Információ

Miért általában a denaturált fehérjék kevésbé oldódnak, mint a natív fehérjék?

Miért általában a denaturált fehérjék kevésbé oldódnak, mint a natív fehérjék?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Miért általában a denaturált fehérjék kevésbé oldódnak, mint a natív fehérjék? A hidrofób hatásokat illetően valaki meg tudná magyarázni nekem ezt a jelenséget?


Háttér-információ

Egy natív fehérje hidrofób aminosavai befelé hajtogatva vannak, tehát hidrofób magja van. miért? Mert termodinamikailag előnyös. Amikor egy fehérje denaturálódik, a hidrofób aminosavak nem maradnak tovább a fehérje magjában, hanem ki lesznek téve a hidrofil környezetnek (feltételezve, hogy egy szervezetben lévő fehérjéről beszélünk). Ez azonban termodinamikailag nem előnyös, mivel a hidrofób részek nem tudnak H-kötést kialakítani a vízzel, ezért nem nagyon oldódnak vízben:

Tehát amikor ez megtörténik, sok fehérjemolekula szappanmicellákhoz hasonlóan aggregálódik (mivel a hidrofób kölcsönhatásokat részesítik előnyben). Ez csökkenti a vízzel érintkező hidrofób aminosavak teljes felületét, így csökken a vízmolekulák H-kötésének zavara.

Íme az én saját készítésű képem a szerves molekulák vízben lévő H-kötésre gyakorolt ​​hatásáról (ez elég durva, szóval ne törődj a finom részletekkel).

Összefoglalva a hidrofób aminosavak ki lesznek téve a hidrofil környezetnek --> a fehérjék aggregálódnak --> oldhatatlan plakk.


Denaturáció (biokémia)

Denaturáció olyan folyamat, amelyben a fehérjék vagy nukleinsavak elvesztik a natív állapotukban meglévő kvaterner szerkezetüket, harmadlagos szerkezetüket és másodlagos szerkezetüket valamilyen külső stressz vagy vegyület, például erős sav vagy bázis, tömény szervetlen só, szerves oldószer (pl. alkohol vagy kloroform), sugárzás vagy hő. [3] Ha egy élő sejtben a fehérjék denaturálódnak, az a sejtaktivitás megzavarásához és esetleg sejthalálhoz vezet. A fehérje denaturációja szintén a sejthalál következménye. [4] [5] A denaturált fehérjék jellemzők széles skáláját mutathatják, a konformációs változásoktól és az oldhatóság elvesztésétől a hidrofób csoportok expozíciója miatti aggregációig. A denaturált fehérjék elvesztik 3D-s szerkezetüket, ezért nem tudnak működni.

1. megjegyzés: Módosítva a ref. [1]

Jegyzet 2: Denaturáció fordulhat elő, ha a fehérjéket és a nukleinsavakat megemelt hőmérsékletnek vagy szélsőséges pH-értéknek, vagy nem fiziológiás só-, szerves oldószer-, karbamid- vagy egyéb vegyi anyagok koncentrációjának teszik ki.

3. megjegyzés: An enzim denaturálásakor elveszíti katalitikus aktivitását. [2]

A fehérje hajtogatása kulcsfontosságú ahhoz, hogy egy globuláris vagy membránfehérje megfelelően tudja-e ellátni a feladatát, megfelelő alakra kell hajtogatni, hogy működjön. Azonban a hidrogénkötések, amelyek nagy szerepet játszanak a hajtogatásban, meglehetősen gyengék, ezért könnyen befolyásolják a hőt, a savasságot, a változó sókoncentrációt és más stressztényezőket, amelyek denaturálhatják a fehérjét. Ez az egyik oka annak, hogy a homeosztázis fiziológiailag szükséges számos életformában.

Ez a fogalom nem kapcsolódik a denaturált alkoholhoz, amely olyan alkohol, amelyet adalékanyagokkal kevertek össze, hogy emberi fogyasztásra alkalmatlanná váljanak.


A kibontott fehérjeválasz és a celluláris stressz, B rész

Daisuke Oikawa, Yukio Kimata, Methods in Enzymology, 2011

4.3 In vitro anti-aggregáció vizsgálat

Modell denaturált fehérje szubsztrátként luciferázt (Promega) és citrát-szintázt (Roche) alkalmaztunk. A citrát-szintázt törzspufferrel (20 ml) dializáltukM HEPES (pH 7,0), 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, és 10% (v/v) glicerin), és –80 °C-on tároljuk. Denaturáláshoz luciferáz (25 μM végső koncentráció) és citrát-szintáz (50 μM végső koncentrációban) guanidin-HCl-denaturáló oldatban (guanidin-HCl (6 M luciferázra vagy 4 M citrát-szintázhoz), 20 mM HEPES (pH 7,2), 50 mM KCl és 2 mM MgCl2) 30 percig szobahőmérsékleten. A denaturált fehérje keverékeket ezután hígítottuk (50-szeres hígítás a luciferázhoz vagy 33-szoros hígítás a citrát szintázhoz) vizsgálati pufferrel (20 mM HEPES (pH 7,2), 50 mM KCl és 2 mM MgCl2) a vizsgált rekombináns fehérjék jelenlétében vagy hiányában. A hígítás utáni fehérje aggregációt 320 nm-en optikai abszorbanciával követtük spektrofotométerrel (DU640 Beckman Coulter) szobahőmérsékleten.


A fehérjék hővel történő denaturációjának tudománya

A másodlagos, harmadlagos és kvaterner szerkezetekben bekövetkező jelentős változások a peptid kötések gerincének felhasadása nélkül „denaturáció”. Az olyan finom szerkezeti változásokat, amelyek nem változtatják meg drasztikusan a fehérje molekuláris felépítését, általában „konformációs alkalmazkodóképesség”. A fehérje peptidkötéseinek lebomlása peptidekre vagy aminosavra:emésztés"

A fehérje szerkezete különböző vonzó és taszító kölcsönhatásoktól függ, amelyek különböző intramolekuláris erőkből erednek, valamint különböző fehérjecsoportok kölcsönhatásától a környező oldószeres vízzel. A natív állapot (egyetlen fehérjemolekula) termodinamikailag a legstabilabb, fiziológiás körülmények között a legalacsonyabb szabad energiával. Bármilyen változás a környezetében, mint például a pH, az ionerősség, a hőmérséklet, az oldószer összetétele stb., arra kényszeríti a molekulát, hogy új egyensúlyi szerkezetet vegyen fel.

A fehérje szerkezetének megértése

Hogyan mérjük a fehérje denaturációt?

A denaturáció magában foglalja a fehérje jól meghatározott, fiziológiás körülmények között kialakult, hajtogatott szerkezetének transzformációját nem fiziológiás körülmények között fel nem hajtogatott állapotba. Mint tudjuk, a szerkezetet közvetlenül nem tudjuk mérni, azaz a natív és denaturált fehérje frakcióinak közvetlen mérése oldatban nem lehetséges. A fehérjék konformációs változásai azonban változatlanul befolyásolják számos kémiai és fizikai tulajdonságát, mint például az ultraibolya (UV) abszorbanciát, a fluoreszcenciát, a viszkozitást, az ülepedési együtthatót, az optikai rotációt, a körkörös dikroizmust, a szulfhidrilcsoportok reaktivitását és az enzimaktivitást. Így a fehérjék denaturációja e fizikai és kémiai tulajdonságok változásának nyomon követésével vizsgálható.

Denaturálószerként melegítjük

A hő a leggyakrabban használt anyag az élelmiszer-feldolgozásban és -tartósításban. Amikor egy fehérjeoldatot fokozatosan egy kritikus hőmérséklet fölé melegítünk, éles átmeneten megy keresztül a natív állapotból a denaturált állapotba. Az átmeneti középpont hőmérsékletét, ahol a natív és denaturált állapotok koncentrációaránya 1, vagy Tm olvadási hőmérsékletnek vagy Td denaturációs hőmérsékletnek nevezzük..

A hőmérséklet által kiváltott denaturáció mechanizmusa nagyon összetett, és elsősorban a fő nem kovalens kölcsönhatások destabilizációját foglalja magában. A hidrogénkötés, az elektrosztatikus és a van der Waals kölcsönhatások exoterm (entalpiavezérelt) jellegűek. Ezért magas hőmérsékleten destabilizálódnak, alacsony hőmérsékleten pedig stabilizálódnak. Mivel azonban a fehérjékben lévő peptid-hidrogénkötések többnyire a belső térben vannak eltemetve, széles hőmérséklet-tartományban stabilak maradnak. Másrészt a hidrofób kölcsönhatások endotermek (entrópiavezéreltek). Magas hőmérsékleten stabilizálódnak, alacsony hőmérsékleten destabilizálódnak. Ezért a hőmérséklet növekedésével a nemkovalens kölcsönhatások e két csoportja stabilitásának változásai ellentétesek egymással. A hidrofób kölcsönhatások stabilitása azonban nem nőhet végtelenül a hőmérséklet emelkedésével, mert egy bizonyos hőmérséklet felett a vízszerkezet fokozatos lebomlása végül a hidrofób kölcsönhatásokat is destabilizálja. A hidrofób kölcsönhatások erőssége körülbelül 60-70 °C-on éri el a maximumot.

