Információ

Mi az apoptotikus sejtből származó anyag végpontja fagocitózis után?

Mi az apoptotikus sejtből származó anyag végpontja fagocitózis után?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Apoptózis következik be. Az organellumok és a belső anyag apoptotikus testeket alkotnak, amelyek vezikulákba vannak csomagolva. A sejtmembrán szétesik (a sejt már nem létezik), és az apoptotikus testek belépnek az extracelluláris térbe. A fagociták „megeszik” az apoptotikus testeket.

Mi történik akkor?

Az anyagot újra feldolgozzák, és kiáramlik a vérbe, továbbítják más sejtekhez,…?


Az immunológia határai

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a Loop-kutatási profiljukon a legfrissebb adatok, és előfordulhat, hogy nem tükrözik az áttekintés időpontjában fennálló helyzetüket.


  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
    • EndNote
    • Referenciakezelő
    • Egyszerű SZÖVEG fájl
    • BibTex


    OSZD MEG

    Az apoptotikus kardiomiociták fokozott efferocitózisa a mieloid-epiteliális-reproduktív tirozin-kinázon keresztül összekapcsolja az akut gyulladás oldását az infarktus utáni szív helyreállításával

    Indoklás: Az apoptotikus sejtek hatékony kiürülése (efferocytosis) a gyulladás oldásának és a szövetek helyreállításának előfeltétele. A szívinfarktus után a fagociták a szívbe toborozódnak, és elősegítik a haldokló kardiomiociták kiürülését. A szívizomsejtek és a szívizom efferocitózisának molekuláris mechanizmusai nem ismertek. A sérült szív egyedülálló modellt biztosít az efferocitózis és az azt követő gyulladás oldódása, a szövetek átalakulása és a szervfunkciók közötti összefüggések vizsgálatára.

    Célkitűzés: Célunk volt, hogy azonosítsuk a fagociták által elhaló szívizomsejtek bekebelezésének mechanizmusait, és első alkalommal felmérjük a szívizominfarktus során bekövetkező efferocitózis megzavarásának okozati jelentőségét.

    Módszerek és eredmények: Más apoptotikus sejtreceptorokkal ellentétben a makrofág mieloid-epiteliális-reproduktív tirozin kináz szükséges és elegendő volt a szívizomsejtek ex vivo efferocitózisához. Egerekben a Mertk-t specifikusan Ly6c(LO) szívizom-fagocitákban indukálták kísérleti koszorúér-elzáródás után. A Mertk-hiány az apoptotikus kardiomiociták felhalmozódásához vezetett, függetlenül a nem kardiomiociták változásaitól, és csökkentette az in vivo efferocitózis indexét. Fontos, hogy az elnyomott efferocitózis megelőzte a szívinfarktus méretének növekedését, és a gyulladás késleltetett feloldásához és csökkent szisztolés teljesítményhez vezetett. Csökkent szívműködést reprodukáltunk csontvelőhiányos kiméra egerekben A Mertk(+/+)-velő reciprok átültetése Mertk(-/-) egerekbe korrigálta a szisztolés diszfunkciót. Érdekes módon a mieloid-epiteliális-reproduktív tirozin-kináz inaktivált formáját, az úgynevezett solMER-t azonosították az infarktusos szívizomban, ami a myeloid-epithelialis-reproduktív tirozin-kináz inaktiválódásának természetes mechanizmusára utal szívizominfarktus után.

    Következtetések: Ezek az adatok együttesen és közvetlenül összekapcsolják az efferocitózist a szív sebgyógyulásával, és a Mertk-et jelentős kapcsolatként azonosítják az akut gyulladás megszűnése és a szervek működése között.

    Kulcsszavak: efferocytosis gyulladás makrofágok szívinfarktus fagocitózis.

    Összeférhetetlenségi nyilatkozat

    Ábrák

    1. ábra: A makrofágok fagocitózzák a szívizomsejteket (CM) és…

    1. ábra A makrofágok fagocitózzák a szívizomsejteket (CM) és Mertk kifejezetten szükséges a CM efferocitózishoz

    2. ábra. Azonosítása és kinetikája Mertk…

    2. ábra. Azonosítása és kinetikája Mertk MI utáni expresszió kísérleti egerekben

    3. ábra: Kemokin és citokin mRNS és…

    3. ábra: Kemokin és citokin mRNS és gyulladásos sejtek a szívben Mertk +/+ vs…

    4. ábra: A kardiomiocita (CM) apoptózis mennyiségi meghatározása…

    4. ábra. A kardiomiocita (CM) apoptózis mennyiségi meghatározása és a CD68+ fagocitákkal való asszociációja Mertk +/+…

    5. ábra: Az akut miokardiális infarktus mérete…

    5. ábra Az akut myocardialis infarctus mérete megnövekedett Mertk -/- egerek MI után

    6. ábra: A hegképződés mennyiségi meghatározása…

    6. ábra: A hegképződés mennyiségi meghatározása miokardiális infarktust (MI) követően átalakult szívekben Mertk…

    7. ábra: A szívműködés értékelése…

    7. ábra A szívműködés értékelése echokardiográfiával szívinfarktus (MI) után Mertk hiányos…


    Anyagok és metódusok

    Rekombináns MFG-E8 előállítása.

    A rekombináns MFG-E8-L-t és mutáns fehérjéit a korábban leírtak szerint állítottuk elő (18). Röviden, a vad típusú MFG-E8-L, a második EGF-szerű doménben RGD helyett RGE szekvenciát hordozó D89E, vagy a C1C2 doméneket nem tartalmazó E1E2PT expressziós plazmidját kalcium-foszfátos precipitációs módszerrel juttatták be a humán 293T sejtekbe. A tenyésztő tápközeget DMEM/2% FCS-re cseréltük 16 órával a transzfekció után, és a transzfektált sejteket további 48 órán át tenyésztettük. A táptalajba szekretált rekombináns fehérjéket anti-FLAG M2 affinitásgél (Sigma-Aldrich) vagy anti-MFG-E8 antitest (2422-es klón) konjugált protein A-Sepharose 4FF gyöngyök (Amersham Biosciences) segítségével tisztítottuk. A fehérjék tisztaságának vizsgálatára SDS-PAGE-nak és Western-blotnak vetettük alá őket. Az SDS-PAGE-hoz a fehérjéket elektroforézissel választottuk el 10/20%-os poliakrilamid gradiensgélen, és Coomassie briliánskékkel festettük. A Western-blothoz a fehérjéket elektroforézissel elválasztottuk, PVDF membránokra vittük, és anti-FLAG antitesttel detektáltuk. Megerősítettük, hogy a rekombináns fehérjék önmagukban nem stimulálják a gyulladásos citokinek, köztük a TNFα és az IL-1β termelődését makrofágokban.

    In vitro fagocitózis vizsgálat és citokinek termelés mérése.

