Információ

Miért alkotnak párhuzamos klasztereket az E.coli?

Miért alkotnak párhuzamos klasztereket az E.coli?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Discalimer: Nem vagyok biológus. Az E. Coli növekedését modellezem, és a Wikipédia gif-ben megfigyelhető néhány csoport, ahol a baktériumok egymás mellett helyezkednek el, megközelítőleg azonos szögben. Végeztem néhány szimulációt, és hasonló eredményeket kaptam. Van valami oka annak, hogy ez megtörténik?


A sejtosztódás osztódással történik a rúd közepén, így az eredmény két leánysejt, amelyek közel azonos szögben helyezkednek el. Idővel a sejteket mozgó mozgató mozgás hiányában ez olyan sejtcsoportokhoz vezet, amelyek nem független sejtorientációval rendelkeznek.

További információért, beleértve azt is, hogy az emberek hogyan késztették másra, lásd ezt a dokumentumot.


A baktériumsejtek inkább párhuzamos orientációban kötődnek egymáshoz, így maximális érintkezési felülettel rendelkeznek, és biofilm klasztereket alkothatnak.

Mind a fizikai tényezők (mint például a Brown-mozgás, elektrosztatikus kölcsönhatások, gravitáció, van der Waals-erők és hidrodinamika), mind a baktériumsejtek sejtműködése (bakteriális mozgékonyság, poliszacharidok termelése és a külső membrán struktúráinak funkciói) felelősek ezért az orientációért.

(Via: https://www.nature.com/articles/srep29516)


A kimeríthetetlen potenciál E. coli

E. coliszívóssága, sokoldalúsága, széles szájpadlása és könnyű kezelhetősége a bolygó legintenzívebben tanulmányozott és legjobban megértett élőlényévé tették. Kutatás azonban a E. coli elsősorban mintaszervezetként vizsgálta, amely elvonatkoztatott minden természetrajztól. De E. coli sokkal több, mint egy mikrobiális laborpatkány. Inkább egy rendkívül változatos organizmusról van szó, amely a vadonban összetett, sokrétű résszel rendelkezik. A ‘wild’ legújabb tanulmányai E. coli például sok mindent feltártak a környezetben való jelenlétéről, sokféleségéről és genomi evolúciójáról, valamint az emberi mikrobiomban és betegségekben betöltött szerepéről. Ezek az eredmények rávilágítottak biológiájának és ökológiájának olyan aspektusaira, amelyek messzemenő kérdéseket vetnek fel, és azt illusztrálják, hogy a E. colitermészetrajza kibővítheti mintaszervezeti értékét.


A cikk áttekintése

Arshpreet Bhatwa 1,2, Weijun Wang 1 , Yousef I. Hassan 1 , Nadine Abraham 1,3, Xiu-Zhen Li 1 és Ting Zhou 1*
  • 1 Guelph Kutatási és Fejlesztési Központ, Mezőgazdasági és Agri-Food Canada, Guelph, ON, Kanada
  • 2 Biológiai Tanszék, Waterloo Egyetem, Waterloo, ON, Kanada
  • 3 Molekuláris és Sejtbiológiai Tanszék, Guelph Egyetem, Guelph, ON, Kanada

A rekombináns fehérjék egyre fontosabbá válnak az ipari alkalmazásokban, ahol Escherichia coli termelésére a legszélesebb körben használt bakteriális gazdaszervezet. A zárványtestek kialakulása azonban gyakran felmerülő kihívást jelent oldható és funkcionális rekombináns fehérjék előállítása során. Ennek az akadálynak a leküzdésére különböző stratégiákat dolgoztak ki a növekedési feltételek módosításával, a gazdatörzsek tervezésével. E. coli, megváltoztatja az expressziós vektorokat és módosítja a kérdéses fehérjéket. Ezeket a megközelítéseket a jelen áttekintés néhány új fejleményével átfogóan kiemeljük. Emellett szó lesz a fehérje zárványtestek egyedi jellemzőiről, képződésük mechanizmusáról és befolyásoló tényezőiről, valamint lehetséges előnyeiről is.


