlanul a terápiás sikertelenség kulcsfontosságú tényezője. A rákgenomikának ezt a korlátját széles körben felismerték, és technikailag és bioinformatikailag jelentős kihívást jelent. A neoplazmákon belüli genetikai sokféleség megértéséhez, és annak megértéséhez, hogy ez hogyan változik a beavatkozásokra adott válaszként, mélyreható szekvenálást és az egyes sejtek genomjának kikérdezését teszi szükségessé a mutációk szegregációjának mintázatainak megállapítása érdekében.


Shedden K, Li Y, Ouillette P, Malek S N: A krónikus limfocitás leukémia jellemzői szomatikusan szerzett mutációkkal a NOTCH1 exon 34-ben. Leukémia 26(5): 1108-10, 2012. PM22182918/PMC3634572

Parkin B, Ouillette P, Li Y, Keller J, Lam C, Roulston D, Li C, Shedden K, Malek SN: Klonális evolúció és devolúció kemoterápia után felnőttkori akut mielogén leukémiában. Blood 121(2): 369-377, 2013. PM23175688/PMC3653567

Malek SN: A szerzett genomi kópiaszám-rendellenességek és visszatérő génmutációk biológiája és klinikai jelentősége krónikus limfocitás leukémiában. Oncogene 32(23): 2805-17, 2013. PM23001040/PMC3676480

Ouillette P, Saiya-Cork K, Seymour E, Li C, Shedden K, Malek SN: Klonális evolúció, genomiális tényezők és a terápia hatásai krónikus limfocitás leukémiában. Clin. Cancer Res. 19(11): 2893-904, 2013. PM23620403/PMC3674194

Li H, Kaminski MS, Li Y, Yildiz M, Ouillette P, Jones S, Fox H, Jacobi K, Saiya-Cork K, Bixby D, Lebovic D, Roulston D, Shedden K, Sabel M, Marentette L, Cimmino V, Chang AE, Malek SN: Mutációk a linkerben

hiszton gének HIST1H1 B, C, D és E OCT2 (POU2F2) IRF8 és ARID1A, amelyek a follikuláris limfóma patogenezisének hátterében állnak Blood 123(10): 1487-1498, 2014. PM24435047/PMC4729540

Parkin B, Ouillette P, Yildiz M, Saiya-Cork K, Shedden K, Malek SN: Integrált genomi profilalkotás, terápiás válasz és túlélés felnőttkori akut mielogén leukémiában. Clin. Cancer Res. 21(9): 2045-56, 2015. PM25652455/PMC4417381

Yildiz M, Li H, Bernard D, Amin NA, Ouillette P, Jones S, Saiya-Cork K, Parkin B, Jacobi K, Shedden K, Wang S, Chang AE, Kaminski MS, Malek SN: STAT6 mutációk aktiválása follikuláris limfómában. Blood 125(4): 668-79, 2015. PM25428220/PMC4729538

Amin N, Seymour EK, Saiya-Cork K, Parkin B, Shedden K, Malek SN: A szubklonális és klonális génmutációk kvantitatív elemzése a terápia előtt és után krónikus limfocitás leukémiában. Clin. Cancer Res.: 2016. (Sajtó alatt) PM27060156

Ying ZX, Jin M, Peterson LF, Bernard D, Saiya-Cork K, Yildiz M, Wang S, Kaminski M, Chang A, Klionsky DJ, Malek S: Az MTOR regulátor RRAGC visszatérő mutációi follikuláris limfómában. Clin. Cancer Res.: 2016. (Sajtó alatt) PM27267853

Amin N, Balasubramanian S, Saiya-Cork K, Shedden K, Hu N, Malek S: Az ibrutinib által kiváltott apoptózis sejten belüli meghatározói krónikus limfocitás leukémiában. Clin Cancer Res: 2016. PM27535981