    A csontvelőből származó makrofágok (BMDM) előállításához a csontvelő sejteket úgy nyerték ki, hogy 8-10 hetes C57BL/6 egerek combcsontjait kiöblítették. A sejteket vörösvértest-lízis pufferrel (17 mM Tris-HCl, pH 7,5, 144 mM ammónium-klorid és 0,5% FCS) kezeltük 1 percig szobahőmérsékleten. Ezután a sejteket αMEM/10% FCS tápközegben szuszpendáltuk, és 106 sejt/ml sűrűséggel szélesztettük rekombináns egér M-CSF jelenlétében (A. Kudo ajándéka, Tokyo Institute of Technology, Kanagawa, Japán). A sejteket a 3. napon összegyűjtöttük, 1:10 arányban hígítottuk a tápközeggel, és további 3 napig tenyésztettük 37 °C-on. A 6. napon a sejteket fagocitózisvizsgálathoz használtuk. 2,5 × 105 BMDM-et oltottunk be egy 48 lyukú sejttenyésztő klaszterbe (Corning Inc.), és egy éjszakán át tenyésztettük 37 °C-on. A sejteket D89E-vel (1, 2 és 4 μg/ml) vagy E1E2PT fehérjével (4 μg/ml) 30 percig előinkubáltuk. Apoptózisos sejtek előállításához 4-8 hetes CAD-hiányos egerek timocitáit (6) 10 μM dexametazonnal inkubáltuk 37 °C-on 4 órán át. 2,5 × 106 apoptotikus timocitát adtunk a BMDM tenyészetekhez, és a fagocitózist 2 órán át hagytuk lejátszódni. A nem bekebelezett sejteket PBS-sel történő mosással távolítottuk el, és a BMDM-eket 1 mM EDTA/PBS-sel választottuk le. Ezt követően a sejteket PE-konjugált anti-egér CD11b-vel, majd TUNEL-festéssel festettük a korábban leírtak szerint (18).

    A rezidens peritoneális makrofágokat DMEM/10% FCS-ben szuszpendáltuk, és 105 sejtet oltottunk be egy 96 lyukú sejttenyészet klaszterbe. A sejteket 3 órán át 37 °C-on inkubáltuk, és a fagocitózis vizsgálathoz használtuk.

    A citokin vizsgálathoz 105 C57BL/6-ból származó, tioglikoláttal kiváltott peritoneális makrofág sejtet oltottunk be egy 96 lyukú sejttenyészet klaszterbe. A makrofágokat D89E vagy E1E2PT fehérjével vagy anélkül előinkubáltuk 30 percig. Ezután 2 × 10 6 UV besugárzással indukált apoptotikus timocita sejtet adtunk a makrofágokhoz fagocitózis céljából. 2 órás inkubáció után a makrofágokat kétszer mostuk, és 20 órán keresztül 1 μg/ml LPS-sel vagy anélkül stimuláltuk. A TGF-β mérésére a táptalajt AIM-V-re (Invitrogen) cseréltük 1 órával az LPS-sel vagy anélkül történő stimuláció után, és a sejteket 20 órán át inkubáltuk. A citokinkoncentrációt a tenyészet felülúszójában ELISA kitekkel mértük IL-10, TNFα (BD Biosciences) és TGF-β (R&D Systems) esetében a gyártó protokollja szerint.

    Rekombináns fehérjék és apoptotikus sejtek injekciója.

    A tisztított rekombináns fehérjéket C57BL/6 egerekből nyert 2,5% normál egérszérumot tartalmazó PBS-sel hígítottuk, és az oldatból 300 μl-t intravénásan injektáltunk 8 hetes C57BL/6 nőstény egerekbe a farokvénán keresztül. Apoptózisos timocita injekció esetén a 4-6 hetes C57BL/6 egerek csecsemőmirigyét eltávolítottuk, és tárgylemezek közé szorítottuk. A timocitákat ezután nejlonhálón szűrtük, és szérummentes RPMI 1640 tápközegben szuszpendáltuk. A sejteket 40 J/m2 UV fénnyel sugároztuk be az apoptózis kiváltására, és 1% normál egérszérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegben tenyésztettük 37 °C-on 20 órán át. Ezután a sejteket kétszer mostuk 1 mg/ml egérszérumalbumint tartalmazó PBS-sel, és 2,5% normál egérszérumot tartalmazó PBS-ben szuszpendáltuk. Rekombináns MFG-E8-at adtunk az apoptotikus timocitákhoz 30 perccel az injekció beadása előtt, és a sejteket intravénásan injektáltuk egerekbe. Az immunizálást hetente végeztük, összesen négy-hat injekcióig.

    Autoantitestek kimutatása

    Az anticardiolipin antitest és anti-PS antitest szérumszintjét ELISA-val detektáltuk. A 96 lyukú ELISA lemezeket (Immulon 1B microtiter plate ThermoLabsystems) 10 μg/ml kardiolipint (CL) metanolban vagy 10 μg/ml l -α-foszfatidil-l-szerint, dioleoilt (Sigma-Aldrich) vontuk be. 10%-os FCS-sel való blokkolást követően 50-szeres PBS-sel hígított egérszérumot adtunk hozzá, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A lemezhez kötött egér antitesteket HRP-hez (ICN Biomedicals) konjugált kecske anti-egér Ig-vel detektáltuk 1:2000 hígításban. A peroxidáz aktivitást a segítségével detektáltuk o-fenilén-diamin a peroxidáz-detektáló készletben (Sumitomo) szubsztrátként. A színreakciót 492 nm-en olvastuk le mikrolemez-leolvasóval (Titertek Instruments).

    Az antinukleáris antitestet (ANA) indirekt immunfluoreszcenciával és ELISA-val mutatták ki. Az immunfluoreszcenciához a szérummintákat 50-szer hígítottuk PBS-sel, és Hep-2 sejtekkel (MBL) bevont üveglemezekre adtuk. A tárgylemezeket 37 °C-on nedves kamrában 30 percig inkubáltuk. A tárgylemezekhez kötött antitesteket Cy3-konjugált F(ab') detektálta.2 kecske anti-egér IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 100-szoros hígítása PBS/10% normál kecskeszérummal. A tárgylemezeket fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg (IX-70 Olympus modell).

    Az ANA-kat egy ANA-detektáló készlet (MBL) segítségével is kimutattuk. A kit reakciópufferével 100-szor hígított egérszérumot egy mikrocsészébe adtuk, amely humán nukleáris antigének keverékével volt bevonva (háromféle RNP epitóp [70k, RNP-A és RNP-C], natív Sm, natív SS- A, rekombináns SS-B, rekombináns Scl-70, cenp-B, rekombináns Jo-1 és y fág DNS antigén) és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A lemezhez kötött antitesteket kecske anti-egér Ig-vel mutattuk ki HRP-vel (ICN Biomedicals) konjugálva 1:1000 hígításban. A peroxidáz aktivitást TMB-vel mint szubsztráttal detektáltuk. A színreakciót 450 nm-en olvastuk le mikrolemez-leolvasóval (Titertek Instruments).