A genomikus szigetek jelentősége

Az összes patogén törzs E. coli genomiális régiókat (szigeteket) tartalmaznak, amelyek virulenciagén-készlettel vannak megtöltve, amelyek kulcsfontosságú tulajdonságokat kódolnak az adherencia/kolonizáció, az invázió, a toxikus vegyületek szekréciója és a szállítási funkciók, valamint a sziderofortermelés (Touchon) szempontjából. et al., 2009). E képességek egy része kommenzálisan is jelen van E. coli megerőlteti, és javíthatja a környezeti alkalmasságot, bár ezt gyakran nem ismerik fel. A patogenitáshoz gyakran szükség van a szigeten terjesztett tulajdonságok teljes készletére, amelyek együtt határozzák meg a viselkedést (Touchon et al., 2009). A legutóbbi genomszekvenálási projektek alapján a sokféleség E. coli A genomokat ma jobban megértjük, mint valaha (Kudva et al., 2002 Touchon et al., 2009). Nyilvánvaló, hogy különösen a horizontális géntranszferek vettek részt a virulenciával kapcsolatos genomi szigetek elterjedésében különböző E. coli törzsek (Ochman és Jones, 2000 Touchon et al., 2009). Így a közelmúltban megjelent egy, a fajra jellemző mintegy 2000 génből álló maggenom képe a nyitott pan genom mellett (jelenleg kb. 18� gén) (Touchon et al., 2009), szemlélteti a horizontális géntranszfer nagy hatását a faj genomi plaszticitására (1. ábra). Azon helyek elemzése, ahol az inszerciók vagy deléciók preferáltan előfordultak az összesben E. coli A genomok a közelmúltban 133 ilyen hotspotot azonosítottak (Touchon et al., 2009). A 2a. ábra az ilyen helyek hipotetikus megjelenítését szemlélteti a kommenzális, EHEC és UPEC törzsek genomjában. Egy konkrét példát kínál a 2b. ábra pheV tRNS hotspot, amely a K-12 MG1655, O157:H7 (Sakai) és CTF073 (Touchon) törzsek különböző inszerteit jeleníti meg et al., 2009). Meglepő módon mind a négy vizsgált tipikus UPEC/ExPEC törzs következetesen tartalmazott egy hasonló inszertet ezen a helyen, amelyet a pép operon. Megállapították, hogy ennek az operonnak van szerepe E. coli alkalmasság a húgyúti invázióban. Érdekes módon néhány génmodul közös volt a pheV az UPEC CFT073 és K12 törzs szigetei (2b. ábra). Ezzel szemben a pheV Az inszerciós hotspot az O157:H7 törzsben (Sakai) 32 törzsspecifikus kódoló régióból állt, amelyek a feltételezett enterotoxin és citotoxin génjei mellett a hipotetikus fehérjék génjeit tartalmazták.

Az átlagos E. coli A genomot az elsődleges (gazda) és másodlagos élőhelyeiből származó evolúciós erők sokasága alakítja, amelyekben biotikusak (ragadozók, versenytársak, csalók, gazdaszervezet védekező mechanizmusai) és abiotikusak (pH, hőmérséklet, UV, ásványianyag-kimerülés stb.) nyomások vannak jelen. E. coli törzsek körülbelül 2000 génből álló maggal rendelkeznek, amelyek sokoldalú anyagcserével látják el őket. Az E. coli A pan genom körülbelül 18� génből áll, amelyekből 11% a maghoz tartozik (sötétkék), nagy része (62%, kék) úgynevezett ‘perzisztens' génekből és 26 "illékony" géneknek tekinthetők (halványkék) (Touchon et al., 2009). A génszerzés és -vesztés eseményei következetesen kapcsolódnak az inszerciós/deléciós hotspotokhoz (piros), és együtt alakítják a E. coli genom szelektíven fenntartott mag/perzisztens génekkel. Ezek az események specifikus génklaszterek evolúcióját eredményezhetik E. coli fenotípusok, mint pl pép operon, amely részt vesz az UPEC törzsek által okozott húgyúti fertőzések patogenezisében (lásd 2. ábra). A nyíl egy hipotetikus gradienst jelöl, amelyben E. coli Olyan genomikai jellemzőket mutatunk be, amelyek valószínűleg az illékony, perzisztens és maggénekhez kapcsolódnak.