Egy másik jelentős erő, amely befolyásolja a fehérjék konformációs stabilitását, a konformációs entrópia, –T DSA polipeptidlánc konf. A hőmérséklet növekedésével a polipeptidlánc hőkinetikai energiájának növekedése nagymértékben megkönnyíti a polipeptidlánc kibontakozását.

Fehérje denaturáció és aminosav összetétel
A fehérjék hő általi denaturációja a fehérjék aminosav-összetételétől is függ. A nagyobb arányban hidrofób aminosavakat tartalmazó fehérjék, különösen a Val, Ile, Leu és Phe, általában stabilabbak, mint a hidrofilebb fehérjék. A termofil organizmusok fehérjéi általában nagy mennyiségű hidrofób aminosav-maradékot tartalmaznak. Azt is mondják, hogy más tényezők, például a diszulfid kötések és a hidrofób hasadékokba temetett sóhidak is hozzájárulhatnak a termostabilitáshoz.

Fehérjedenaturáció és víztartalom
A víz nagymértékben megkönnyíti a fehérjék termikus denaturációját [37,95]. A száraz fehérjeporok rendkívül stabilak a termikus denaturációval szemben. Az értéke Td gyorsan csökken, ha a víztartalom 0-ról 0,35 g víz/g fehérje értékre emelkedik. A hidratáció termostabilitásra gyakorolt ​​hatása alapvetően összefügg a fehérje dinamikájával. Száraz állapotban a fehérjék statikus szerkezetűek, vagyis a polipeptid szegmensek mobilitása korlátozott. A víztartalom növekedésével a hidratáció és a víz részleges behatolása a felszíni üregekbe a fehérje duzzadását okozza. A fehérje duzzadása növeli a lánc mobilitását és rugalmasságát, és a fehérje molekula dinamikusabb olvadt szerkezetet vesz fel. Fűtéskor ez a dinamikusan rugalmas szerkezet nagyobb hozzáférést biztosít a víznek a sóhidakhoz és a peptid hidrogénkötésekhez, mint száraz állapotban, ami alacsonyabb Td.

Hideg okozta denaturáció
Azt mondják, hogy minél alacsonyabb a hőmérséklet, annál nagyobb lesz a fehérje stabilitása. E szabály alól vannak kivételek. Azok a fehérjék, amelyekben a poláris kölcsönhatások dominálnak a nem poláris kölcsönhatásokkal szemben, stabilabbak hűtési hőmérsékleten vagy az alatt, mint magasabb hőmérsékleten. Másrészt azok a fehérjék, amelyeket elsősorban hidrofób kölcsönhatások stabilizálnak, stabilabbak körülbelül környezeti hőmérsékleten, mint hűtési hőmérsékleten.

  • A lizozim stabilitása a hőmérséklet csökkenésével növekszik, míg a mioglobin és a mutáns fág T4 lizozim stabilitása körülbelül 30 °C-on, illetve 12,5 °C-on mutat maximális stabilitást. Ezen hőmérséklet alatt és felett a mioglobin és a T4 lizozim kevésbé stabil. 0°C alatti tárolás esetén ez a két fehérje átalakul hideg által kiváltott denaturáció.
  • Ha a sovány tejet 4 °C-on tárolják, a b-kazein disszociál a kazein micellákról, és ez megváltoztatja a micellák fizikai-kémiai és oltóanyag-képző tulajdonságait.

A fehérje denaturációja reverzibilis.
Amikor a denaturálószert eltávolítjuk a fehérjeoldatból (vagy a mintát lehűtjük), a legtöbb monomer fehérje (aggregáció hiányában) megfelelő oldatkörülmények (például pH, ionerősség, redoxpotenciál és fehérjekoncentráció) mellett újra feltekerődik natív konformációjára. .

  • A glicinin, a szójabab egyik raktározó fehérjéje, aggregálódik és kicsapódik, ha 2°C-on tároljuk, majd oldhatóvá válik, ha visszatesszük a környezeti hőmérsékletre.
  • Számos oligomer enzim, mint pl laktát-dehidrogenáz és gliceraldehid-foszfát-dehidrogenáz4°C-on tárolva elveszítik enzimaktivitásuk nagy részét, és ez az alegységek disszociációjának tulajdonítható. Ha azonban néhány órán át szobahőmérsékletre melegítik és ott tartják, újra asszociálódnak és teljesen visszanyeri tevékenységüket.
  • A monomer globuláris fehérjék termikus denaturációja többnyire reverzibilis. Például, ha sok monomer enzimet denaturációs hőmérséklete fölé melegítenek, vagy akár rövid ideig 100 °C-on tartjuk, majd azonnal szobahőmérsékletre hűtjük, teljesen visszanyeri aktivitásukat. A termikus denaturáció azonban visszafordíthatatlanná válhat, ha a fehérjét hosszabb ideig 90-100 °C-on hevítik, még semleges pH mellett is. Ez az irreverzibilitás a fehérjében végbemenő számos kémiai változás miatt következik be, mint például az Asn-maradékok dezaminációja, az Asp-maradékoknál a peptidkötések hasadása, a Cys és a cisztin-maradékok elpusztulása és aggregáció.

Javasolt előadás a fehérjedenaturációról

Hivatkozás: Élelmiszer-kémia l1996 l 3. kiadás Írta: O R Fennema l Marcel Dekker


Miért általában a denaturált fehérjék kevésbé oldódnak, mint a natív fehérjék? - Biológia

A fehérjék aminosavak polimerei. Húsz különböző típusú aminosav fordul elő a természetben a fehérjékben. A fehérjék a polipeptid gerincét alkotó aminosavak típusa, száma és szekvenciája szerint különböznek egymástól. Ennek eredményeként eltérő molekulaszerkezettel, táplálkozási jellemzőkkel és fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. A fehérjék számos különböző okból fontos összetevői az élelmiszereknek. Jelentős energiaforrást jelentenek, valamint olyan esszenciális aminosavakat tartalmaznak, mint a lizin, triptofán, metionin, leucin, izoleucin és valin, amelyek nélkülözhetetlenek az emberi egészséghez, de amelyeket a szervezet nem tud szintetizálni. A fehérjék számos természetes élelmiszer fő szerkezeti összetevői is, amelyek gyakran meghatározzák azok általános állagát, például a hús- vagy haltermékek érzékenységét. Az izolált fehérjéket gyakran használják élelmiszerekben összetevőként, egyedi funkcionális tulajdonságaik miatt, azaz képesek a kívánt megjelenést, állagot vagy stabilitást biztosítani. Jellemzően a fehérjéket zselésítőszerként, emulgeálószerként, habosítószerként és sűrítőszerként használják. Sok élelmiszer-fehérje olyan enzim, amely képes bizonyos biokémiai reakciók sebességét fokozni. Ezek a reakciók kedvező vagy káros hatással lehetnek az élelmiszerek általános tulajdonságaira. Az élelmiszer-elemzőket érdekli az élelmiszerekben található fehérjék összkoncentrációjának, típusának, molekuláris szerkezetének és funkcionális tulajdonságainak ismerete.

6.2. A teljes fehérjekoncentráció meghatározása

A Kjeldahl-módszert egy Johann Kjeldahl nevű sörfőző fejlesztette ki 1883-ban. Az élelmiszert erős savval emésztjük meg, így nitrogént bocsát ki, amely megfelelő titrálási technikával meghatározható. A jelenlévő fehérje mennyiségét ezután az élelmiszer nitrogénkoncentrációjából számítják ki. Ugyanezt az alapvető megközelítést alkalmazzák ma is, bár számos fejlesztés történt a folyamat felgyorsítása és a pontosabb mérések elérése érdekében. Általában ezt tekintik a fehérjekoncentráció meghatározásának standard módszerének. Mivel a Kjeldahl-módszer nem méri közvetlenül a fehérjetartalmat, konverziós tényező (F) szükséges a mért nitrogénkoncentráció fehérjekoncentrációvá alakításához. A 6,25-ös (0,16 g nitrogén/g fehérje) konverziós tényezőt sok alkalmazásnál alkalmaznak, ez azonban csak egy átlagos érték, és az aminosav-összetételtől függően minden fehérjének más-más konverziós tényezője van. A Kjeldahl-módszer kényelmesen három lépésre osztható: emésztés, semlegesítés és titrálás.