    Az anti-duplaszálú (ds) DNS antitestet anti-dsDNS detektáló készlettel (MBL) mutatták ki. A kit reakciópufferével 100-szor hígított egérszérumot egy humán dsDNS-sel bevont mikrocsészébe adtuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mikrolemezhez kötött antitesteket HRP-hez (ICN Biomedicals) konjugált kecske anti-egér Ig-vel mutatták ki 1:1000 hígításban. A peroxidáz aktivitást az előző bekezdésben leírtak szerint detektáltuk. A színreakciót 450 nm-en olvastuk le mikrolemez-leolvasóval (Titertek Instruments).

    Immunhisztokémia

    A 20–36 hetes egérveséket 4% paraformaldehid/4% szacharóz oldattal rögzítettük 0,1 M foszfátpufferben, pH 7,2, és paraffinba ágyaztuk. 4 μm vastag metszeteket készítettem és szilanizált tárgyüvegekre szerelték fel. Immunhisztokémiához a metszeteket 60 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk 0,1% Triton X-100-at és 10% normál kecskeszérumot tartalmazó PBS-ben, és 60 percig szobahőmérsékleten festettük Cy3-konjugált F(ab')2 kecske anti- egér IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 1:100 hígításban. A metszeteket háromszor mostuk 0,1% Triton X-100-at tartalmazó PBS-sel, és fluoreszcens mikroszkóppal megfigyeltük.


    Absztrakt

    Az Alzheimer-kórt (AD) az extracelluláris amiloid β (Aβ) plakkok, valamint a teljes tau-ból és a foszforilált tau-ból álló intraneuronális zárványok (neurofibrilláris gubancok) felhalmozódása jellemzi. Szintén jelen vannak a disztrófiás neuritok, a szinapszisok elvesztése, az idegsejtek halála és a gliózis. Az AD genetikai vizsgálatok rávilágítottak a gyulladás fontosságára ebben a betegségben azáltal, hogy azonosítottak számos kockázattal összefüggő immunválasz gént, köztük a TREM2-t. A TREM2 erősen érintett az alapvető mikroglia funkcióban, beleértve a fagocitózist, az apoptózist és az Aβ-ra adott gyulladásos választ az egér agyában és az elsődleges sejtekben. Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a mikroglia kulcsszerepet játszik az Aβ-ra adott válaszban és az AD patológia felhalmozódásában. Azonban még mindig hiányoznak a részletek arról, hogy mely apoptotikus vagy gyulladásos faktorok támaszkodnak a TREM2-re az Aβ-ra adott válaszukban, különösen humán sejtvonalakban. Ezen korábbi eredmények alapján feltételezzük, hogy a TREM2 befolyásolja az Aβ toxicitásra adott választ azáltal, hogy fokozza a fagocitózist és gátolja mind az apoptotikus fehérjék BCL-2 családját, mind a gyulladást elősegítő citokineket. Aβ42 A humán mikroglia sejtvonal, a HMC3 sejtek kezelését elvégezték, és a TREM2-t túlzottan expresszálták vagy elnémították, és értékelték a fagocitózist, az apoptózist és a gyulladásos választ. Az eredmények azt mutatják, hogy az Aβ-ra adott robusztus fagocita válaszhoz 24 óra elteltével TREM2-re van szükség a HMC3 sejtekben. Ezenkívül a TREM2 gátolja az Ap-indukált apoptózist az Mcl-1/Bim komplex aktiválásával. A TREM2 részt vesz az IP-10, MIP-1a és IL-8 aktiválásában, míg gátolja az FGF-2-t, a VEGF-et és a GRO-t. Összességében a TREM2 szerepet játszik az Aβ toxicitásra adott mikroglia funkcionális válasz fokozásában a HMC3 sejtekben. Ez az új információ azt sugallja, hogy a TREM2 aktiválását célzó terápiás stratégiák nemcsak fokozhatják a fagocitózist és gátolhatják az apoptózist, hanem gátolhatják a jótékony gyulladásos faktorokat is, hangsúlyozva a TREM2-vel kapcsolatos gyulladásos aktivitás meghatározásának szükségességét nem csak az AD egérmodelljeiben, hanem emberi AD.


    Mosás nélküli vizsgálatok

    A fagocitózis-útvonal stádiumainak nyomon követésének nagyon gyors és rendkívül pontos módja a pHrodo indikátorok használata. A pHrodo Deep Red, Red és Green egy sor részecskéhez konjugált a fagocitózis méréséhez anélkül, hogy kioltást vagy mosást igényelne.

    A pHrodo festékek lényegében nem fluoreszkálnak semleges pH-n, és a pH csökkenésével növekvő jelet mutatnak piros vagy zöld kijelzéssel. A fluoreszcens jel növekedése felhasználható a fagocita útvonal progressziójának nyomon követésére.


    Klinikai vizsgálatok elektromos járművekkel és mitokondriumtranszferrel

    Az MSC-EV-kkel és az ATM-mel kapcsolatos összes klinikai vizsgálat megtalálható a www.clinicaltrails.gov oldalon. Bár a felsorolt ​​vizsgálatok többsége az elektromos járművek diagnosztikai tulajdonságaira összpontosít, öt vizsgálatban tesztelik az MSC-EV-k terápiás alkalmazásait, kettőben pedig az ATM használatát javasolják (2. táblázat).

    Az első kísérlet célja a köldökzsinórból származó MSC-EV-k gyulladáscsökkentő tulajdonságainak tesztelése a hasnyálmirigy β-sejt-szigetek pusztulásának megakadályozása érdekében. Az MSC-EV-ket intravénásan adják be két dózisban, az első dózisban exoszómákban, majd hét nap múlva a második adagban mikrovezikulákban (NCT02138331). Két másik, EV-ket használó klinikai vizsgálatban allogén MSC-EV-ket is végeznek. Egyikük miR-124-gyel dúsított EV-ket fog beadni az akut ischaemiás stroke kezelésére (NCT03384433). A második klinikai vizsgálat során a dystrophiás epidermolysis bullosa (NCT04173650) által érintett betegek elváltozásait próbálják kezelni. A toborzási fázisban lévő utolsó, elektromos járművekkel végzett klinikai vizsgálat a tűzálló makulalyukak gyógyulásának és helyreállításának elősegítésére összpontosít MSC exoszómák közvetlen befecskendezésével a sérülés helyére (NCT03437759). Végül, az eddigi egyetlen lezárt nyomvonal köldökzsinórból származó MSC-EV-ket használt a krónikus vesebetegség progressziójának gátlására III-IV. fokozatú CKD-ben szenvedő betegeknél [64]. A vizsgálat a betegség progressziójának stabilizálódását mutatta, amit a glomeruláris filtrációs ráta, a szérum kreatinin és a vér karbamidjának stabil szintje is megerősített a kezelt betegekben, valamint a gyulladásgátló faktorok (TGF-β1 és IL-10) szintje megnövekedett az megfelelő placebo csoport.

    Pozitív eredménnyel zárult az első klinikai vizsgálat is, amelyben izolált mitokondriumokat alkalmaztak a szívizom IRI kezelésére [65]. A mitokondriumokat nem iszkémiás vázizmokból izolálták, és injektálták szívizom IRI-ben szenvedő gyermek betegek szívizomjába. Az AMT után nem észleltek káros hatásokat, és ötből négy beteg kamrai funkciója javult [65].