Vita

A rák „hajtómutációinak” megcélzása a terápia fontos új megközelítése, amely figyelembe veszi a daganatokban jelenlévő változatos mutációs környezetet, még akkor is, ha ugyanabban a szövetben keletkeznek [34–36]. A CML (krónikus myeloid leukémia) és az ALK-gátlás (anaplasztikus limfóma kináz) TKI (Tirozin-kináz inhibitorok) által felállított paradigma a nem-kissejtes tüdőrákos betegek egy kis csoportjában meglehetősen meggyőző. Ebben a két daganatban egyértelmű a mechanikus megértés, hogy a mutáció hogyan mozgatja a daganatot, ezért indokolt a „vezető” mutáció kifejezés. Hasonlóképpen, a c-Kit expressziója a gastrointestinalis stroma tumorokon (GIST) érzékenysé teszi ezeket a daganatokat az imatinibre, csakúgy, mint a PDGFRA expressziója vagy mutáns c-Kit expressziója miatti eosinophiliával járó ritka mastocytosis esetek [37–39]. A rosszindulatú melanomában a BRAF V600E mutációk a sejteket érzékennyé teszik a vemurafenibre [40]. Más ritka daganatok szekvenálása is olyan mutációk felfedezéséhez vezetett, amelyek értelmesen megcélozhatók [41]. A mutáció azonosítása azonban az esetek többségében önmagában még nem jelenti azt, hogy a mutáció hajtóereje – még akkor sem, ha egy hasonló daganat esetében ez a helyzet, és a minta jelentős hányadában van jelen. A klonitást kellő biztonsággal igazolni kell, ha van remény arra, hogy a célzott terápia hatékony lesz. Egyetlen minta szekvenálása és a mutáció „művelhető” következtetése tele van problémákkal, mivel előfordulhat, hogy a szekvenált tumor mintája nem reprezentálja a teljes daganatot, és emellett a mintavételnek meg kell küzdenie a hamis pozitív és negatív eredmények problémájával is. , magas háttérzaj a nem teljesen rosszindulatú sejtek lehetséges jelenléte miatt, amelyek még mindig tartalmazhatják a fontos gének, például a TP53 [42] normál másolatait, valamint a normál szövettel való szennyeződés. Ezért nem meglepő, hogy a nagy erőfeszítések ellenére az NGS-szekvenálás gyakorlati előnyei az egyes betegek számára ez idáig korlátozottak. Egy közelmúltbeli példa illusztrálja ezt az esetet: Az MD Anderson Cancer Centerben megfigyelt 95 rákos betegből álló sorozatban az NGS-szekvenálás a betegek 92%-ánál legalább egy mutációt azonosított. A leggyakoribbak a TP53-ban (25%) és a KRAS-ban (10%) voltak. Elvileg a szekvenált daganatok 36%-ában volt működőképes mutáció, és 13 beteg kapott e szekvenálási adatok alapján a feltételezett vezetőmutációt célzó terápiát. Négy betegnél volt részleges válasz, hatnál stabil a betegség, míg három betegnél előrehaladott [36]. Ezekkel az eredményekkel nehéz igazolni a jelenlegi klinikai megközelítést. Ha bebizonyítjuk, hogy egy mutáció trunkális és ezért klonális, az a vezetőmutációk jobb azonosításához és az ilyen mutációk megfelelő célzásához vezet, nagyobb valószínűséggel fog jelentős eredményeket adni. Úgy tűnik, hogy a tumorok többrégiós szekvenálásának megfelelő mintavételi stratégiája kulcsfontosságú eleme a valóban klonális mutációk helyes azonosításának folyamatának. Egy ilyen lista, amelyet minden egyedi szekvenált beteg számára kidolgoztak, valószínűleg gazdagodik a „meghajtó” mutációival. Ebben a munkában megvitatjuk, hogyan lehet javítani a klonális mutációk listáját nagy biztonsággal meghatározó stratégiát. A többrégiós tumorprofil-készítés jövőbeni bevezetése a klinikai gyakorlatba megköveteli a tumoron belüli heterogenitás mögöttes mechanizmusok jobb megértését és a tumormintavétel szabványosabb megközelítését. Továbbra sem tudjuk a tumoron belüli biológiai folyamatokat úgy irányítani, hogy befolyásoljuk annak heterogenitását [43], de optimalizálni tudjuk a tumorminták gyűjtésének és elemzésének módját.