Az elemzendő élelmiszermintát emésztő lombikba mérik, majd kénsav (az élelmiszert emésztő oxidálószer), vízmentes nátrium-szulfát (a reakció felgyorsítása a forráspont emelésével) jelenlétében melegítik. katalizátor, például réz, szelén, titán vagy higany (a reakció felgyorsítására). Az emésztés során az élelmiszerben lévő nitrogént (kivéve azt, amely nitrát vagy nitrit formájában) ammóniává, a többi szerves anyagot pedig C0 2 -vé és H 2 0 -dá alakítja. Savas oldatban ammóniagáz nem szabadul fel, mert az ammónia az ammóniumion (NH 4 + ) formája, amely a szulfátionhoz (SO 4 2- ) kötődik, és így oldatban marad:

Az emésztés befejezése után az emésztőlombikot egy csővel csatlakoztatják egy gyűjtőlombikhoz. Az emésztőlombikban lévő oldatot ezután nátrium-hidroxid hozzáadásával lúgosítják, amely az ammónium-szulfátot ammóniagázzá alakítja:

(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH ® 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2)

A képződő ammóniagáz felszabadul az oldatból, és kikerül az emésztő lombikból a befogadó lombikba, amely feleslegben tartalmaz bórsavat. A fogadólombikban lévő oldat alacsony pH-ja az ammóniagázt ammóniumionná alakítja, és ezzel egyidejűleg a bórsavat borátionná alakítja:

NH 3 + H 3 BO 3 (bórsav) ® NH 4 + + H 2 BO 3 - (borátion) (3)

A nitrogéntartalmat ezután a képződött ammónium-borát standard kénsavval vagy sósavval történő titrálásával becsülik meg, megfelelő indikátor segítségével a reakció végpontjának meghatározására.

H 2BO 3 - + H + ® H 3 BO 3 (4)

A végpont eléréséhez szükséges hidrogénionok koncentrációja (mólokban) megegyezik az eredeti élelmiszerben lévő nitrogénkoncentrációval (3. egyenlet). A következő egyenlet használható egy m gramm tömegű minta nitrogénkoncentrációjának meghatározására x M HCl-savoldat felhasználásával a titráláshoz:

Ahol vs és vb a minta és a vakpróba titrálási térfogata, és 14 g a nitrogén-N molekulatömege. A vakmintát általában az elemzendő anyaggal egy időben futtatják, hogy figyelembe vegyék az esetlegesen előforduló maradék nitrogént. az elemzés elvégzéséhez használt reagenseket. A nitrogéntartalom meghatározása után a megfelelő konverziós tényezővel fehérjetartalommá alakítják át: %Protein = F %N.

6.2.1.4. Előnyök és hátrányok

Előnyök. A Kjeldahl-módszert széles körben használják nemzetközileg, és még mindig a standard módszer az összes többi módszerrel való összehasonlításra. Univerzálissága, nagy pontossága és jó reprodukálhatósága az élelmiszerek fehérjetartalmának becslésének fő módszerévé tették.

Hátrányok. Nem adja meg a valódi fehérje mértékét, mivel az élelmiszerekben található nitrogén nem fehérje formájában van. A különböző fehérjéknek különböző korrekciós faktorokra van szükségük, mert eltérő aminosavszekvenciájúak. A tömény kénsav magas hőmérsékleten történő alkalmazása jelentős veszélyt jelent, akárcsak néhány lehetséges katalizátor használata. A technika végrehajtása időigényes.

6.2.2. Továbbfejlesztett Dumas-módszer

A közelmúltban olyan automatizált műszeres technikát fejlesztettek ki, amely képes az élelmiszerminták fehérjekoncentrációjának gyors mérésére. Ez a technika azon a módszeren alapul, amelyet először egy Dumas nevű tudós írt le több mint másfél évszázaddal ezelőtt. Gyorsasága miatt kezd felvenni a versenyt a Kjeldahl-módszerrel, mint a fehérjék standard elemzési módszerével egyes élelmiszerek esetében.

Az ismert tömegű mintát magas hőmérsékletű (kb. 900 o C-os) kamrában oxigén jelenlétében elégetik. Ez CO 2, H 2 O és N 2 felszabadulásához vezet. A CO 2 és H 2 O eltávolítása úgy történik, hogy a gázokat speciális oszlopokon vezetik át, amelyek elnyelik őket. A nitrogéntartalmat ezután úgy mérik, hogy a maradék gázokat egy olyan oszlopon vezetik át, amelynek a végén hővezetőképesség-érzékelő van. Az oszlop segít elválasztani a nitrogént a maradék CO 2 -tól és H 2 O-tól, amely a gázáramban maradhatott. A műszer kalibrálása tiszta és ismert nitrogénkoncentrációjú anyag, például EDTA (= 9,59% N) elemzésével történik. Így a hővezető képesség detektorból származó jel nitrogéntartalommá alakítható.A Kjeldahl-módszerhez hasonlóan a mintában lévő nitrogénkoncentrációt a fehérjetartalomra kell konvertálni megfelelő konverziós tényezők alkalmazásával, amelyek a fehérje pontos aminosavsorrendjétől függenek.

6.2.2.2. Előnyök és hátrányok

Előnyök: Sokkal gyorsabb, mint a Kjeldahl-módszer (mérésenként 4 perc alatt, míg Kjeldahl esetében 1-2 óra). Nem igényel mérgező vegyszereket vagy katalizátorokat. Számos minta automatikusan mérhető. Könnyen használható.

Hátrányok: Magas kezdeti költség. Nem adja meg a valódi fehérje mértékét, mivel az élelmiszerekben található nitrogén nem fehérje formájában van. A különböző fehérjéknek különböző korrekciós faktorokra van szükségük, mert eltérő aminosavszekvenciájúak. A kis mintaméret megnehezíti a reprezentatív minta előállítását.

6.2.3. UV-látható spektroszkópiát alkalmazó módszerek

A fehérjekoncentráció mérésére számos módszert dolgoztak ki, amelyek UV-látható spektroszkópián alapulnak. Ezek a módszerek vagy a fehérjék természetes képességét használják fel arra, hogy elnyeljék (vagy szórják) a fényt az elektromágneses spektrum UV-sugárzással látható tartományában, vagy kémiailag vagy fizikailag módosítják a fehérjéket, hogy elnyeljék (vagy szórják) a fényt ebben a régióban. Az egyes tesztek alapelve hasonló. Mindenekelőtt egy kalibrációs görbét készítünk az abszorbancia (vagy turbiditás) és a fehérjekoncentráció függvényében ismert koncentrációjú fehérjeoldatok sorozatával. A vizsgált oldat abszorbanciáját (vagy zavarosságát) ezután ugyanazon a hullámhosszon mérjük, és fehérjekoncentrációját a kalibrációs görbéből határozzuk meg. A fő különbség a tesztek között a sugárzás elnyeléséért vagy szóródásáért felelős kémiai csoportok, például peptidkötések, aromás oldalcsoportok, bázikus csoportok és aggregált fehérjék.

Az alábbiakban kiemelünk néhány, az élelmiszerek fehérjetartalmának meghatározására leggyakrabban használt, UV-sugárzással látható módszert:

Közvetlen mérés 280 nm-en

A triptofán és a tirozin 280 nm-en erősen elnyeli az ultraibolya fényt. Számos fehérje triptofán és tirozin tartalma meglehetősen állandó marad, így a fehérjeoldatok 280 nm-en mért abszorbanciája alapján meghatározható a koncentrációjuk. Ennek a módszernek az az előnye, hogy az eljárás egyszerűen végrehajtható, roncsolásmentes, és nincs szükség speciális reagensekre. A fő hátrány az, hogy a nukleinsavak 280 nm-en is erősen abszorbeálnak, és ezért zavarhatják a fehérje mérését, ha elegendő koncentrációban vannak jelen. Ennek ellenére módszereket fejlesztettek ki a probléma megoldására, például az abszorbancia mérésével két különböző hullámhosszon.

Ibolya-lilás szín keletkezik, amikor a rézionok (Cu 2+ ) kölcsönhatásba lépnek a peptidkötésekkel lúgos körülmények között. A biuret reagens, amely az elemzés elvégzéséhez szükséges összes vegyszert tartalmazza, kereskedelmi forgalomban megvásárolható. Összekeverjük egy fehérjeoldattal, majd 15-30 percig állni hagyjuk, mielőtt az abszorbanciát 540 nm-en leolvassuk. Ennek a technikának az a fő előnye, hogy nincs interferencia az alacsonyabb hullámhosszon adszorbeálódó anyagokból, és a technika kevésbé érzékeny a fehérjetípusra, mert a specifikus oldalcsoportok helyett az összes fehérjére jellemző peptidkötéseket tartalmazó abszorpciót alkalmaz. Ugyanakkor viszonylag alacsony érzékenységgel rendelkezik a többi UV-látható módszerhez képest.

A Lowry-módszer a biuret reagenst egy másik reagenssel (Folin-Ciocalteau fenol reagenssel) kombinálja, amely reakcióba lép a fehérjékben lévő tirozin és triptofán maradékokkal. Ez kékes színt ad, amely a szükséges érzékenységtől függően valahol 500-750 nm között olvasható. Van egy 500 nm körüli kis csúcs, amivel nagy fehérjekoncentrációt lehet meghatározni, és egy nagy csúcs 750 nm körül, amivel alacsony fehérjekoncentrációt lehet meghatározni. Ez a módszer érzékenyebb a fehérje alacsony koncentrációjára, mint a biuret módszer.