    Az AMT-t használó egyéb klinikai vizsgálatok a meddőségi kezelések javítására összpontosítanak (2. táblázat). A mitokondriumok autológ mikroinjekciójával az intracitoplazmatikus spermium injekciót megelőzően a betegek petesejtek minősége javult. Az első, 2017-ben lezárult kísérletben mitokondriumokat izoláltak autológ petefészek őssejtekből, és közvetlenül magukba a petesejtekbe injektálták. A mai napig nem publikáltak eredményt. Az embrió minőségét a kezelés utáni terhességi arány és a kezelt embriók morfológiai értékelése alapján számszerűsítették. A második klinikai vizsgálatban, amely még folyamatban van, a mitokondriumokat izolálják az autológ csontvelő-MSC-kből, és közvetlenül a petesejtbe történő intracitoplazmatikus spermiuminjekció előtt adják be. Értékelni fogják az élveszületési arányt, a terhességi arányt, a kinyert petesejtek számát és a termékenységi arányt.


    Eredmények

    Az éretlen DC-k hatékonyan fagocitizálják az apoptotikus sejteket.

    Korábbi megfigyelések alapján, miszerint az éretlen DC-k az antigén befogásáért felelős sejtek (11), azt jósoltuk, hogy az apoptotikus sejteket az éretlen DC-k fogják a legjobban elnyelni. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére létrehoztunk egy fagocitózis-vizsgálatot, amely lehetővé tette számunkra az apoptotikus sejtek felvételének vizuális kimutatását, valamint az éretlen DC-k, érett DC-k és makrofágok fagocitáló kapacitásának összehasonlítását. Röviden, az éretlen DC-ket úgy állítottuk elő, hogy a perifériás vérből IL-4 és GM-CSF jelenlétében T-sejt-mentesített frakciót tenyésztettek. Érett DC-ket állítottunk elő MCM hozzáadásával, és ezek a sejtek expresszálták a sejtfelszíni DC-korlátozott érési markert, a CD83-at (18, 19, 30). A makrofágokat úgy állítottuk elő, hogy műanyag tapadó sejtpopulációt tenyésztettek teflon főzőpohárban 3-9 napig. Apoptózisos sejtek forrásaként influenzával fertőzött monocitákat használtunk (7). A vírusfertőzés 6-10 órán belül apoptotikus halált indukál ezekben a sejtekben (7, 25, 26). A monocitákat először influenzavírussal fertőzték meg a korábban leírtak szerint (24), majd PKH-26 (Sigma Biosciences) segítségével vörösre festették. 6-8 óra elteltével a különböző APC-ket zöldre festettük a PKH67-GL (Sigma Biosciences) fluoreszcens sejtlinker vegyülettel, és 1:1 arányban együtt tenyésztettük az apoptotikus sejtekkel. 2 óra elteltével 37 °C-on a sejtek kotenyészeteit FACScan® analízissel elemeztük, lehetővé téve a fagocita felvétel mennyiségi meghatározását kettős pozitív sejtként. A makrofágok 80%-a, az éretlen DC-k 50%-a és az érett DC-k <10%-a elnyelte az apoptotikus monocitákat 2 órás együtttenyésztés után (1.A). A kettős pozitív sejtek (a PKH67-tel jelölt APC-k, amelyek bekebelezték a PKH26-tal jelölt apoptotikus sejteket) kenete azt jelzi, hogy mind az apoptotikus testek, mind a teljes apoptotikus sejtek „eledelként” szolgáltak a fagocita sejt számára (1. iii, vi, és ix). Vegye figyelembe, hogy ahogy az APC-k előre szórása nőtt, és a FACS ® beállítása eltolódott, a haldokló monocitákat kizárták a megállapított régióból (1. ábra, ii, v, és viii). Az összes APC-populáció maximális felvételét 2–4 órán belül érte el, és részben az alkalmazott apoptotikus sejt forrásától függött (1.B és az adatok nem láthatók). Ezen kinetikai adatok alapján úgy gondoljuk, hogy a makrofágok és a DC-k bevonják és internalizálják a haldokló sejteket, miközben továbbra is a korai apoptotikus sejthalál jellemzőit mutatják. Ezek az adatok azt is mutatják, hogy az éretlen DC az, amely az érett DC-hez képest előnyben részesíti az apoptotikus anyagot. Az apoptotikus sejtek forrása nem volt kritikus, mivel hasonló eredményeket kaptunk az UVB-besugárzott HeLa sejtekkel (lásd a 7. ábrát, és az adatokat nem mutatjuk be).

    Annak igazolására, hogy ez a FACS® vizsgálat a fagocitózist méri, a vizsgálatot 4 °C-on és fagocitózisgátlók jelenlétében végeztük. Mindkét alacsony hőmérséklet (2. ábra,A) és a citokalazin D, a citoszkeletális funkciót gátló gátolta a felvételt (2. ábra,B). Az éretlen DC-k fagocitózisához kétértékű kationok is szükségesek, mivel az EDTA gátló hatású volt (2.C). A FACS® által rögzített felvétel vizuális megerősítésére citoszpineket készítettünk a festett kotenyészetekből. A felvétel gyakorisága korrelált a FACS®-on mért gyakorisággal (az adatokat nem mutatjuk be). Immunfluoreszcenciát végeztünk anti-HLA-DR-vel jelölt éretlen DC-k kotenyészetén is.DR) és apoptotikus influenzával fertőzött monociták, amelyeket influenzaellenes nukleoproteinnel jelöltekNP) (3. ábra). A felső panelen egy apoptotikus sejt látható közvetlenül azelőtt, hogy egy DC elnyelné (nyílhegy). A fagocitózist követően apoptotikus sejteket találtak a DR + vezikulákban (nyilak), de nem a citoplazmában.

    Csak az éretlen DC-k keresztezik az apoptotikus sejtből származó antigént az I. osztályú MHC-n.

    Ezt követően a makrofágok és DC-k fagocitáló képességét korreláltuk az apoptotikus sejtekből származó antigénanyag keresztezési képességével. A sejteket HLA-A2.1 + donorokból (18, 19) állítottuk elő, HLA-A2.1 - influenzával fertőzött monocitákkal együtt tenyésztettük 12 órán át, majd Na 51 CrO-val töltöttük fel.4 influenza-specifikus CTL-ek célpontjaként való használatra (7, 24). A specifikus lízis azt jelzi, hogy az APC-k az apoptotikus sejtből származó antigénanyagot keresztezték úgy, hogy specifikus peptid-MHC I. osztályú komplexeket képeztek a felületén (4.A). Az I. osztályú MHC-prezentáció endogén útvonalával való közvetlen összehasonlításként ugyanazokat az APC-populációkat fertőzték meg élő influenzavírussal, és célpontként használták őket (4. ábra). B).