Amikor teljes genomja E. coli törzsek egymáshoz igazodnak, tipikus beillesztési/törlési hotspotok azonosíthatók a megfelelő helyeken, amint azt hipotetikusan a (a). Ezeknek a régióknak a mérete és génösszetétele is nagymértékben eltérhet a törzsek között, amint azt a (b) a pheV tRNS inszerciós hotspot. Itt, a pheV Kommensális (K-12 MG1655), enterohaemorrhagiás (EHEC, O157:H7 Sakai) és uropatogén (UPEC, CTF073) törzsek gócpontjait hasonlítjuk össze a Touchon adatai alapján. et al. (2009). Az inszerciós hotspotok különböző mintákkal/színekkel kiemelt részei különböző génmoduloknak felelnek meg (lásd Touchon et al., 2009 a részletekért). A pap-operon (piros) szerepet játszik a húgyúti fertőzésekben, az UPEC/ExPEC törzsek genomikus aláírása, és megtalálható a pheV a CFT073, APEC O1, S88, UMN026 és IAI39 törzsek inszerciós hotspotjai. A fekete szakaszok géneket/génmodulokat jelölnek, amelyek a megfelelő törzsekre specifikusak. Az pheV Az O157:H7 Sakai törzs inszerciós hotspotja 32 törzsspecifikus CD-ből áll, amelyek többek között 22 hipotetikus fehérjét, 4 transzpozázt, 1 feltételezett enterotoxint és 1 feltételezett citotoxint kódolnak. A zölddel kiemelt génmodulok közösek a pheV a K-12 és a CFT073 törzsek szigetei. Az ezekben a modulokban található gének többek között glikolát-oxidázokat, glikolát transzportert és feltételezett nukleozid-trifoszfát hidrolázokat kódolnak. (Az ábra teljes színes változata a következő címen érhető el Az ISME folyóirat online).

Annak ellenére, hogy jelenleg ilyen részletes információkkal rendelkezünk a gyakran jelentős belsőE. coli A genomi variáció miatt nem ismerjük általánosan azt, hogy a genomi felépítés hogyan alakul át specifikus viselkedésben/túlélésben egy komplex nyílt környezetben. Az egyik valós lehetőség az a tény, hogy gyakran figyelmen kívül hagyjuk bizonyos szigeti jellemzők környezeti relevanciáját, amelyekről úgy gondolják, hogy fontosak a patogén folyamatban. Példa erre a mobil vasfelvevő operon rendszer ybt, amelyet eredetileg úgynevezett magas patogenitású szigetnek neveztek, amely gyakran megtalálható E. coli nál nél asn tRNS inszerciós helyek (Schubert et al., 2004). Az online genomikai adatok vizsgálata arra tanított bennünket, hogy ez az operon valójában a különböző országokban terjedt el E. coli alcsoportok patogén és kommenzális formában egyaránt (3. ábra). Az operon egy környezeti szempontból releváns tulajdonságot képvisel, amely horizontális géntranszferrel átvihető, mivel a család számos fajában és nemzetségében előfordul. Enterobacteriaceae (Schubert et al., 2009). Azt azonban nem tudjuk, hogy ez mit ad hozzá az amúgy is jelentős vasfogó képességhez E. coli.

A mobil előfordulása ybt operon, amely a yersiniabactin (Ybt) vasfelvevő rendszert kódolja E. coli különböző filogenetikai csoportok és életmódok törzsei. Az ECOR 02 és az O6:K5:H1 DSM6601 kivételével minden bemutatott törzs teljes genomja szekvenálva van. A sziget nagymértékben jelen van a B2 és D filotípusokban. Előfordulása a B2 csoport kommenzális képviselőinél ökológiai relevanciára, és esetleg az ősi B2 típusok általi elsajátítására utal. Egy szerepe a ybt Az operon lehetséges „szaprofita szigetként” feltételezhető, mivel széles körben előfordul az eltérő életmódú baktériumokban, így pl. E. coli A, B1, B2, D és E filogenetikai csoportok törzsei (Hacker és Carniel, 2001). A sziget funkcionális és "mobil" szakaszának általános ábrázolása Schuberttől származik et al. (2004) és a felső panelen látható. asn, asn tRNS gén int, integrázt kódoló gén. Gének a funkcionális operon kódjában irp, vas által szabályozott fehérjék, köztük irp2 (Ybt peptid szintetáz) és irp1 (Ybt peptid/poliketid szintetáz) ybtA, AraC típusú transzkripciós aktivátor és fyuA, külső membrán fehérje. Más gének/génklaszterek gyakran jelen vannak a genomi szigeteken, amelyek lehetővé tehetik E. coli A több résben boldogulni vagy szaprofitaként, kommenzálisként vagy kórokozóként működő törzsek azok, amelyek részt vesznek a több gyógyszerrel/antibiotikummal szembeni rezisztenciában és az adherencia faktorok termelődésében (Hacker és Carniel, 2001).