Egy negatív töltésű (anionos) festék ismert feleslegét adjuk egy olyan fehérjeoldathoz, amelynek pH-ját úgy állítjuk be, hogy a fehérjék pozitív töltésűek legyenek (azaz az izoelektromos pont alatt). A fehérjék oldhatatlan komplexet képeznek a festékkel a molekulák közötti elektrosztatikus vonzás miatt, de a meg nem kötött festék oldható marad. Az anionos festék a bázikus aminosavak kationos csoportjaihoz (hisztidin, arganin és lizin) és a szabad amino-terminális csoportokhoz kötődik. Az oldhatatlan fehérje-festék komplex eltávolítása után (például centrifugálással) az oldatban maradó kötetlen festék mennyiségét az abszorbanciájának mérésével határozzuk meg. Az eredeti oldatban jelenlévő fehérje mennyisége arányos a hozzá kötött festék mennyiségével: festék kötött = festék kezdeti - festékmentes .

Az oldatban normálisan oldódó fehérjemolekulák bizonyos vegyi anyagok, például triklór-ecetsav hozzáadásával kicsaphatók. A fehérjecsapadék hatására az oldat zavarossá válik. Így a fehérje koncentrációja a zavarosság mértékének mérésével határozható meg.

6.2.3.2. Előnyök és hátrányok

Előnyök: Az UV-látható technikák meglehetősen gyorsak és egyszerűen kivitelezhetők, és érzékenyek a fehérje alacsony koncentrációjára.

Hátrányok: A legtöbb UV-sugárzással látható technikához olyan híg és átlátszó oldatokat kell használni, amelyek nem tartalmaznak olyan szennyező anyagokat, amelyek a vizsgált fehérjével azonos hullámhosszon elnyelik vagy szórják a fényt. Az átlátszó megoldások szükségessége azt jelenti, hogy a legtöbb élelmiszeren jelentős mennyiségű minta-előkészítésen kell átesni, mielőtt elemezni lehessen, például homogenizálást, oldószeres extrakciót, centrifugálást, szűrést, ami idő- és munkaigényes lehet. Ezenkívül néha nehéz mennyiségileg kinyerni a fehérjéket bizonyos típusú élelmiszerekből, különösen azután, hogy azokat feldolgozták, így a fehérjék aggregálódnak vagy kovalensen kötődnek más anyagokhoz. Ezenkívül az abszorbancia a vizsgált fehérje típusától függ (a különböző fehérjék eltérő aminosavszekvenciájúak).

6.2.4. Egyéb hangszeres technikák

Az élelmiszer-alapanyagok teljes fehérjetartalmának meghatározására különféle műszeres módszerek széles választéka áll rendelkezésre. Ezek fizikai-kémiai elveik szerint három különböző kategóriába sorolhatók: (i) a tömeges fizikai tulajdonságok mérése, (ii) a sugárzás adszorpciójának mérése és (iii) a sugárzás szórásának mérése. Mindegyik műszeres módszernek megvannak a maga előnyei és hátrányai, valamint az élelmiszerek köre, amelyekre alkalmazható.

Tömeges fizikai tulajdonságok mérése

  • Sűrűség: A fehérje sűrűsége nagyobb, mint a legtöbb más élelmiszer-összetevőé, ezért az élelmiszer sűrűsége nő, ha fehérjetartalma nő. Így az élelmiszerek fehérjetartalma meghatározható sűrűségük mérésével.
  • Törésmutató: A vizes oldat törésmutatója a fehérjekoncentráció növekedésével nő, ezért az RI mérések segítségével meghatározható a fehérjetartalom.

Sugárzás adszorpciójának mérése

  • UV-látható: A fehérjék koncentrációja az ultraibolya-látható sugárzás abszorbanciájának mérésével határozható meg (lásd fent).
  • Infravörös: Infravörös technikák használhatók az élelmiszerminták fehérjekoncentrációjának meghatározására. A fehérjék természetes módon veszik fel az infravörös sugárzást a polipeptid gerinc mentén egyes kémiai csoportok jellegzetes rezgései (nyújtás és hajlítás) következtében. A sugárzás abszorbanciájának bizonyos hullámhosszokon történő mérése így felhasználható a mintában lévő fehérje koncentrációjának számszerűsítésére. Az IR különösen hasznos a fehérjetartalom gyors on-line elemzéséhez. Ezenkívül kevés minta-előkészítést igényel, és roncsolásmentes. Legfőbb hátránya a magas kezdeti költség és az alapos kalibrálás szükségessége.
  • Mágneses magrezonancia: NMR spektroszkópia használható az élelmiszerek teljes fehérjekoncentrációjának meghatározására. A fehérjetartalmat úgy határozzuk meg, hogy megmérjük a fehérjefrakciónak megfelelő NMR kémiai eltolódási spektrumban a csúcs alatti területet.

A sugárzás szórásának mérése

  • Fényszórás: A fehérje-aggregátumok koncentrációja vizes oldatban fényszórási technikákkal határozható meg, mivel az oldat zavarossága egyenesen arányos a jelenlévő aggregátumok koncentrációjával.
  • Ultrahangos szórás: A fehérjeaggregátumok koncentrációja ultrahangos szórási technikákkal is meghatározható, mivel az ultrahang ultrahang sebessége és abszorpciója összefügg a jelenlévő fehérjeaggregátumok koncentrációjával.

6.2.4.2. Előnyök és hátrányok

Számos ilyen műszeres módszer jelentős előnnyel rendelkezik a fent említett többi technikával szemben, mivel roncsolásmentesek, alig vagy egyáltalán nem igényelnek minta-előkészítést, és a mérések gyorsak és pontosak. Az élelmiszerek tömeges fizikai tulajdonságainak mérésén alapuló technikák nagy hátránya, hogy kalibrációs görbét kell készíteni a kérdéses fizikai tulajdonság és a teljes fehérjetartalom között, ami függhet a jelenlévő fehérje típusától és az élelmiszertől. mátrixban található. Ezenkívül a tömeges fizikai-kémiai tulajdonságok mérésén alapuló technikák csak viszonylag egyszerű összetételű élelmiszerek elemzésére használhatók. Egy olyan élelmiszerben, amely sok különböző összetevőt tartalmaz, amelyek koncentrációja változhat, nehéz elválasztani a fehérje hozzájárulását az általános méréshez a többi összetevőtől.

6.2.5. Módszerek összehasonlítása

Élelmiszerkutatóként gyakran kerülhetünk olyan helyzetbe, hogy egy bizonyos technikát kell választanunk egy élelmiszer fehérjekoncentrációjának mérésére. Hogyan dönthetjük el, hogy melyik technika a legmegfelelőbb az adott alkalmazásunkhoz? Az első dolog, amit meg kell határozni, hogy mire használják fel az információt. Ha az elemzést hatósági célokra, például jogi vagy címkézési követelmények miatt kell elvégezni, akkor fontos, hogy hivatalosan elismert módszert alkalmazzunk. A Kjeldahl-módszert, és egyre inkább a Dumas-módszert hivatalosan is engedélyezték az élelmiszeripari alkalmazások széles körében. Ezzel szemben az UV-látható spektroszkópia csak kis számú alkalmazását ismerik el hivatalosan.

Minőségellenőrzési célokra gyakran hasznosabb a fehérjetartalom gyors és egyszerű mérése, ezért az IR technikák a legalkalmasabbak. A laboratóriumi alapvizsgálatokhoz, ahol gyakran tiszta fehérjéket elemeznek, gyakran előnyben részesítik az UV-látható spektroszkópiai technikákat, mivel ezek gyors és megbízható méréseket adnak, és érzékenyek az alacsony fehérjekoncentrációkra.

Egyéb tényezők, amelyeket figyelembe kell venni: a szükséges minta-előkészítés mennyisége, érzékenysége és sebessége. A Kjeldahl-, Dumas- és IR-módszerek nagyon kevés minta-előkészítést igényelnek. Az élelmiszer reprezentatív mintájának kiválasztása után általában közvetlenül tesztelhető. Másrészt a különféle UV-látható módszerek alapos minta-előkészítést igényelnek az elemzés előtt. A fehérjét az élelmiszerből híg átlátszó oldatba kell kivonni, ami általában időigényes homogenizálást, oldószeres extrakciót, szűrést és centrifugálást igényel. Ezenkívül nehéz lehet egyes fehérjéket teljesen elkülöníteni az élelmiszerekből, mert erősen kötődnek más összetevőkhöz. A különböző technikák eltérő érzékenységgel is rendelkeznek, azaz a legalacsonyabb fehérjekoncentrációval rendelkeznek, amelyet kimutathatnak. Az UV-látható módszerek a legérzékenyebbek, már 0,001 tömeg% fehérjekoncentrációt is képesek kimutatni. A Dumas, Kjeldahl és IR módszerek érzékenysége valahol 0,1 tömeg% körül van. Az egy elemzéshez szükséges idő és az egyidejűleg futtatható minták száma szintén fontos tényezők, amelyeket figyelembe kell venni, amikor eldöntjük, melyik analitikai technikát alkalmazzuk. Az IR technikák képesek a fehérjekoncentráció gyors (< 1 perc) elemzésére, miután kalibrálták őket. A modern műszeres Dumas-módszer teljesen automatizált, és kevesebb mint 5 perc alatt képes mérni egy minta fehérjekoncentrációját, szemben a Kjeldahl-módszerrel, amelynek végrehajtása 30 perc és 2 óra között van. A különböző UV-látható módszerek néhány perctől egy óráig terjednek (attól függően, hogy milyen típusú festéket használnak és mennyi ideig tart a reakció), bár megvan az az előnye, hogy sok mintát lehet futtatni egyidejűleg. Mindazonáltal általában az elemzés előtt alapos minta-előkészítést kell végezni, hogy átlátszó megoldást kapjunk. További tényezők, amelyek fontosak lehetnek a megfelelő technika kiválasztásakor: a rendelkezésre álló felszerelés, a könnyű kezelhetőség, a kívánt pontosság, valamint az, hogy a technika roncsolásmentes-e vagy sem.