    Bár az érett DC-k hatékony célpontok voltak influenzával fertőzve, nem voltak képesek antigéneket keresztezni, feltehetően azért, mert csökkentették az apoptotikus monociták fagocitózásának képességét. Az éretlen DC-k azonban keresztezték az apoptotikus sejtekből származó antigéneket. Továbbá, ha az éretlen DC-ket az apoptotikus sejtekkel együtt tenyésztették MCM, egy érési stimulus jelenlétében, még jobb célpontok voltak. Ez feltehetően a kostimulátor és adhéziós molekulák felszabályozásának (13, 31), vagy a peptid-MHC I komplexek megnövekedett stabilitásának köszönhető. Tekintettel arra, hogy az apoptotikus sejtek éretlen DC-k általi maximális felvétele 2 és 4 óra között következik be (1. ábra). D), úgy gondoljuk, hogy az apoptotikus anyag kereszt-prezentációja inkább a korai apoptotikus sejtek fagocitózisát és feldolgozását tükrözi, mint a másodlagos nekrotikus sejteket (lásd Anyagok és módszerek). Ezzel a kérdéssel kapcsolatban fontos felismerni, hogy az influenzával fertőzött monocitáknak 24 órára van szükségük ahhoz, hogy másodlagos nekrózison menjenek keresztül (Albert, M. L. és N. Bhardwaj, 25., 26. nem publikált adatok).

    Nevezetesen azok a makrofágok, amelyek hatékonyan fagocitizálják az apoptotikus sejteket (1.A) nem mutatott be antigéneket a CTL-ekkel (4. ábra). B). Feltehetően az elnyelt anyag lebomlik, nem keresztprezentált az MHC I-n. Ezt a mélyreható különbséget a DC és a makrofág populációk között alátámasztják korábbi megállapításaink, miszerint a makrofágok nem mutatnak keresztbe apoptotikus sejtekből származó antigéneket egy osztály indukciós fázisában I-korlátozott antigén-specifikus T-sejt-válasz. Valójában, ha egy kompetíciós vizsgálat során DC-kkel tenyészetbe helyezik, megkötik az apoptotikus anyagot, és megszüntetik a CTL-választ (7).

    Az éretlen DC-k megkülönböztethetők a makrofágoktól a CD83 intracelluláris expressziójával és a fagocita receptorok egyedi profiljával.

    Megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy az éretlen DC-k a makrofágoktól eltérő útvonalakon keresztül fagocitizálhatják az apoptotikus sejteket. A sejtek egyértelmű megkülönböztetése érdekében fenotípusosan jellemeztük őket. Az éretlen DC-ket a CD14, a makrofág-korlátozott marker és a CD83, a DC-k érési markere hiánya különbözteti meg (30). Kiterjesztettük a CD83 alkalmazását, és azt találtuk, hogy az éretlen DC-k a CD83 intracelluláris expressziója alapján mind a makrofágoktól, mind az érett DC-ktől megkülönböztethetők. A makrofágok nem expresszálják a CD83-at intra- vagy extracellulárisan, míg az érett DC-k mind intra-, mind extracellulárisan expresszálják a CD83-at (5. ábra).

    Ezeket az APC-populációkat megvizsgáltuk az apoptotikus anyag fagocitálásában szerepet játszó receptorok felszíni expressziójára (1. táblázat). Ide tartoznak: αvβ3 és CD36, amelyek koreceptorként működnek az apoptotikus neutrofilek és limfociták makrofágok általi bekebelezésében (32, 33) és a CD14, amely szerepet játszik az apoptotikus sejtek makrofágok általi felvételében (34). Az éretlen DC populációk tanulmányozása során eltérést találtunk az α expressziójábanv és β3 integrinláncokat, és megvizsgálta annak lehetőségét, hogy αv egy alternatív β-láncot kötött. Olyan antitestek alkalmazása, amelyek felismerik az α kombinált epitópjaitvβ3 és az αvβ5 heterodimerek esetében megfigyeltük az α szelektív expressziójátvβ5 éretlen DC-ken (6. ábra,A). Ahogy az antigénfelvételben részt vevő legtöbb receptorra igaz (11, 12), a CD36, α expressziójavβ5, és a DC-ken lévő mannóz receptor leszabályozott az érés során (6. ábra,B, Asztal 1).

    Annak értékelésére, hogy ez a leszabályozás megfigyelhető-e az mRNS-expresszió szintjén, reverz transzkriptáz PCR-t végeztünk β-specifikus primerek segítségével.3, β5és CD36 (6. ábra C). Éretlen DC-k (sáv 1) a β-nak megfelelő méretű amplifikált DNS-t mutatott3, β5és CD36. Ezzel szemben az érett DC-kben (sáv 2), nem β5 és sokkal kevesebb CD36 szekvencia volt látható, míg β3 A szekvenciák összehasonlíthatók az éretlen sejtekben lévőkkel. Ezek az adatok, bár nem kvantitatívak, összhangban vannak a FACS® által megfigyelt fehérjeexpresszió szintjével, és azt sugallják, hogy a DC-kben a fagocita receptor expresszió transzkripciós szinten szabályozható, mint a CD36 és β mRNS expressziója.5 az érés során leszabályozzák.

    Αvβ5 és a CD36 közvetíti az apoptotikus sejtek fagocitózisát éretlen DC-kben.

    α közvetlen szerepének bemutatásavβ5 az apoptotikus sejtek éretlen DC-k általi felismerésében a fagocitózis FACS ® vizsgálatot végeztük α-ra specifikus antitestek jelenlétében.vβ5 (7. ábra,A). A mAb használatával megfigyelt blokkoláson kívül az αvβ5, blokkolást is detektáltunk, amikor mAb-t használtunk az α-hozv, β5és CD36. Nem figyeltek meg blokkolást, amikor az izotípus-egyeztetett mAb-k specifikusak voltak a β-ra1, β3vagy a transzferrin receptor CD71. Vegye figyelembe, hogy a kiválasztott kontroll antitestek felismerték az éretlen DC-ken jelen lévő felszíni receptorokat (7.A, Asztal 1). Az mAb-ket 10 és 80 μg/ml közötti dózisokban tesztelték (az adatokat nem mutatjuk be). Az apoptotikus sejtek fagocitózisának maximális gátlása volt megfigyelhető a CD36-ra, α-ra specifikus mAb-ekkel.v, és β5 50 μg/ml-nél. Az apoptotikus sejtek fagocitózisának DC-k általi gátlása specifikus volt. Nem tudtuk blokkolni a vörös fluoreszcens latex gyöngyök, egy kontrollrészecske, DC-k általi felvételét ezen mAb-k jelenlétében (7. ábra). B). A hisztogram elemzéssel a DC-k sejtenként 1-6 részecskét fagocitóznak. mAb-t α-ravβ5 vagy αv nem változtatta meg ezen hisztogram diagramok profilját (az adatokat nem mutatjuk be).

    Bár α alkalmazásakor a fagocitózis bizonyos mértékű gátlását figyelték megvβ3 ennek oka részben a transzdominancia és/vagy a szabad α készletére gyakorolt ​​hatásv (35). Például anti-αvβ3 az antitestek elnyomják az α intracelluláris jelátvitelét5β1 integrin (36). Alternatív megoldásként αvβ3 és αvβ5 esetleg együttműködve működnek az éretlen DC-kben. Ezért teszteltük az anti-α kombinációitvβ3 és anti-αvβ5 de nem figyeltek meg a fagocitózis gátlásának fokozódását. Az α alacsony receptorsűrűségevβ3 DC-ken (az átlagos fluoreszcencia intenzitás 7 ± 2, 1. táblázat) szintén valószínűtlenné teszi, hogy ez az integrin heterodimer részt vesz az apoptotikus sejtek éretlen DC-k általi elnyelésében.