Tanulmányunk betekintést nyújt olyan belső és külső tényezőkbe, amelyek befolyásolják a valóban klonális mutációk kimutatásának valószínűségét. Mivel a teljes tumorfilogenezis felépítése nem szükséges a klonalitási következtetéshez, ezért az ősi populációból származó elágazó események sorozatának rekonstrukciójára összpontosítottunk. Kidolgoztunk egy matematikai modellt a valóban klonális mutációk helyes azonosításának valószínűségének kiszámítására a nagyszámú bifurkációt tartalmazó rák többrégiós mintavételéből. Ebben a folyamatban a legnagyobb szubklón a legfontosabb tényező a valóban klonális mutációk azonosításában. Aránya az első szubklón megjelenése óta eltelt idő következménye. Minél korábban következik be az első szubklonális mutáció, annál valószínűbb, hogy rosszul minősítjük a truncalisnak. Ennek az első szubklonális mutációnak a nagy bőségéhez több mintára van szükség annak biztosítására, hogy legalább egy minta NEM tartalmazza ezt a mutációt. Ezen túlmenően, ha az első szubklón a daganatnak csak kis hányadában van jelen, kicsi a valószínűsége annak, hogy rosszul minősítik klonálisnak. Eredményeink azt mutatják, hogy több elágazási eseményt figyelembe véve most azt látjuk, hogy a mutációk helyes osztályozásának valószínűsége sokkal nagyobb, mint azt korábban gondoltuk [20].

Szilárd neoplazmákban, ahol a sejtek térben nőnek, kimutattuk, hogy a nagyobb minták nagyobb valószínűséggel túlbecsülik egyes mutációk klonalitását, ha az elemzés az egyes mintákban jelen lévő összes mutációt tartalmazza. Az alacsony és közepes gyakoriságú mutációkat ki kell zárni az elemzésből. Ezzel nemcsak azt a pontosságot érjük el, mint az egycellás mintavételezéssel, hanem még jelentősen növeljük is. Az alacsonyabb frekvenciájú mutációk kizárása az elemzésből azonban téves negatív besorolást okozhat néhány klonális mutációban, amelyek gyakorisága a mintán belül változó az egészséges szövettel való szennyeződés, a genetikai anyag megkettőződése egyes rákos sejtekben vagy a szekvenálási hiba miatt. Más kimutatott klonális mutációk jelenlétében a fals negatív hiba kevésbé aggodalomra ad okot, mint a hamis pozitív, mivel a fals pozitívak megfosztanák a pácienst a hatékony kezeléstől. A mutáció kizárásának határértékét egyedileg kell megválasztani a rendelkezésre álló klonális mutációjelöltek száma alapján.

Végül egy elméleti indoklást adunk a nem véletlenszerű mintákban történő mintavételhez. Kimutattuk, hogy a biopsziák egymástól egyenlő távolságra történő elhelyezése jelentősen megnövelheti a valóban klonális mutációk helyes osztályozásának valószínűségét a véletlenszerű mintavételhez képest. Tisztában vagyunk vele, hogy a tumornövekedés számítási szimulációi leegyszerűsítettek, és hiányzik az élő rendszerek számos jellemzője, mint például a sejtmigráció bonyolultabb növekedési mintájú daganatokban. Ott egy másik térbeli mintavételi stratégia sikeresebb lehet. Eredményeink indoklást adnak a patológusoknak a többrégiós daganatok szekvenálása céljából mintavétel során és a klinikusok számára pl. gyomor-bél traktus. A javasolt mintában maximálisan terjedő minták kiválasztása maximalizálja a klonális mutációk helyes osztályozásának esélyét. Lehetőséget kínálunk arra is, hogy megbecsüljük a kimutatott klonális mutációk listájának bizonyossági szintjét, amely útmutatásul szolgálhat az onkológusok számára a megfelelő célpont kiválasztásában. Eredményeink néhány szempontot adnak a célzott mutációk jobb klinikai értékeléséhez a kezelésben nem részesült daganatokban.