Katabolit aktivátor fehérje (CAP): aktivátor szabályozó

Csakúgy, mint a trp Az operont negatívan szabályozzák a triptofán molekulák, vannak olyan fehérjék, amelyek kötődnek az operátor szekvenciákhoz, amelyek pozitív szabályozó hogy bekapcsolja és aktiválja a géneket. Például, ha kevés a glükóz, E. coli a baktériumok más cukorforrásokhoz fordulhatnak üzemanyagként. Ehhez új géneket kell átírni ezen alternatív gének feldolgozására. Amikor a glükózszint csökken, a ciklikus AMP (cAMP) elkezd felhalmozódni a sejtben. A cAMP molekula egy jelzőmolekula, amely részt vesz a glükóz és az energia metabolizmusában E. coli. Amikor a glükózszint csökken a sejtben, a felhalmozódó cAMP a pozitív szabályozóhoz kötődik katabolit aktivátor fehérje (CAP), egy fehérje, amely az alternatív cukrok feldolgozását szabályozó operonok promótereihez kötődik. Amikor a cAMP kötődik a CAP-hoz, a komplex kötődik azon gének promoterrégiójához, amelyek az alternatív cukorforrások használatához szükségesek (1. ábra). Ezekben az operonokban egy CAP-kötőhely a promoter RNS-polimeráz kötőhelyétől felfelé helyezkedik el. Ez növeli az RNS polimeráz kötőképességét a promoter régióhoz és a gének transzkripcióját.

1. ábra: Amikor a glükózszint csökken, E. coli más cukrokat is használhat üzemanyagként, de ehhez új géneket kell átírnia. Ahogy a glükózellátás korlátozottá válik, a cAMP szintje emelkedik. Ez a cAMP kötődik a CAP fehérjéhez, egy pozitív szabályozóhoz, amely az egyéb cukorforrások használatához szükséges gének előtti operátor régióhoz kötődik.


4 A biofilm, mint az alapértelmezett növekedési mód

A laboratóriumban a baktériumokat általában planktonikusan tenyésztik, de a tenyészedényekben létrehozott utópisztikus mikrokozmoszokat úgy alakították ki, hogy maximalizálják a baktériumok növekedési sebességét, nem pedig a baktériumok természetes növekedési feltételeit. Valójában úgy tűnik, hogy egyes baktériumfajok konstitutívan használják a biofilm módot a laboratóriumon kívül. Az orális streptococcusok nagyon jól alkalmazkodnak a fogak felszínén történő ülő növekedéshez. A legtöbb szájbaktériumfajnak nincs környezeti rése, és szinte kizárólag a szájban találhatók [24]. Ezeket a baktériumokat a plankton növekedés miatt a nyál gyorsan kimossa, lenyeli és a gyomor savas levében elpusztítja. Ezek a baktériumok valószínűleg természetes létezésük nagy részét biofilmként nőve töltik. Ennek ellenére gyakran planktonikusan termesztik őket a laboratóriumban.

Lehetséges, hogy a rögzítéshez megfelelő szubsztrát jelenléte elegendő a biofilm képződésének elindításához. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy közvetlenül a baktériumok szilárd felülethez való kezdeti tapadását követően a génszabályozás változásai kezdődnek [4, 44]. Ez arra utal, hogy a sejtek valójában érzékelik azt a szilárd felületet, amelyhez kapcsolódnak, és hogy ez az érzékelő rendszer egy jelátviteli kaszkádot indít el, amely a biofilm kialakulásához szükséges korai génexpressziós minták némelyikéhez vezethet. Például be P. aeruginosa, kifejezése algC, az alginát szintézishez szükséges gén mennyisége a kapcsolódás után perceken belül megnövekszik, és amikor S. epidermidis szilárd felülettel érintkezik, a normál esetben gömb alakú sejt lábszerű függeléket képez [45, 46]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az eukarióta sejtekhez hasonlóan a bakteriális sejtek is rendelkeznek olyan felületérzékelő rendszerrel, amely elég erős intracelluláris jeleket indukál ahhoz, hogy transzkripciós és morfológiai változásokat eredményezzen.