    Adataink nem zárják ki más receptorok szerepét az apoptotikus sejtek fagocitózisában, például a feltételezett PS receptor vagy a lektin receptor (5). Valójában valószínűleg más receptorok is érintettek, mivel a megfigyelt blokkolás nem haladta meg a 60%-ot még akkor sem, ha az összes releváns mAb kombinációját tesztelték (az adatokat nem mutatjuk be). A CD14 valószínűleg nem vesz részt az apoptotikus sejtek DC-k általi elnyelésében, mivel a DC-k nem expresszálják ezt a receptort (1. táblázat). Makrofágokban az apoptotikus sejtek fagocitózisát gátolták az α elleni antitestekv, β3, αvβ3, és CD36, de nem β elleni antitestek által1, β5, vagy αvβ5 (az adatok nem láthatók). Ez korrelál a publikált adatokkal (6, 33).


    Eredmények és vita

    A HS-indukált növényi sejthalál morfológiailag különbözik az apoptózistól

    Az apoptózis egyik legkorábbi ismertetőjele az AVD [79, 80], amelyet a PM felfúvódása, a nukleáris szegmentáció és végül a sejt apoptotikus testekké való fragmentációja követ [17]. Mivel az ilyen sejtlebontás végső célja a haldokló sejt fagociták általi eltávolítása, az apoptotikus sejt PM-jének a teljes folyamat során érintetlennek kell maradnia, megakadályozva a haldokló sejttartalom kiszóródását. Meglehetősen nyilvánvaló, hogy a növényi sejthalál során az apoptotikus testek képződése nem szolgálna célt, mivel a növényekből hiányoznak a fagociták, és az elhalt növényi sejtet a merev sejtfalba kell zárni [25, 81]. A növényi sejtek abiotikus vagy biotikus stressz okozta halálát azonban a PM és/vagy a vakuoláris membrán, a tonoplaszt felszakadása kíséri, ami súlyosan károsítja az endomembrán rendszereket és a PM visszafordíthatatlan leválását a sejtfalról, amelyet gyakran protoplasztnak is neveznek. zsugorodás [11, 82]. Ezt a jelenséget többször is összekeverték az AVD-vel, a PM-hólyagosodással és az apoptotikus testek képződésével, és így az AL-PCD növényekben való támogatására használták fel [38, 39].

    Az AVD, a PM-hólyagosodás, a nukleáris szegmentáció és a sejtfragmentáció vizsgálata céljából növényekben elemeztük a dohány BY-2 sejtek morfológiáját olyan HS körülmények között, amelyekről korábban leírták, hogy indukálják az AL-PCD-t [48, 51]. A sejttenyészetet nem sejtáteresztő Sytox Orange (SO) nukleinsavfestékkel festettük, hogy láthatóvá tegyük a károsodott PM integritással rendelkező sejteket, és FM4-64 sztirillfestékkel a sejtmembránok láthatóvá tételéhez, majd HS impulzusnak vetettük alá 55 °C-on (További fájl 1: Videó S1).

    Csak az SO-pozitív sejtek mutattak protoplaszt-zsugorodást, ami erősen jelzi a korrelációt a sejttérfogat-csökkenés és a PM-permeabilizáció között (1a. ábra). Nevezetesen, a kezelt sejtek SO-pozitívak lettek a legkorábbi ellenőrzött időpontban, azaz a HS-től számított 10 percen belül, ami gyors PM permeabilizációt jelez. Az SO-pozitív sejtek egyik kiemelkedő jellemzője a PM belső oldalán vezikulumszerű struktúrák kialakulása volt (1a, b ábra). Az ilyen morfológia összeegyeztethetetlen az AVD-vel és a hólyagosodással, amelyek ép PM-et igényelnek, továbbá apoptotikus PM-hólyagok képződnek kifelé a sejtfelszínen [45].

    A HS-kezelt növényi sejtekben a bruttó morfológiai változások nem egyeznek az apoptózis jellemzőivel. a FM4-64 és SO festékeket használtunk az összes sejt és a permeabilizált PM-es sejtek megjelenítésére. A BY-2 sejteket kontroll körülmények között (nincs HS) vagy 10 perces HS után 55 °C-on leképeztük, és az i. és ii. protokoll szerint festettük (lásd „Sytox Orange és FM4-64 festés”). A szkennelést a HS után 1 órán belül végezték el. A nyilak jelzik a PM-et, vegye figyelembe, hogy a PM (piros szaggatott vonal) szorosan a sejtfalhoz van nyomva (fehér szaggatott vonal) kontroll körülmények között, és feszültség alatt leválik. b Higher magnification of the areas indicated with arrows in a. c BY-2 cells expressing green fluorescent protein (GFP) fused to nuclear localization signal (NLS) were subjected to the same treatments as in a. Images represent maximum intensity projections of z-stack scans acquired 6 h post-HS. d Quantification of nuclear area in samples shown in c. Data from three independent experiments, with ≥ 142 cells counted per treatment. Student’s t test, *p < 0.005. DIC, differential interference contrast microscopy. n, nucleus. IQR, interquartile range. Scale bars, 20 μm (a, c) or 5 μm (b)

    The PM and shrunken protoplast were additionally imaged in the time interval from 15 min to 72 h after the pulse HS (Additional file 2: Figure S1). Nevertheless, we failed to detect PM blebbing or protoplast fragmentation into discrete bodies at any time point. Furthermore, although we did observe moderate nuclear condensation upon HS, it was not followed by segmentation of the nucleus (Fig. 1c, d). In summary, the gross morphological changes of cells undergoing HS-induced cell death do not resemble apoptosis.

    PM integrity is irreversibly compromised during or shortly after pulse HS

    Intact PM is a pivotal hallmark of apoptosis [10]. However, SO staining described above suggested permeabilization of PM in most BY-2 cells already within 10 min of the HS. To investigate dynamics of the PM permeabilization, we analysed cellular content leakage after two types of HS, at 55 °C or 85 °C which were reported to induce AL-PCD or necrosis, respectively [61, 70]. The leakage of cellular content was assessed using a fluorescein diacetate (FDA)-based fluorochromatic assay [83]. In brief, the non-fluorescent FDA molecules can passively diffuse into the living cells where their acetate groups are cleaved off by esterases. The resulting fluorescein molecules have poor membrane permeability and are retained in cells with an intact PM, but are released into extracellular space upon PM permeabilization.

    We imaged BY-2 cells loaded with FDA prior to the pulse HS at 55 °C or 85 °C (Fig. 2a). Both types of HS caused rapid (within 10 min) leakage of the dye into the extracellular space (Fig. 2a). We measured the amount of fluorescein accumulated in the extracellular space immediately after the HS and found that the rate of cellular content leakage in HS-treated cells was comparable to that occurring after severe disruption of plant cells caused by freeze-thaw in liquid nitrogen (Fig. 2b).