A célzott rákellenes gyógyszerek korszakában a daganatok mutációinak helyes azonosítása a rákkezelés optimalizálásának elengedhetetlen részévé válik. Ez nem feltétlenül egyértelmű, mert a daganatok tartalmazhatnak „driver” mutációkat, amelyek szabályozzák a daganat növekedését, ezért specifikus gyógyszerekkel blokkolni kell, és „utas” mutációkat is, amelyek, ahogy a nevük is sugallja, nem járulhatnak hozzá a daganat progressziójához. és nem valószínű, hogy hasznos terápiás célpontok. McGranahan et al. azonosította a vezető események evolúciójának mintázatait számos daganattípusban, feltárva a mutációk sajátos mintázatait, amelyek fontosak lesznek a rák jövőbeni terápiás kezelési rendjének megtervezésében.

A gyógyszerfejlesztés és a precíziós orvoslási stratégiák javítása érdekében valószínűleg szükség lesz annak megfejtésére, hogy a daganatsejtek mindegyikében vagy egy részében találhatóak-e működő meghajtómutációk. Kilenc ráktípust elemeztünk, hogy meghatározzuk a vezető események szubklonális gyakoriságát, időzítsük a mutációs folyamatokat a rák evolúciója során, és azonosítsuk a szubklonális terjeszkedés mozgatórugóit. Bár az ismert vezető gének mutációi jellemzően a rák evolúciójának korai szakaszában jelentkeztek, később szubklonális „működőképes” mutációkat is azonosítottunk, mint pl. BRAF (V600E), IDH1 (R132H), PIK3CA (E545K), EGFR (L858R), és KRAS (G12D), ami veszélyeztetheti a célzott terápiás megközelítések hatékonyságát. Több mint 20%-a IDH1 A glioblasztómák mutációi és a PI3K (foszfatidil-inozitol-3-kináz) – AKT-mTOR (rapamicin emlős célpontja) jelátviteli tengelyében lévő gének mutációinak 15%-a szubklonális volt minden daganattípusban. A RAS–MEK (mitogén által aktivált protein kináz kináz) jelátviteli tengely mutációi kisebb valószínűséggel voltak szubklonálisak, mint a PI3K-AKT-mTOR jelátvitelhez kapcsolódó gének mutációi. A késői mutációk elemzése összefüggést tárt fel az APOBEC által közvetített mutagenezis és a szubklonális meghajtó mutációk megszerzése, valamint a szubklonális expanziókban szerepet játszó feltárt feltételezett rákos gének között, köztük CTNNA2 és ATXN1. Eredményeink a vezető események pánrákos összeírását adják a tumoron belüli heterogenitás összefüggésében, és feltárják a daganatok evolúciójának mintázatait a rákos megbetegedések között. A szubklonális meghajtó mutációk gyakori jelenléte arra utal, hogy a célzott terápiás választ rétegezni kell aszerint, hogy mekkora arányban azonosították a vezetőt.