A baktériumok által az adherencia kimutatására használt érzékelési mechanizmusok nem teljesen ismertek. Az észlelt ozmolaritás változása, amelyet a szilárd felületeken lévő töltések okoznak, fontos jelzés lehet a baktériumoknak a felületek felismerésében [22]. A környezeti ozmolaritás érzékelésében részt vevő EnvZ–OmpR kétkomponensű rendszerről kimutatták, hogy szabályozza a curli és a kolánsav expresszióját is [47, 48]. A rostos felületi szerkezetű curli szerepet játszik a tapadásban, a kolánsav pedig egy exopoliszacharid, amely az aggregációban vesz részt. Az ozmolaritás szerepét a biofilm szabályozásában staphylococcusoknál is megfigyelték [13], ill. Pseudomonas fluorescens[49]. Összességében a biofilm növekedési módja lehet az alapértelmezett növekedési mód legalább néhány baktériumfaj számára, ami azt sugallja, hogy inkább azt kellene megkérdőjeleznünk, hogy mi váltja ki a plankton növekedési módot, nem pedig azt, hogy mi motiválja a biofilm növekedési módját.


E. coli

Szerkesztőink áttekintik az Ön által beküldött tartalmakat, és eldöntik, hogy módosítsák-e a cikket.

E. coli, (Escherichia coli), olyan baktériumfaj, amely általában a gyomorban és a belekben él. Amikor E. coli szennyezett vízben, tejben vagy élelmiszerben fogyasztva, vagy légy vagy más rovar csípésén keresztül terjed, gyomor-bélrendszeri megbetegedést okozhat. A mutációk olyan törzsekhez vezethetnek, amelyek hasmenést okoznak azáltal, hogy méreganyagokat bocsátanak ki, behatolnak a bélnyálkahártyába, vagy megtapadnak a bélfalon. A gyomor-bélrendszeri betegségek terápiája nagyrészt folyadékpótlásból áll, bár bizonyos esetekben bizonyos gyógyszerek hatásosak. A betegség általában magától elmúlik, és nincs bizonyíték a hosszan tartó hatásokra. Azonban a veszélyes törzsek, mint pl E. coli O157:H7 és E. coli O104:H4, extrém esetekben véres hasmenést, veseelégtelenséget és halált okozhat. A hús megfelelő főzésével és a termékek mosásával megelőzhető a szennyezett élelmiszerforrásokból származó fertőzés. E. coli nőknél húgyúti fertőzéseket is okozhat.


Gram-festés

Az E. coli-t Gram-negatív baktériumként írják le. Ennek az az oka, hogy a Gram-festéssel negatívan festenek.

A Gram-festés egy differenciáltechnika, amelyet általában a baktériumok osztályozására használnak. A festési technika a baktériumok két fő típusát (gram-pozitív és gram-negatív) különbözteti meg azáltal, hogy színt ad a sejteknek.

Mivel Gram-negatív baktériumok, az E. colinak van egy további külső membránja, amely foszfolipidekből és lipopoliszacharidokból áll. A lipopoliszacharidok jelenléte a baktériumok külső membránján általános negatív töltést ad a sejtfalnak. Ezen tulajdonságok miatt az E. coli nem tartja meg a kristályibolyát a Gram-festési folyamat során.