6.3. Fehérje elválasztása és jellemzése

Az előző előadásban szóba kerültek azok a technikák, amelyek segítségével meghatározható egy élelmiszerben a teljes fehérjekoncentráció. Az élelmiszer-elemzőket gyakran érdekli az élelmiszerben lévő fehérjék típusa is, mivel minden fehérje egyedi táplálkozási és fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik. A fehérjetípust általában úgy határozzák meg, hogy az egyes fehérjéket elválasztják és izolálják egy komplex fehérjekeverékből, hogy utólag azonosíthatók és jellemezhetők legyenek. A fehérjéket fizikai-kémiai tulajdonságaik – például méret, töltés, adszorpciós jellemzők, oldhatóság és hőstabilitás – különbségei alapján választják el. A megfelelő elválasztási technika megválasztása számos tényezőtől függ, beleértve az elemzés elvégzésének okait, a rendelkezésre álló minta mennyiségét, a kívánt tisztaságot, a rendelkezésre álló berendezéseket, a jelenlévő fehérjék típusát és a költségeket. A nagy mennyiségű fehérje nyers izolálására nagy léptékű módszerek állnak rendelkezésre, míg a drágák vagy csak kis mennyiségben elérhető fehérjék esetében kis léptékű módszerek állnak rendelkezésre. Az egyik tényező, amelyet figyelembe kell venni az elválasztási eljárás során, az a lehetőség, hogy a fehérjemolekulák natív háromdimenziós szerkezete megváltozhat.

A környezeti feltételek fehérjeszerkezetre és kölcsönhatásokra gyakorolt ​​hatásának előzetes ismerete rendkívül hasznos a legmegfelelőbb elválasztási technika kiválasztásánál. Egyrészt azért, mert segít meghatározni a legmegfelelőbb körülményeket egy adott fehérje izolálásához fehérjék keverékéből (pl. pH, ionerősség, oldószer, hőmérséklet stb.), másrészt azért, mert fontos lehet olyan körülmények kiválasztása, amelyek nem befolyásolja hátrányosan a fehérjék molekuláris szerkezetét.

6.3.1. Különböző oldhatósági jellemzőkön alapuló módszerek

A fehérjék elkülöníthetők a vizes oldatokban való oldhatóságuk különbségeinek kihasználásával. A fehérjemolekula oldhatóságát az aminosav-szekvenciája határozza meg, mert ez határozza meg méretét, alakját, hidrofób jellegét és elektromos töltését. A fehérjék szelektíven kicsaphatók vagy szolubilizálhatók az oldat pH-jának, ionerősségének, dielektromos állandójának vagy hőmérsékletének megváltoztatásával. Ezeket az elválasztási technikákat a legegyszerűbb alkalmazni, ha nagy mennyiségű mintáról van szó, mivel viszonylag gyorsak, olcsók és nincsenek különösebben befolyásolva más élelmiszer-összetevők. Gyakran használják minden elválasztási eljárás első lépéseként, mivel a szennyező anyagok többsége könnyen eltávolítható.

A fehérjék kicsapódnak vizes oldatokból, amikor a sókoncentráció meghaladja a kritikus szintet, amit kisózásnak neveznek, mivel az összes víz a sókhoz "kötődik", és ezért nem áll rendelkezésre a fehérjék hidratálásához. Az ammónium-szulfátot [(NH 4 ) 2 SO 4 ] gyakran használják, mert vízben jól oldódik, bár más semleges sók is használhatók, például NaCl vagy KCl. Általában kétlépéses eljárást alkalmaznak az elválasztás hatékonyságának maximalizálására. Az első lépésben a sót a kívánt fehérje kicsapásához szükséges koncentráció alatti koncentrációban adjuk hozzá. Az oldatot ezután centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a kérdéses fehérjénél kevésbé oldódó fehérjéket. A sókoncentrációt ezután a fehérje kicsapódásához szükséges szint fölé emeljük. Ez kicsapja a kívánt fehérjét (amely centrifugálással elválasztható), de oldhatóbb fehérjék maradnak az oldatban. Ezzel a módszerrel a fő probléma az, hogy nagy koncentrációjú só szennyezi az oldatot, amelyet el kell távolítani, mielőtt a fehérje újraoldódhatna, például dialízissel vagy ultraszűréssel.

A fehérje izoelektromos pontja (pI) az a pH, ahol a fehérje nettó töltése nulla. A fehérjék hajlamosak aggregálódni és kicsapódni a pI értékükön, mivel nincs elektrosztatikus taszítás, amely távol tartja őket egymástól. A fehérjék különböző izoelektromos pontokkal rendelkeznek az eltérő aminosav-szekvenciák (azaz az anionos és kationos csoportok relatív száma) miatt, így az oldat pH-jának beállításával szétválaszthatók. Amikor a pH-t egy adott fehérje pI értékére állítjuk, kicsapódik, és a többi fehérjét oldatban hagyjuk.

Egy fehérje oldhatósága az őt körülvevő oldat dielektromos állandójától függ, mert ez megváltoztatja a töltött csoportok közötti elektrosztatikus kölcsönhatások nagyságát. Az oldat dielektromos állandójának csökkenésével a töltött részecskék közötti elektrosztatikus kölcsönhatások nagysága nő. Ez csökkenti a fehérjék oldhatóságát az oldatban, mert kevésbé ionizáltak, és ezért a köztük lévő elektrosztatikus taszítás nem elegendő ahhoz, hogy megakadályozza az aggregációt. A vizes oldatok dielektromos állandója vízoldható szerves oldószerek, például etanol vagy aceton hozzáadásával csökkenthető. A kicsapódáshoz szükséges szerves oldószer mennyisége a fehérjétől függ, ezért a fehérjék ez alapján választhatók szét. A fehérje kicsapásához szükséges szerves oldószer optimális mennyisége körülbelül 5-60%. Az oldószeres frakcionálást általában 0 o C-on vagy az alatt végezzük, hogy megakadályozzuk a szerves oldószerek vízzel való keverésekor fellépő hőmérséklet-emelkedés okozta fehérjedenaturációt.

A szennyező fehérjék denaturálása

Sok fehérje denaturálódik és kicsapódik az oldatból, ha egy bizonyos hőmérséklet fölé melegítik, vagy ha az oldatot erősen savas vagy lúgos pH-ra állítják. A magas hőmérsékleten vagy szélsőséges pH-értéken stabil fehérjék ezzel a technikával a legkönnyebben elválaszthatók, mivel a szennyező fehérjék kicsapódnak, miközben a kérdéses fehérje oldatban marad.

6.3.2. Elválasztás az eltérő adszorpciós jellemzők miatt

Az adszorpciós kromatográfia magában foglalja a vegyületek szelektív adszorpciós-deszorpciós elválasztását szilárd mátrixon, amely egy oszlopban van, amelyen a keverék áthalad. Az elválasztás a különböző fehérjék szilárd mátrixhoz való eltérő affinitásán alapul. Az affinitási és ioncserélő kromatográfia a fehérjék elválasztására általánosan használt adszorpciós kromatográfia két fő típusa. Az elválasztás történhet nyitott oszlopon vagy nagynyomású folyadékkromatográfiával.

Ioncserélő kromatográfia

Az ioncserélő kromatográfia az oldatban lévő ionok reverzibilis adszorpcióján-deszorpcióján alapul egy töltött szilárd mátrixhoz vagy polimer hálózathoz. Ez a technika a leggyakrabban használt kromatográfiás technika a fehérjeelválasztásra. A pozitív töltésű mátrixot anioncserélőnek nevezzük, mert megköti a negatív töltésű ionokat (anionokat). A negatív töltésű mátrixot cat ioncserélőnek nevezik, mert megköti a pozitív töltésű ionokat (kationokat). A pufferkörülményeket (pH és ionerősség) úgy állítjuk be, hogy a kérdéses fehérje maximálisan kötődjön az ioncserélő oszlophoz. A szennyező fehérjék kevésbé kötődnek, ezért gyorsabban haladnak át az oszlopon. A kívánt fehérjét ezután egy másik pufferoldattal eluáljuk, amely elősegíti annak deszorpcióját az oszlopról (például eltérő pH-érték vagy ionerősség).