Vita

Bár a diagnosztikus NGS előtérbe került a klinikai környezetben a rák szomatikus mutációinak értékelése terén, a szekvenálási paraméterek elégtelen szabványosítása még mindig korlátozza a klinikai gyakorlatban való alkalmazását (1), főleg az alacsony allélfrekvencián jelenlévő változatok esetében (4). Ezért foglalkoztunk azzal a technikai kérdéssel, hogy helyesen határozzuk meg a szekvenálási mélységet a diagnosztikai NGS-ben annak érdekében, hogy megbízható és reprodukálható detektálást kapjunk az alacsony VAF-változatokról. Konkrétan elméleti számításokat végeztünk annak érdekében, hogy meghatározzuk a lefedettség optimális mélységét a változatok alacsony allélgyakoriságon történő kimutatásának kívánt valószínűségéhez, figyelembe véve a szekvenálási hibaarányt. Ezen túlmenően ezeket az elméleti számításokat hígítási kísérletekkel is megerősítettük. Ezen megfigyelések alapján azt javasoljuk, hogy a lefedettség mélysége legalább 1650 (a megfelelő legalább 30 mutált olvasási küszöbértékkel együtt) a 𢙓% variánsok meghívásához, hogy a változatok észlelésének 99,9%-os valószínűsége legyen a hagyományos NGS szekvenálás használatával csak hiba. Az 1𠄳% VAF tartományba eső változatok csak akkor hívhatók meg, ha a kapott szekvenciaadatok jó minőségűek (átlag Q30 > 90%) és/vagy ha a változatokat replikációval vagy ortogonális módszerrel igazolják (1, 11, 16). Egy egyszerű, felhasználóbarát elméleti számológépet (szoftvert) is biztosítunk, amely a szekvenálási hibaarány figyelembe vételével segíti a laboratóriumokat a helyes szekvenálási mélység és az ennek megfelelő minimális számú változat leolvasásában. Egyszerű számológépünk segíthet minimalizálni a hamis pozitív és hamis negatív eredményeket a diagnosztikai NGS során.

Mindazonáltal a helyes szekvenálási mélységet a vizsgálatra jellemző tényezők is befolyásolják (1). A DNS-feldolgozás és a könyvtár-előkészítés során számos szakaszban előfordulhatnak hibák. A leggyakoribbak az NGS-könyvtár előkészítése során bevezetett amplifikációs hibák (1, 12, 17). Egyéb gyakori hibaforrások a könyvtár összetettségéhez (az elemzett független DNS-molekulák száma), a DNS minőségéhez és a célrégió komplexitásához stb. kapcsolódnak. Minden lehetséges vizsgálati specifikus hibát a teszttervezés, a módszer validálás és a minőség-ellenőrzés révén kell kezelni.

Jelenleg a diagnosztikai NGS-ben előforduló magas hibaarányok mérséklése érdekében fejlődőben lévő – számítási és kísérleti – hibajavítási stratégiákat fejlesztenek ki (11). Eddig a legígéretesebb hibajavítási módszerek közé tartozik az UMI (Unique Molecular Identifiers), amelyek a PCR hibákat korrigálják (18), valamint a jel-zaj korrekciós megközelítések (11). Ezek az előrelépések megpróbálják csökkenteni a LOD-t, ezáltal növelve a szekvenálási pontosságot, amely az NGS-diagnosztika jövőbeni lehetőségeihez szükséges.

A diagnosztikai NGS szabványosításának javítása érdekében a megfelelő lefedettségi mélység becslése ajánlott kiindulási pont egy adott NGS-vizsgálatot körülvevő küszöbértékek értékelésekor. Mindazonáltal még mindig hiányzik a közzétett útmutatás a minimális műszaki követelményekről és annak jelentéséről az NGS-ben, ami különösen fontos a rákdiagnosztikában a klonális és szubklonális mutációk kimutatásában. Ennek oka elsősorban a könyvtár-előkészítési megközelítések széles skálája, és számos változó játszik szerepet az egyes specifikus NGS-vizsgálatokban, amelyeket nehéz standardizálni, valamint a laboratóriumok közötti variabilitás. Ezért nagyon kívánatos a minimális műszaki követelmények meghatározása és ezek jelentése az NGS-ben. Haemato-onkológiai diagnosztikai NGS-ben szerzett tapasztalataink alapján javasoljuk legalább a következő technikai paraméterek jelentését: LOD, az NGS vizsgálat általános hibája (vagy legalább a szekvenálási hibaarány), a bevitt DNS mennyisége, forrása és minősége. , a minimális lefedettségi mélység és az ezen a minimális mélységen szekvenált megcélzott bázisok százalékos aránya, a variáns régiót lefedő célleolvasások teljes száma és a változatot támogató leolvasások száma. Különös hangsúlyt kell fektetni a formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) minták NGS szabványosítására (19, 20).