Vita

A mérnöki nitrogénmegkötés lehetősége növényi kultúrákban bevezetésével nif A gének növényi sejtekbe juttatását az átvitel első lépése óta javasolják nif A diazotróf baktériumból a nem-diazotróf baktériumba mutató géneket több mint 45 évvel ezelőtt realizálták (35). Ez azonban nem könnyű cél, és számos jól elfogadott kihívással kell szembenézni, beleértve az érintett gének sokaságát, a Nif-komponensek kiegyensúlyozott expressziójának fenntartásának követelményét, az energia- és a redukáló teljesítményigényt, valamint az oxigénérzékenységet. nitrogenáz. A szintetikus biológiai eszközök fejlesztése lehetővé tette nif a klaszterek újratervezése és a génrészek nagy áteresztőképességű kombinatorikus könyvtárai a Nif-fehérjék komplex kombinációinak prokariótákban vagy eukariótákban történő kifejezésére (15, 29). A Nif komponensek sztöchiometrikus expressziójának eléréséhez poliprotein alapú stratégiát alkalmaztak a génszám csökkentésére, ami a nitrogenáz bioszintéziséhez és aktivitásához szükséges fehérjekomponensek kiegyensúlyozott expresszióját eredményezte (36). Annak vizsgálatára, hogy a növényi elektrontranszport láncok helyettesíthetik-e prokarióta társaikat elektrondonorként a nitrogenáz katalízis támogatására, növényi organellumokból származó elektrontranszport modulokat állítottak fel E. coli és azt találták, hogy elektrondonorként szolgálnak a nitrogenázhoz (37). Mivel a növények potenciálisan biztosíthatják a nitrogenáz aktivitás támogatásához szükséges energiát és csökkentő teljesítményt, ez tovább csökkentheti a növényekben a mérnöki nitrogénkötéshez szükséges génszámot.

A növényi organellumokat régóta megfelelő helynek tekintették a nitrogenáz számára, tekintettel az energiaátalakításban betöltött szerepükre, és így potenciálisan magas koncentrációjú ATP-t és a nitrogenáz aktivitáshoz szükséges csökkentő energiát biztosíthatják (10). A mitokondriumok légzési aktivitása és a vas-kén klaszter-összeállító útvonal jelenléte ebben az organellumban arra utal, hogy a mitokondriális mátrix valószínűleg oxigénhiányos, és így megfelelő környezetet biztosíthat a nitrogenáz számára. Ezt megerősítette az a szeminárium, hogy a nitrogenáz Fe fehérje, a nitrogenáz leginkább oxigénérzékeny komponense, teljesen aktív formában tisztítható aerob módon növesztett élesztőből, ha mitokondriumban expresszálódik (12). Így az oxigénprobléma megoldódott, legalábbis ennél az organellumnál. Ezzel szemben, ahogyan az várható volt, alacsonyabb Fe fehérje aktivitást lehetett kinyerni a kloroplasztiszokból, és ebben az esetben a Nif-specifikus vas-kén klaszter összeállítási komponensek NifU és NifS felvételére volt szükség az aerob körülmények közötti aktivitás eléréséhez (16).

Bár az aktív Fe fehérje összeállításához viszonylag kevés Nif komponensre van szükség, a MoFe fehérje bioszintézisének követelményei sokkal bonyolultabbak, és legalább kilenc Nif fehérjéből álló minimális génkészletet foglalnak magukban, és további követelmény a molibdén, homocitrát és S-adenozil-metionin a FeMo-co bioszintézisének támogatására. Bár számos Nif fehérjét expresszáltak élesztőben és növényi mitokondriumban, a komponensek megfelelő sztöchiometrikus expressziója érdekében, oldhatósági és stabilitási problémák merültek fel (13, 15). Egyes esetekben sikerült kihasználni a különböző diazotrófokból származó Nif fehérjék biológiai sokféleségét. Ezt a stratégiát használva egy oldható és in vitro funkcionális NifB a M. infernus élesztő mitokondriumokban kifejezve (14, 17). A NifDK tetramer expressziója és összeállítása azonban problémás volt, valószínűleg a NifD rendellenes proteolitikus feldolgozása miatt. Ez jelentős akadályt képez az aktív MoFe fehérje expressziójának elérésében a mitokondriumokban.