Az affinitáskromatográfia álló fázist használ, amely szilárd hordozóhoz kovalensen kötött ligandumból áll. A ligandum egy olyan molekula, amely rendkívül specifikus és egyedi reverzibilis affinitással rendelkezik egy adott fehérjéhez. Az elemezni kívánt mintát átengedik az oszlopon, és a kérdéses fehérje a ligandumhoz kötődik, míg a szennyező fehérjék közvetlenül áthaladnak rajta. A kívánt fehérjét ezután pufferoldattal eluáljuk, amely elősegíti annak deszorpcióját az oszlopról. Ez a technika a leghatékonyabb módja egy egyedi fehérje elválasztásának a fehérjék keverékétől, de ez a legdrágább, mivel speciális ligandumokat tartalmazó oszlopokra van szükség.

Mind az ioncserélő, mind az affinitáskromatográfiát általánosan alkalmazzák a fehérjék és aminosavak laboratóriumi elkülönítésére. Ritkábban használják őket kereskedelmi szétválasztásra, mivel nem alkalmasak nagy térfogatok gyors leválasztására, és viszonylag drágák.

6.3.3. Elválasztás a méretkülönbségek miatt

A fehérjék méretük szerint is szétválaszthatók. A fehérjék molekulatömege jellemzően körülbelül 10 000 és 1 000 000 dalton között változik. A gyakorlatban az elválasztás a fehérje Stokes sugarától függ, nem pedig közvetlenül a molekulatömegétől. A Stokes-sugár az az átlagos sugár, amellyel egy fehérje oldatban van, és a háromdimenziós molekulaszerkezetétől függ. Azonos molekulatömegű fehérjék esetében a Stokes-sugár a következő sorrendben növekszik: kompakt globuláris fehérje < rugalmas véletlenszerű tekercs < rúdszerű fehérje.

A dialízist az oldatban lévő molekulák szétválasztására használják féligáteresztő membránok segítségével, amelyek lehetővé teszik bizonyos méretnél kisebb molekulák áthaladását, de megakadályozzák a nagyobb molekulák átjutását. A fehérjeoldatot dializáló csőbe helyezzük, amelyet lezárunk, és nagy mennyiségű vízbe vagy pufferbe helyezzük, amelyet lassan keverünk. A kis molekulatömegű oldott anyagok átfolynak a tasakon, de a nagy molekulatömegű fehérjemolekulák a zsákban maradnak. A dialízis viszonylag lassú módszer, akár 12 órát is igénybe vehet. Ezért a leggyakrabban a laboratóriumban használják. A dialízist gyakran használják a só eltávolítására a fehérjeoldatokból, miután azokat kisózással elválasztották, és a pufferek megváltoztatására.

A fehérje oldatát féligáteresztő membránt tartalmazó sejtbe helyezzük, és nyomást alkalmazunk. A kisebb molekulák áthaladnak a membránon, míg a nagyobb molekulák az oldatban maradnak. Ennek a technikának az elválasztási elve ezért hasonló a dialízishez, de mivel nyomást alkalmaznak, az elválasztás sokkal gyorsabb. Körülbelül 500 és 300 000 közötti vágási pontokkal félig áteresztő membránok állnak rendelkezésre. Az oldatnak azt a részét, amelyet a sejt visszatart (nagy molekulák), retentátumnak nevezzük, míg a membránon áthaladó rész (kis molekulák) az ultrafiltrátum részét képezi. Az ultraszűréssel fehérjeoldatokat koncentrálhatunk, sókat távolíthatunk el, puffereket cserélhetünk, vagy fehérjéket méretük alapján frakcionálhatunk. Az ultraszűrő egységeket laboratóriumban és kereskedelmi méretekben használják.

Méretkizárásos kromatográfia

Ez a technika, amelyet néha gélszűrésnek is neveznek, a fehérjéket méretük szerint is szétválasztja. A fehérjeoldatot egy oszlopba öntjük, amely térhálósított polimer anyagból (például dextránból vagy agarózból) készült porózus gyöngyökkel van megtöltve. A gyöngyökben lévő pórusoknál nagyobb molekulák ki vannak zárva, és gyorsan mozognak az oszlopon, míg a pórusokba belépő molekulák mozgása lelassul. Így a molekulák a méret csökkenésének sorrendjében eluálódnak az oszlopról. Különböző átlagos pórusméretű gyöngyök állnak rendelkezésre a különböző molekulatömegű fehérjék elválasztására. A gyöngyök gyártói tájékoztatást adnak arról, hogy melyik molekulatömeg-tartományban a legalkalmasabbak az elválasztásra. Az ismeretlen fehérjék molekulatömege meghatározható Vo elúciós térfogatuk összehasonlításával az ismert molekulatömegű fehérjékkel meghatározottakkal: az elúciós térfogat logaritmus (molekulatömeg) függvényében ábrázolt diagramnak egyenes vonalat kell adnia. Az egyik probléma ezzel a módszerrel, hogy a molekulatömeg nincs közvetlenül összefüggésben a Stokes-sugárral a különböző alakú fehérjék esetében.

6.3.4. Elválasztás elektroforézissel

Az elektroforézis a töltött molekulák vándorlásának különbségén alapul az oldatban, amikor elektromos mezőt alkalmazunk. Használható fehérjék szétválasztására méretük, alakjuk vagy töltésük alapján.

A nem denaturáló elektroforézis során a natív fehérjék pufferolt oldatát porózus gélre (általában poliakrilamid, keményítő vagy agaróz) öntik, és a gélen feszültséget kapcsolnak. A fehérjék a töltésük előjelétől függő irányban mozognak a gélen keresztül, és olyan sebességgel, amely a töltés nagyságától és a mozgásuk súrlódásától függ:

A fehérjék izoelektromos pontjaiktól (pI) és az oldat pH-jától függően lehetnek pozitív vagy negatív töltésűek az oldatban. Egy fehérje negatív töltésű, ha a pH a pI felett van, és pozitív töltésű, ha a pH a pI alatt van. A töltés nagysága és az alkalmazott feszültség határozza meg, hogy egy bizonyos idő alatt milyen messzire vándorolnak a fehérjék. Minél nagyobb a feszültség vagy minél nagyobb a töltés a fehérjén, annál tovább fog mozogni. A molekula súrlódása a gélen való mozgással szembeni ellenállásának mértéke, és nagymértékben meghatározza a molekula effektív mérete és a gél pórusainak mérete közötti kapcsolat. Minél kisebb a molekula mérete, vagy minél nagyobbak a pórusok a gélben, annál kisebb az ellenállás, így a molekula annál gyorsabban mozog a gélen. Különböző porozitású géleket vegyszer beszállítóktól vásárolhat, vagy laboratóriumban készítheti elő. Kisebb pórusméretet kapunk, ha nagyobb koncentrációjú térhálósító reagenst használunk a gél kialakításához. A gélek két párhuzamos lemez között vagy hengeres csövekben lehetnek. A nem denaturáló elektroforézis során a natív fehérjéket töltésük, méretük és alakjuk kombinációja alapján választják el.

A denaturáló elektroforézis során a fehérjéket elsősorban molekulatömegük alapján választják el. A fehérjéket az elemzés előtt denaturálják úgy, hogy összekeverik merkaptoetanollal, amely lebontja a diszulfidkötéseket, és nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS), amely egy anionos felületaktív anyag, amely hidrofób módon kötődik a fehérjemolekulákhoz, és a negatív töltésű felületaktív anyagok közötti taszítás miatt kibontakozik. fej-csoportok. Mindegyik fehérjemolekula megközelítőleg ugyanannyi SDS-t köt meg egységnyi hosszonként. Ezért az egységnyi hosszra eső töltés és a molekuláris konformáció megközelítőleg hasonló minden fehérje esetében. Ahogy a fehérjék egy gélhálózaton haladnak keresztül, elsősorban molekulatömegük alapján különülnek el, mert mozgásuk a fehérjemolekula méretétől függ a gél pórusainak méretétől: a kisebb fehérjék gyorsabban mozognak a mátrixon, mint a nagyobbak. molekulák. Az ilyen típusú elektroforézist általában nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézisnek vagy SDS-PAGE-nak nevezik.

Annak meghatározására, hogy a fehérjék milyen messzire mozdultak el, nyomkövető festéket adnak a fehérjeoldathoz, például brómfenolkéket. Ez a festék egy kis töltésű molekula, amely a fehérjék előtt vándorol. Az elektroforézis befejezése után a fehérjék láthatóvá válnak, ha a gélt fehérjefestékkel, például Coomassie Brilliant Blue-val vagy ezüstfestékkel kezelik. Az egyes fehérjesávok relatív mobilitását kiszámítjuk:

Az elektroforézist gyakran használják élelmiszerek fehérje összetételének meghatározására. A fehérjét az élelmiszerből oldatba vonják ki, majd elektroforézissel elválasztják. Az SDS-PAGE-t egy fehérje molekulatömegének meghatározására használják R m mérésével, majd összehasonlítják egy ismert molekulatömegű fehérjék felhasználásával előállított kalibrációs görbével: a log (molekulatömeg) és a relatív mobilitás görbéje általában lineáris. A denaturáló elektroforézis hasznosabb a molekulatömeg meghatározására, mint a nem-denaturáló elektroforézis, mivel a mozgáshoz való súrlódás nem függ a fehérjemolekulák alakjától vagy eredeti töltésétől.