    Both 55 °C and 85 °C HS cause instant and irreversible PM permeabilization. a Green fluorescence in the BY-2 cells loaded with FDA. Fluorescein leaks into extracellular space within 10 min after HS at either 55 °C or 85 °C. Arrows indicate shrunken protoplasts in 55 °C HS-treated cells. b Similar fraction of fluorescein leaks out of cells after 10 min of 55 °C, 85 °C or liquid nitrogen (N2) treatment. c BY-2 cells stained with SO and FM4-64 to assess whether disruption of the PM integrity after pulse HS is transient or irreversible. Staining was performed for no HS, before HS or after HS treatments according to protocols i, ii and iii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). The cultures were imaged within 1 h following HS. d Frequency of the SO-positive cells in the cultures shown in c. DIC, differential interference contrast microscopy. IQR, interquartile range. Lépték be a és c, 50 μm. b Representative data from one out of three independent experiments. d Data from three independent experiments, with ≥ 115 cells counted per treatment. b, d One-way ANOVA with Dunnet’s test *p < 0.005

    To determine whether PM permeabilization was transient or permanent, we added SO and FM4-64 stains to the cell cultures either before or 30 min after HS. We speculated that if PM permeabilization upon HS was transient, cultures stained after HS would show a significantly lower frequency of SO staining as compared to cells stained before HS. However, SO staining before and after 55 °C or 85 °C HS showed no differences in the proportion of SO-positive cells (Fig. 2c, d), indicating that both treatments caused irreversible rapid permeabilization of PM typical for necrosis [10, 11, 84].

    The protoplast shrinkage during HS-induced cell death is ATP- and Ca 2+ -independent

    Dismantling of the apoptotic cells is ATP-dependent [42, 85]. Yet, loss of the PM integrity would lead to rapid depletion of intracellular ATP, rendering all energy-dependent processes defunct. To examine whether the HS-induced cell death requires ATP, we first imaged mitochondria after 55 °C and 85 °C HS. Already at the earliest checked time points 4–10 min after HS, under both temperatures, mitochondrial dye MitoTracker localized to aberrant structures similar to those observed after treatment with mitochondrial uncoupler and ATP synthesis inhibitor, protonophore carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) [86], indicating disruption of mitochondrial membrane potential (MMP Fig. 3a). Furthermore, intracellular ATP content dropped dramatically after both HS treatments (Fig. 3b), most probably due to dissipation of the MMP and leakage of cytoplasmic content through the permeabilized PM.

    Protoplast shrinkage at 55 °C HS is an ATP- and Ca 2+ -independent process. a Mitochondria in BY-2 cells stained with MitoTracker Red and imaged 10 min after 55 °C or 85 °C HS, or after treatment with 48 μM CCCP under normal temperature. Severely damaged mitochondria were observed upon all three treatments. b Loss of intracellular ATP content upon HS. Snap freeze-thaw treatment in liquid nitrogen (N2) and CCCP treatment were used as positive controls for completely disrupted and uncoupled mitochondria, respectively. The experiment was repeated twice, each time using four biological replicates per treatment. c MitoTracker Red staining of BY-2 cells exposed to 55 °C in the presence or absence of 15 μM Cyclosporin A (CsA) reveals that inhibition of MPTP opening does not rescue mitochondria from severe damage and loss of MMP caused by HS. d MitoTracker Red localization in the cells pre-treated with 10 mM EGTA prior to the HS reveals that chelation of extracellular Ca 2+ does not rescue mitochondrial phenotype. e, f Dynamics of cell death (% SO-positive cells e) and protoplast shrinkage f) in cells with normal and uncoupled (48 μM CCCP treatment) mitochondria. g, h Pre-treatment with 10 mM EGTA before HS does not affect dynamics of cell death (% SO-positive cells g) and protoplast shrinkage (h). Experiments shown in e–h were repeated three times, with ≥ 184 cells per treatment and time point. Each microscopy experiment was performed at least twice. Staining for no HS and 55 °C treatments were performed according to protocols i and ii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). Scale bars, 20 μm (a) or 50 μm (c, d). IQR, interquartile range. b, eh One-way ANOVA with Dunnet’s test *p < 0.05

    In addition to ATP depletion, PM permeabilization would also cause entry of Ca 2+ into the cells, potentially followed by its accumulation in mitochondria. MMP-driven accumulation of Ca 2+ can trigger mitochondrial permeability transition (MPT) due to the opening of a nonspecific pore (mitochondrial permeability transition pore, MPTP) [87], which will cause arrest of ATP synthesis and production of reactive oxygen species ultimately resulting in necrotic cell death [88]. Although HS-induced plant cell death was previously suggested to be a Ca 2+ -dependent process [51], those experiments lacked controls for mitochondrial phenotype, respiration or ATP production.

    To test whether MPT plays a role in the observed mitochondrial phenotype, experiments were performed in the presence of cyclosporin A (CsA), an inhibitor of MPTP opening, or the Ca 2+ chelator ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA). Neither CsA nor EGTA could alleviate the mitochondrial phenotype in cells subjected to the HS (Fig. 3c, d), indicating that mitochondrial malfunction was caused by the direct loss of the mitochondrial membrane integrity during the HS, independently on PM permeabilization.

    Next, we examined the importance of intracellular ATP for the AVD-like protoplast shrinkage. We found that pre-treatment of the cell cultures with CCCP prior to HS had no effect on the protoplast shrinkage (Additional file 2: Figure S2), demonstrating that the protoplast shrinkage does not require ATP. Time-resolved quantitative analysis of cell death (frequency of SO-positive cells) and protoplast shrinkage upon HS of cells with normal or uncoupled mitochondria revealed that both parameters were independent of the mitochondrial bioenergetic function (Fig. 3e, f). Pre-treatment with CsA or EGTA prior to HS did not alleviate the cell death rate either (Fig. 3g, h Additional file 2: Figure S2).

    The discrepancies between our observations and the previous studies could be caused by technical issues, primarily precision of the temperature measurement during HS. To examine this possibility, we compared frequency and phenotype of cell death after treatment at 40, 45, 50 and 55 °C. Although cell viability was inversely proportional to the temperature, the morphology of dead cells in all cases was identical to that observed at 55 °C (Fig. 4). Pre-treatment of cells with CCCP confirmed that at any of the checked temperatures the rate of cell death did not depend on mitochondrial activity (Fig. 4).