Mivel az organellumokon belül számos fehérjét kódol a nukleáris genom, a mérnöki stratégiák gyakran alkalmaznak célzási megközelítést, amelyben a vezető peptideket használják a nukleáris transzgénekből expresszált fehérjéknek az organellumokba történő szállítására. A fehérje célzása különösen fontos a mitokondriumok tervezésénél, mivel ezekre az organellumokra még nem dolgoztak ki stabil és kényelmes transzformációs módszert. Ez vonatkozik a haszonnövények kloroplasztiszának tervezésére is, mivel bár a plasztisz transzformáció rutinszerű a kétszikű modellnövényekben, az egyszikűekben nem jól bevált. Az organellum-célzási megközelítés megköveteli a fehérje hatékony transzlokációját mindkét mitokondriális membránon keresztül, valamint a vezető peptid megfelelő feldolgozását és hasítását, miután a preprotein bejutott a mitokondriális mátrixba. Általában ez a folyamat a fehérje megfelelő méretű feldolgozását eredményezi, bár gyakran fontos különböző vezető peptidek kipróbálása a pontos feldolgozás érdekében. Bár úgy gondoltuk, hogy számos endopeptidáz jelölt lehet felelős a NifD lebontásáért a mitokondriális mátrixban, miután azonosítottuk a hasításhoz szükséges régiót, arra a lehetőségre összpontosítottunk, hogy a mitokondriális feldolgozó peptidáz a NifD közeli másodlagos feldolgozását végzi. az R98 maradékhoz. Bár az MPP-k által felismert aminosav-szekvenciákban jelentős degeneráció tapasztalható, az R98 fontossága és egy aromás csoport két aminosavval lefelé történő elhelyezkedése (Y100) az MPP általi hasításra utal (38). Az R98-cal egyenértékű maradék teljes megőrzése, kombinálva a különféle forrásokból származó NifD fehérjék erősen konzervált Y100-as maradékával, azt jelenti, hogy a lebomlási probléma nem oldható meg a NifD fehérjék biológiai sokféleségének kihasználásával (38). Valójában ezt tapasztaltuk, amikor megvizsgáltuk a NifD stabilitását négy különböző diazotróf élesztő mitokondriumában, és felfedeztük, hogy a hasítás minden esetben megelőzhető az ekvivalens R98K szubsztitúció megalkotásával (1. ábra).E).

Annak egyértelmű megerősítésére, hogy az MPP volt a felelős a hasításért, az élesztő MPP-t rekonstruáltuk E. coli és kimutatták, hogy a fehérje elvégzi a NifD endoproteolitikus hasítását, hogy ugyanazokat a feldolgozott fragmentumokat hozza létre, mint az élesztőben. Ez az aktivitás nem specifikus az élesztő MPP-re, mivel három növényi eredetű MPP-nél is megfigyelhető volt, a feldolgozást a NifD R98 variáns minden esetben megakadályozta (2. ábra). Élesztőben mindkét MPP alegység a mátrixban található (39), míg a növényekben mindkét MPP alegységα és MPPβ alegységei teljesen beépülnek a citokrómba időszámításunk előtt1 a légzőlánc komplexét Core1 és Core2 fehérjék formájában (40). Mivel E. coli nem rendelkezik a kódoló génekkel cyt bc1 komplex (41), a növényi típusú MPP-k helyreállítása ebben a gazdaszervezetben potenciálisan befolyásolhatja a feldolgozási aktivitást. Megfigyeltük azonban, hogy a növényi típusú MPP-k hatékonyan dolgozták fel a Su9 vezető peptidet E. coli (3. ábraB), alátámasztja a korábbi bizonyítékokat arra vonatkozóan, hogy az elektrontranszfer a cyt bc1 komplex nem szükséges a feldolgozáshoz (42).

Bár azonosítottunk egy belső hasítási helyet az MPP számára a NifD-n belül, ennek a hasítási helynek az elérhetősége az élesztő mitokondriumok megcélzása után továbbra sem világos. A mitokondriális membránokon át történő transzlokáció megköveteli, hogy a NifD kibontott állapotban legyen, és ebben az időszakban a fehérjét MPP-nek teszik ki, hogy eltávolítsák a szignálpeptidet. Azt gyanítjuk, hogy az MPP a NifD-n belüli belső helyet is hasítja ebben az időszakban, mielőtt a fehérje a megfelelő formába hajtogatott. Ez a másodlagos hasítási esemény még a NifK-val való kölcsönhatás előtt megtörténhet, ezzel magyarázva a stabil NifDK heterotetramerek élesztő mitokondriumokban való összeállításának nehézségeit (15). Alternatív megoldásként lehetséges, hogy az MPP felismeri azt a NifD-t, amely a mitokondriális mátrixba történő transzlokáció után rosszul hajtódik össze. Azonban, ha ez a helyzet, nehéz lenne racionalizálni, hogy az R98P változat hogyan indukálja a helyes hajtogatást. Ezen túlmenően a proteáz aktív a vad típusú NifD ellen az ép bakteriális rendszerben, erős bizonyítékot szolgáltatva arra, hogy nem a téves feltekeredés az elsődleges oka a degradációnak. Mindazonáltal fontos megjegyezni, hogy a NifD hasítása a bakteriális rendszerben nem feltétlenül jelenti azt, hogy az MPP felismeri a MoFe fehérje érett formáját, amely tele van metalloclusterekkel. Az MPP hasítása a nitrogenáz MoFe fehérje érése előtti szakaszban történhet, az összeállítás kinetikától függően. Például az apo-NifDK-t a proteáz hasítja, de a holo-NifDK-tetramer, amely tele van metalloclusterekkel, olyan konformációval rendelkezhet, amelyben a hasítási hely nem érhető el. Összefoglalva, nehéz megkülönböztetni, hogy az MPP hasítása a NifD belső helyén megtörténik-e az élesztő mitokondriumaiban a fehérje hajtogatása előtt, vagy a hasítási hely hozzáférhető marad a holo NifDK heterotetramer érése során.