Összességében tanulmányunk rávilágít a helyes szekvenálási mélység és a leolvasások minimális számának fontosságára az alacsony VAF-értékkel rendelkező változatok megbízható és reprodukálható kimutatásához a diagnosztikai NGS-ben. A helyes szekvenálási mélység kiszámítása adott hibaarányhoz felhasználóbarát elméleti számológépünk (szoftverünk) segítségével segíthet minimalizálni a hamis pozitív és hamis negatív eredményeket a diagnosztikai NGS-ben, többek között szubklonális mutációkkal kapcsolatos helyzetekben. A diagnosztikai NGS szigorú tesztelése és szabványosított minimumkövetelményei különösen kívánatosak a klinikai körülmények között a megfelelő eredmények biztosítása érdekében.


Váratlanul magas szubklonális mutációs sokféleség az emberi vastag- és végbélrákban és annak jelentősége

A humán vastagbélrák (CRC) klonális és szubklonális mutációkat is tartalmaz. A klonális mutációk pozitívan szelektálódnak, jelen vannak a legtöbb sejtben, és rosszindulatú progressziót okoznak. A szubklonális mutációk véletlenszerűen oszlanak el a genomban, és mutáns sejtek hatalmas tárházát biztosítják, amelyek kiterjedhetnek, újratelepíthetik a daganatot, és gyors rezisztencia kialakulását eredményezhetik, valamint jelentős mértékben hozzájárulnak a tumor heterogenitásához. Itt a Duplex Sequencing (DS) módszertant alkalmazzuk a CRC daganat szubklonális mutációinak számszerűsítésére, példátlan mélységgel (10 4 ) és pontossággal (<10 -7 ). Megmértük a mutációs gyakoriságot a replikatív DNS-polimerázokat kódoló génekben és a CRC-ben gyakran mutált génekben, és váratlanul magas, 7,1 × 10-7 effektív mutációs rátát találtunk. A szubklonális mutációk felhalmozódásának görbéje a szekvenálási mélység függvényében, öt különböző daganatból nyert DNS felhasználásával összhangban van a tumor evolúciójának semleges modelljével. Bemutatunk egy új elméleti megközelítést a semleges evolúció modellezésére, függetlenül a végtelen hely feltételezésétől (amely kimondja, hogy egy adott mutáció egy adott időpontban csak egy tumorsejtben keletkezik). Our analysis indicates that the infinite sites assumption is not applicable once the number of tumor cells exceeds the reciprocal of the mutation rate, a circumstance relevant to even the smallest clinically diagnosable tumor. Our methods allow accurate estimation of the total mutation burden in clinical cancers. Our results indicate that no DNA locus is wild type in every malignant cell within a tumor at the time of diagnosis (probability of all cells wild type = 10 −308 ).

Significance Statement Cancers evolve many mutations. Clonal mutations are selected early. Subsequent evolution occurs in a branching fashion, possibly without selection (“neutral evolution”). Rarer mutations occur later on smaller branches of the evolutionary tree. Using a DNA sequencing method, duplex sequencing, with unprecedented accuracy and sensitivity, we quantified very rare unique subclonal mutations in diagnostic specimens from five human colorectal cancers. Rarer subclones probe later evolutionary timepoints than previously possible. We confirm neutral evolution at later times and find many more subclonal mutations than expected. A novel theoretical method allowed us to extrapolate further forward in time to diagnosis. At diagnosis, every base in DNA is mutated in at least one cancer cell. In particular any therapy resistance mutation would be present.


Nézd meg a videót: Zöld - Makrobiotika - Sebestyén Szilvia makrobiotikus táplálkozási szakértő (Lehet 2022).