    HS at the temperature range 40–55 °C induces ATP- independent cell death. a SO staining of BY-2 cells heat-shocked for 10 min at 40, 45, 50 or 55 °C and imaged after 6 or 24 h. b Quantification of cell death (% SO-positive cells) in the samples showed that pre-treatment with CCCP provided no protection against cell death and protoplast shrinkage at any of the tested HS temperatures. On the contrary, after prolonged exposure (24 h), CCCP appeared to decrease HS tolerance of plant cells. Staining was performed for no HS and HS treatments according to protocols i and ii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). IQR, interquartile range. Experiments were repeated three times, with ≥ 134 cells per treatment and time point. The data was subjected to one-way ANOVA with Bonferroni correction. *p < 0.05, ns, non-significant. Scale bars, 20 μm

    A recent study [89] proposed that HS at 55 °C caused ferroptosis in A. thaliana root hair cells. Therefore, we examined whether the cell death we observed in BY-2 cells under the same stress conditions could be classified as a ferroptosis. For this, BY-2 cells were treated with a ferroptosis inhibitor, Ferrostatin-1 (Fer-1), prior to HS at 55 °C and cell death rate was measured during 24 h after the stress. Treatment with Fer-1 did not alleviate the cell death (Fig. 5a, b data is shown for the first 12 h after HS). Furthermore, two independent experiments replicating conditions that were reported to induce ferroptosis in Arabidopsis root hair cells [89] did not confirm such type of cell death (Fig. 5c). Taken together, our results reject the notion that HS-induced cell death is a programmed process. On the contrary, they demonstrate that HS triggers rapid destruction of cellular components and passive decay of plant cells resembling accidental necrosis.

    HS-induced cell death response is not ferroptosis. a SO staining of BY-2 cell cultures demonstrates that pre-treatment with 1 μM Fer-1 does not affect HS-induced cell death. Staining for no HS and 55 °C treatments was performed according to protocols i and iii, respectively (see “Sytox Orange and FM4-64 staining”). b Quantification of cell death frequency in the samples illustrated in a. The chart shows representative results of three independent experiments, each including ≥ 280 cells per treatment and time point. c Pre-treatment with Fer-1 does not alleviate the HS-induced death of Arabidopsis thaliana root hair cells. Arrows indicate SO-positive nuclei. Three independent experiments demonstrated the same results. No quantification was performed in these experiments, since all cells were SO-positive. DIC, differential interference contrast. Scale bars, 20 μm

    Necrotic deaths caused by 55 °C or 85 °C display different cell morphologies due to a fixating effect of higher temperature

    The lack of protoplast shrinkage during cell death induced by 85 °C was used to classify it as necrosis [61, 70]. However, both 55 °C and 85 °C HS trigger instant and irreversible permeabilization of the PM, MMP dissipation, and drop in intracellular ATP content, which are hallmarks of necrosis [84]. Plausibly, morphological differences between necrotic cell deaths triggered by 55 °C and 85 °C could be explained by rapid protein denaturation occurring at 85 °C that would crosslink cellular components. Such “fixation” would prevent protoplast shrinkage. Consistent with this suggestion, high-temperature cell fixation protocols have been used as an alternative to chemical fixation [90].

    To test whether 85 °C HS acts as a fixative, we induced protoplast retraction from the cell wall by exposing stressed cell cultures to hypertonic conditions at 500 mM D-mannitol (Fig. 6a). The high osmotic pressure of the medium would induce dehydration and protoplast shrinkage in the non-fixed cells. As expected, the living cells treated with D-mannitol underwent typical plasmolysis manifested by reversible protoplast detachment from the cell wall. Cells exposed to 55 °C displayed irreversible protoplast shrinkage phenotype both with and without D-mannitol treatment. However, although cells treated at 85 °C HS exhibited visible signs of dehydration in the hypertonic solution, protoplasts of virtually all cells remained attached to the cell wall. Quantitative analysis revealed no significant changes in the protoplast area of cells treated at 85 °C HS under normal or high osmotic pressure (Fig. 6b). These data provide compelling evidence that the fixing effect of 85 °C HS prevents protoplast shrinkage. Thus, distinct phenotypes of cell deaths induced by HS at 55 °C and 85 °C do not reflect differences in the cell death execution mechanism.

    85 °C HS prevents protoplast shrinkage in necrotic cells by fixing cellular content. a Cells stained with FDA were exposed to 55 °C or 85 °C and mounted in the normal growth medium or hypertonic medium supplemented with 500 mM D-mannitol. As expected, hypertonic medium induced plasmolysis in the non-stressed cells (No HS) and had no effect on protoplasts shrunken after 55 °C HS. Importantly, high osmotic pressure failed to induce protoplast shrinkage in cells exposed to 85 °C HS, thus confirming that cells were fixed by the high-temperature treatment. b The extent of protoplast shrinkage upon HS followed by increased osmotic pressure was quantified as the percentage of the cell area (outlined by the white dotted line in a) occupied by the protoplast area (outlined by the red dotted line in a). Student’s t teszt, n = 3 replicates (each replicate representing ≥ 34 cells), *p < 0.0001, ns, non-significant. IQR, interquartile range. Scale bars, 20 μm


    Mód

    Recombinant sRAGE protein and Rage −/− mice were used for this study.

    Identification of sRAGE by flow cytometry. Alexa Fluor 660 dye-labeled sRAGE or bovine serum albumin was added to dexamethasone-treated thymocytes. Apoptotic cells were identified using a MitoProbe JC-1 assay kit (Molecular Probes). Flow cytometry was performed on a BD FACSCanto II (BD Biosciences).

    PIP strip assay. PIP strips on which the indicated phospholipids had been spotted, were purchased from Echelon Bioscience, and dot-blot experiments were carried out according to the manufacturer's protocol.

    Surface-plasmon resonance analysis (Biacore). The binding affinity of sRAGE to phosphatidylserine was analysed using a Biacore X100 (Biacore AB) in a single-cycle affinity model. KD was calculated using ka és kd values by a trivalent analyte model.

    FRET analysis. FRET analysis was performed as described previously (Liu et al, 2008).

    Confocal laser scanning microscopy. Alveolar macrophages were grown on coverslips and then preincubated with 5 μM NBD-phosphatidylserine liposome for 2 h, after which mRAGE was detected by indirect immunofluorescence using a rabbit polyclonal RAGE antibody (Abcam) with Alexa Fluor 647-conjugated goat rabbit IgG (Molecular Probes).

    Phagocytosis of apoptotic thymocytes. Phagocytosis was assayed by adding apoptotic thymocytes (2.5 × 10 6 cells/ml) with or without sRAGE (3 μg/ml). Phagocytosis was determined as a phagocytic index under microscopy, as described previously (Morimoto et al, 2006). Each condition was tested in duplicate, and the samples were analysed blindly and independently by two researchers (M.H. and K.M.).

    Rac1 activity assays. Rac1 activity was measured using an ELISA-based Rac1 Activation Assay Biochem Kit (G-LISA, Cytoskeleton).

    LPS-induced lung injury. LPS from Escherichia coli serotype 055:B5 was obtained from Sigma-Aldrich, and the induction of lung injury was performed as described previously (Yamada et al, 2004).


    Nézd meg a videót: Mítoszok és valóság az immunitásról. (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Zolorisar

    This rather good idea is necessary just by the way

  2. Tojora

    Van benne valami. I will know, thanks a lot for the explanation.

  3. Cha'tima

    He is certainly not human

  4. Kinny

    nagyon gyors válasz :)

  5. Mulcahy

    Igen valóban. És belefutottam ebbe. Kommunikálhatunk ezen a témán. Itt vagy PM -nél.



Írj egy üzenetet