A növényi organellumok fontos célpontjai heterológ anyagcsere-útvonalak vagy komplex biológiai rendszerek bevezetésének a növényi géntechnológiában. Eredményeink rávilágítanak az organellumokat célzó idegen fehérjék megfelelő feldolgozásával kapcsolatos problémákra, és rámutatnak az aberráns feldolgozás kockázatára, amely a nem gazdafehérje szekvenciákban jelen lévő szubliminális szignálpeptid hasítási helyek következménye. Bár az ilyen szekvenciák előfordulása valószínűleg szerény, a szignálpeptid hasítási proteázok az idegen fehérjék „kapuőreinek” tekinthetők. Mivel a feldolgozó peptidázok által felismert aminosav-szekvenciák jelentős degenerációt mutatnak, nehéz pontosan megjósolni, hogy az idegen fehérjék lebomlanak-e az organellumokba való bejutást követően. Megközelítésünk az MPP-k helyreállításához E. coli egy egyszerű biológiai vizsgálatot biztosít a stabilitás előzetes értékelésére az eukariótákban történő tervezés előtt, és ha szükséges, irányított evolúciót hajt végre a stabil expresszió érdekében a mitokondriumokban.


Egymolekulájú enzimológia: nanomechanikai manipuláció és hibrid módszerek

K. Manibog , . S. Sivasankar, Methods in Enzymology, 2017

3.2 Műszaki fehérjék AFM erőméréshez

Rekombináns fehérjék állíthatók elő AFM erőméréshez standard molekuláris biológiai technikákkal. Az egyetlen követelmény az, hogy a fehérjéket olyan molekuláris fogantyúval kell kialakítani, amellyel rögzíthető a fehérje egy felületen. Míg az irodalomban sokféle immobilizációs kémiát, például Cys-maradékokon keresztül történő immobilizálást (Dietz és mtsai, 2006) írtak le, kísérleteinkben sztreptavidin-biotin kémiát alkalmazunk az Ecad immobilizálására. Röviden, az Ecad teljes hosszúságú extracelluláris doménjei egy C-terminális Avi-címkével (biotinilezéshez), egy Tev-szekvenciával (proteolitikus hasításhoz) és egy His-címkével (fehérjetisztításhoz) expresszálódnak HEK293T-sejtekben, és megtisztulnak. a kondicionált közegből nikkel NTA gyantával. A fehérjetisztítás után az Avi-tag szekvenciát BirA enzimmel (BirA500 kit Avidity) biotinilezzük. Mivel ezeket a protokollokat részletesen leírtuk korábbi munkáinkban (Manibog et al., 2014 Rakshit et al., 2012 Zhang, Sivasankar, Nelson és amp Chu, 2009), és nem képezik a fő hangsúlyt jelen áttekintésben, ezeket nem tárgyaljuk. módszereket részletesebben.


Nézd meg a videót: कलसटरल बढन क सब स आम लकषण. Cholesterol Badhne Ke Lakshan Kya Hain (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Zulkinos

    Tévedsz. Írja be, hogy megbeszéljük.

  2. Ayrwode

    I waited so long and now - =)

  3. Bemeere

    Kijelentem. A fentiek mind elmondták az igazat.

  4. Mazusida

    Nem fogok beszélni erről a témáról.

  5. Yolkree

    Interesting posts are definitely your style!



Írj egy üzenetet