Izoelektromos fókuszáló elektroforézis

Ez a technika az elektroforézis módosítása, amelyben a fehérjéket töltéssel választják el egy gélmátrixon, amelyen pH-gradiens van. A fehérjék arra a helyre vándorolnak, ahol a pH megegyezik az izoelektromos pontjukkal, majd leállnak, mert már nem töltődnek. Ez a módszer az egyik legnagyobb felbontású a fehérjék elválasztására használt összes technika közül. Léteznek olyan gélek, amelyek szűk pH-tartományt (2-3 egység) vagy széles pH-tartományt (3-10 egység) fednek le, ezért olyan gélt kell kiválasztani, amely a legmegfelelőbb az elválasztandó fehérjékhez.

Kétdimenziós elektroforézis

Az izoelektromos fókuszálás és az SDS-PAGE együtt használhatók a komplex fehérjekeverékek felbontásának javítására. A fehérjéket izoelektromos fókuszálással töltés alapján egy irányban, majd SDS-PAGE-val méret alapján merőlegesen választjuk el.


F4. Hidrofób kölcsönhatások: Bevezetés

  • Közreműködött Henry Jakubowski
  • professzor (kémia) a College of St. Benedict/St. János Egyetem

Vizsgáltuk a hidrofób hatás (beleértve a ketrecbe zárt vízmolekulák kedvező entrópikus felszabadulását az oldószernek kitett hidrofób csoportokról) szerepét a micellák és a kettős réteg kialakulásában. Ez is elősegíti a fehérje feltekeredését? Ennek a kérdésnek a feltárása érdekében megvizsgáljuk a kis nempoláris molekulák, különösen a benzol termodinamikáját vízzel, és megkérdezzük, hogy a benzol oldhatóságával kapcsolatos termodinamikai paraméterek hasonlóak-e a fehérje stabilitásához kapcsolódó paraméterekhez. Ha ez az analógia igaz, akkor bármi, ami elősegíti a benzol oldhatóságát, megnövekedett hidrofób aminosav-oldallánc-expozícióhoz vezet, és így fehérje denaturálódik. Milyen bizonyítékok támasztják alá ezt?

a. kristályszerkezetek: Ezek a struktúrák azt mutatják, hogy a legtöbb nem poláris oldallánc egy fehérje belsejében van eltemetve, amely szorosan van csomagolva, és amely kizárja a vizet. A vizsgálatok azt mutatják, hogy az aminosav-oldalláncok felületének növekedésével az aminosavak vízből etanolba történő átvitelének szabad energiája negatívabbá válik.

ábra: Aminosavak átvitele vízből

(Tekintse át a hidrofób csoportok átvitelének szabad energiáit az 1D fejezetben: Lipidek a vízben - Termodinamika.)

b. fehérjék alacsony hőmérsékletű denaturációja – Megfigyelték, hogy a fehérjék alacsony hőmérsékleten (0oC-nál alacsonyabb hőmérsékleten) denaturálódhatnak, ami arra utal, hogy a nem poláris maradékok alacsony hőmérsékleten vízben jobban "oldékonyabbá válnak (azaz a fehérje hidrofóbabb belsejéből a vízben jobban oldódnak) poláris kívül). Hasonlítsa össze a nem poláris gázok, például CO2 vagy N2 oldhatóságát, amelyek alacsony hőmérsékleten jobban oldódnak. Ahogy a nem poláris gázok vízben lévő oldatait melegíti, a gázok kevésbé oldódnak, amit a buborékképződés bizonyít (azaz az oldott gázok fázisszétválasztása, ahogy oldhatatlanabbá válnak). Ha a fehérjék viselkedését ugyanez a viselkedés szabályozza (a nempoláris csoportok nagyobb oldhatósága alacsony hőmérsékleten), ez arra utalhat, hogy a fehérjék alacsony hőmérsékleten denaturálódhatnak (ami a nempoláris oldalláncok fokozott vízterheléséhez vezet). Ezt a jelenséget megfigyelték.

c. a különböző sófajták által befolyásolt fehérjestabilitás - Több mint 100 évvel ezelőtt a Hofmeister meghatározta a sók különböző kationjainak és anionjainak hatékonyságát a vérszérum fehérjék kicsapásában a 0,01-1 M koncentráció tartományban. A sorozat az alábbiakban látható:

NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > guanidinium

SO42- > HPO42- > acetát > citrát > Cl- > NO3- > ClO3- > I- > ClO4- > SCN-

  • A sorozat első ionpárjaiból származó só (például (NH4)2SO4) fehérjék vizes oldataihoz adva kicsapja a fehérje natív formáját. Számolnunk kell azzal a ténnyel, hogy kicsapja a fehérjét, és hogy a fehérje natív, nem denaturált állapotban válik ki. Bővebben arról, hogy miért csapja ki egy pillanat alatt a fehérjéket. Az egyes sorozatok első ionja növeli a víz felületi feszültségét (nehezíti a nem poláris molekulához illeszkedő üreg kialakítását a vízben). Ez csökkenti a nem poláris molekulák oldhatóságát. Ezek a "kisózók" nem poláris molekulák, amelyek nem a vízben való oldódást, hanem az aggregációt, majd a fázisszétválást segítik elő. Analógia útján stabilizálni fogják a natív állapotot, mivel az eltemetett hidrofób oldalláncok csökkent hajlamot mutatnak a vizes környezetbe való kimozdulásra.
  • A sorozat utolsó ionjai kevésbé befolyásolják a felületi feszültséget, és ezáltal növelik a nempoláris molekulák oldhatóságát ("só-in"). Analógia útján destabilizálják a natív állapotot, mivel az eltemetett hidrofób oldalláncok fokozottan hajlamosak kimozdulni a vizes környezetbe.
  • Hofmeister sorozat

A benzol oldhatósága ennek a sorozatnak a vizes sóoldataiban balról jobbra növekszik, ahogy a natív fehérje stabilitása balról jobbra csökken (azaz a fehérje nempoláris magmaradékai vízben jobban "oldhatóbbá" válnak, ami denaturálódik.

d. a hidrofób magmaradékok konzerválása – Ezek a maradékok erősen konzerváltak és korrelálnak a szerkezettel.

e. A karbamid denaturálja a fehérjéket – Egy másik adalékanyagot, a karbamidot, gyakran használják nagy koncentrációban a fehérjék denaturálására. Az emberek azt hitték, hogy a karbamid verseng a láncon belüli H-kötésekkel, és így feloldja a fehérjét. A fenti H-kötésekkel kapcsolatos érvek vitatják ezt az állítást, mivel a víznek ekkor denaturálnia kell a fehérjét. Hogyan denaturálja a karbamid fehérjéket? Kimutatták, hogy a nem poláris aminosavak 8 M karbamidba történő átvitelének szabad energiája egyre negatívabbá válik, ahogy az oldalláncok nagyobbak és apolárisabbak lesznek.

Ábra: A nem poláris aminosavak 8 M karbamidba történő átvitelének szabad energiája

Ez igaz a guanidin-hidrokloridos denaturációra is. A karbamid a felületükkel arányosan növeli a nem poláris molekulák oldhatóságát is.


A mosószer fizikai jellemzői

Az a koncentráció, amelynél a micellák kialakulni kezdenek, az kritikus micellakoncentráció (CMC). A CMC a monomer maximális koncentrációja, és a micellaképződés szabad energiájának mértéke. Minél alacsonyabb a CMC, annál stabilabb a micella, és annál lassabban épülnek be a molekulák a micellába, illetve annál lassabban távolodnak el onnan. A detergens hidrofób régiójának szerkezete befolyásolhatja a micella szerkezetét. Az ionos detergensek hidrofób szénhidrogénláncának hosszának növekedése megnövekedett micellaméretet és alacsonyabb CMC-t eredményez, mivel kevesebb molekulára van szükség egy micella felépítéséhez.

A monomerek átlagos száma egy micellában a összesítési szám. A CMC és az aggregációs szám értékei nagymértékben függnek olyan tényezőktől, mint a hőmérséklet, pH, ionerősség, valamint a mosószer homogenitása és tisztasága. A CMC és az aggregációs szám jelentett értékeinek enyhe eltérései az értékek meghatározásához használt analitikai módszerek eltéréseiből adódhatnak. Az aggregációs számértékeket a koncentráció is eltolja, mivel a micellánkénti detergens molekulák száma növekedhet, ha a koncentráció a CMC felett van.

A könnyű eltávolítás vagy csere fontos tényező a mosószer kiválasztásánál. Néhány gyakoribb mosószer eltávolítási módszer:

  • Dialízis
  • Gélszűrős kromatográfia
  • Hidrofób adszorpciós kromatográfia
  • Fehérje kicsapódás

A mosószerhez tartozó CMC-érték hasznos útmutatás a hidrofób kötési erősséghez. A magasabb CMC-értékkel rendelkező detergensek gyengébb kötődésűek, és ezt követően könnyebben eltávolíthatók dialízissel vagy kiszorítási módszerekkel. Az alacsony CMC-értékű detergensekhez kevesebb detergens szükséges a micellák képzéséhez és a fehérjék vagy lipidek oldódásához.

Egy másik hasznos paraméter a későbbi eltávolításhoz szükséges mosószerek értékelésénél a micella molekulatömeg, ami a relatív micellaméretet jelzi. A kisebb micellák könnyebben eltávolíthatók, és általában kívánatosak, ha a fehérje-detergens komplexeket a fehérje molekulamérete alapján kell elválasztani. A micella molekulatömege úgy számítható ki, hogy az aggregációs számot megszorozzuk a monomer molekulatömegével.

Az felhő pont az a hőmérséklet, amelyen a detergens oldat a CMC-hez közeli vagy felette két fázisra válik szét. A micellák aggregálódnak, jellemzően magas mosószer-koncentrációjú zavaros fázist alkotnak, miközben az oldat egyensúlya kimerül. A kapott kétfázisú oldat szétválasztható, az extrahált fehérje a detergensben gazdag fázisban helyezkedik el. Alacsony zavarosodási hőmérsékletű tisztítószerek, mint például a TRITON® X-114 (felhősödési pont

23 °C) ajánlott fehérjékkel való használatra, mivel a magas zavarosodási pont hőmérséklet denaturálhatja a szolubilizált fehérjéket. A zavarosodási pontot befolyásolhatják a mosószer-koncentráció, a hőmérséklet változásai, valamint a só vagy polimerek, például dextrán és polietilénglikol hozzáadása. Vegye figyelembe, hogy a mosószerben gazdag fázis az adott mosószer(ek)től és a sókoncentrációtól is függ bizonyos körülmények között, a fázis inkább átlátszó lehet, mint zavaros, és az oldat felső vagy alsó fázisaként helyezkedik el. A nemionos detergenseknél ezt a viselkedést alkalmazták a membránfehérjék fázisszétválasztásában és tisztításában. 2


Chaperonok és/vagy foldázok koexpressziója.

A fehérjék két osztálya játszik fontos szerepet in vivo fehérje hajtogatás.

  • Molekuláris chaperonok elősegítik a megfelelő izomerizációt és a sejtcélzást azáltal, hogy átmenetileg kölcsönhatásba lépnek a felhajtható intermedierekkel. A legjobban jellemezhető E. coli rendszerek a következők:
    • GroES-GroEL
    • DnaK-DnaJ-GrpE
    • ClpB
    • peptidil-prolil cisz/transz izomerázok (PPI's)
    • diszulfid-oxidoreduktáz (DsbA) és diszulfid izomeráz (DsbC)
    • fehérje-diszulfid izomeráz (PDI) - egy eukarióta fehérje, amely a fehérje cisztein oxidációját és a diszulfid kötés izomerizációját egyaránt katalizálja. Emellett kísérői tevékenységet is végez.

    Ezen fehérjék közül egy vagy több együttes expressziója a célfehérjével az oldható fehérje magasabb szintjéhez vezethet. A különböző chaperonok/foldázok koexpressziós szintjét minden egyes esetre optimalizálni kell. DsbA és DsbC fúziós partnerként használva is pozitív hatást mutattak az expressziós szintekre.


    A hidrofób hatás és szerepe a hidegdenaturációban ☆

    A hidrofób hatást tekintik a fehérje feltekeredésének fő hajtóerejének, és fontos szerepet játszik ezen biomolekulák stabilitásában. Ennek a hatásnak tulajdonítható a hidegdenaturáció is, ahol a fehérje natív állapota a lehűlés hatására elveszti stabilitását. Ezért nem meglepő, hogy sok erőfeszítést fordítottak ennek a jelenségnek a megértésére. Ezen erőfeszítések ellenére sok alapvető szempont maradt még megoldatlan. Ebben a cikkben áttekintjük és összefoglaljuk a fehérjék termodinamikáját, a hidrofób hatást és a hidegdenaturációt. Kezdjük e jelenségek makroszkopikus számbavételével, majd térjünk át atomi szintű leírásukra. Reméljük, hogy ez az áttekintés segít az olvasónak betekintést nyerni a hidrofób hatás szerepébe a hideg denaturációban.


    Tartalom

    Számos orvosi eszköz és termék érintkezik a test belső felületeivel, például sebészeti eszközök és implantátumok. Amikor egy nem natív anyag belép a szervezetbe, az immunválasz első lépése megtörténik, és a gazdaszervezet extracelluláris mátrixa és plazmafehérje aggregálódik az anyaghoz, hogy megkísérelje visszatartani, semlegesíteni vagy elzárni a károsítót. [1] Ezek a fehérjék elősegíthetik különböző sejttípusok, például oszteoblasztok és fibroblasztok kötődését, amelyek elősegíthetik a szövetek helyreállítását. [2] Ezt egy lépéssel továbbvisszük, a beültethető eszközöket be lehet vonni egy bioaktív anyaggal, amely elősegíti a specifikus fehérjék adszorpcióját, a rostos kapszula kialakulását és a sebgyógyulást. Ez csökkentené az implantátum kilökődésének kockázatát és felgyorsítaná a felépülést azáltal, hogy kiválasztják az endothelizációhoz szükséges fehérjéket és sejteket. Az endotélium kialakulása után a szervezet többé nem lesz kitéve az idegen anyagnak, és leállítja az immunválaszt.

    A fehérjék, például a kollagén vagy a fibrin gyakran szolgálnak a sejtadhézió és a sejtnövekedés vázaként. Ez szerves részét képezi a sejtlapok szerkezeti integritásának és azok összetettebb szöveti és szervi struktúrákká történő differenciálódásának. A fehérjék nem biológiai felületekhez való adhéziós tulajdonságai nagymértékben befolyásolják, hogy a sejtek kötődhetnek-e közvetve az állványokon keresztül. Az olyan implantátum, mint a csípőszár pótlása, szükségessé teszi a gazdaszövetekkel való integrációt, és a fehérje adszorpciója megkönnyíti ezt az integrációt.

    A sebészeti eszközöket úgy lehet megtervezni, hogy könnyebben sterilizálhatók legyenek, így a fehérjék nem maradnak adszorbeálva a felületen, ami keresztszennyeződést kockáztat. Egyes betegségeket, például a Creutzfeldt–Jakob-kórt és a kurut (mindkettő a kergemarhakórhoz kapcsolódik) a prionok átvitele okozza, amelyek egy normálisan natív fehérje tévedés vagy nem megfelelően hajtogatott formái. A prionokkal szennyezett sebészeti eszközök speciális sterilizálási módszert igényelnek, hogy a hibásan hajtogatott fehérje minden nyomelemét teljesen kiirtsák, mivel ellenállnak számos, általában használt tisztítási módszernek.

    Bizonyos esetekben azonban a fehérjék bioanyagokhoz való adszorpciója rendkívül kedvezőtlen esemény lehet. A véralvadási faktorok összetapadása trombózist válthat ki, ami stroke-hoz vagy egyéb elzáródásokhoz vezethet. [3] Egyes eszközöket a test belső környezetével való kölcsönhatásra terveznek, mint például az érzékelők vagy a gyógyszerszállító hordozók, és a fehérje adszorpciója akadályozná hatékonyságukat.

    A fehérjék olyan biomolekulák, amelyek aminosav alegységekből állnak. Minden aminosavnak van egy oldallánca, amely a környező környezet pH-jától, valamint saját egyéni poláris/nempoláris tulajdonságaitól függően töltést nyer vagy veszít. [4]

    A töltött régiók nagymértékben hozzájárulhatnak ahhoz, hogy ez a fehérje hogyan lép kölcsönhatásba más molekulákkal és felületekkel, valamint saját harmadlagos szerkezetéhez (proteinfolding). Hidrofilitásuk következtében a töltött aminosavak általában a fehérjék külsején helyezkednek el, ahol képesek kölcsönhatásba lépni a felületekkel. [5] Az aminosavak egyedülálló kombinációja adja a fehérjék tulajdonságait. A felületi kémia szempontjából a fehérje adszorpciója kritikus jelenség, amely leírja ezeknek a molekuláknak az anyag külső felületén történő aggregációját. Az, hogy a fehérjék a felülethez kötve maradnak, nagymértékben függ az anyag tulajdonságaitól, például a felületi energiától, a textúrától és a relatív töltéseloszlástól. A nagyobb fehérjék nagyobb valószínűséggel adszorbeálódnak és kötődnek a felülethez, mivel az aminosavak és a felület között több érintkezési hely található (1. ábra).

    A fehérje adszorpció energiája Szerkesztés

    A spontán fehérjeadszorpció mögött meghúzódó alapötlet az, hogy az adszorpció akkor következik be, amikor a szabadenergia Gibbs-törvénye szerint több energia szabadul fel, mint amennyi nyer.

    Ez látható az egyenletben:

    • hirdetéseket a paraméterek nettó változása
    • G Gibbs szabad energia
    • T a hőmérséklet (SI mértékegysége: kelvin)
    • S az entrópia (SI mértékegysége: joule per kelvin)
    • H az entalpia (SI mértékegysége: joule)

    Annak érdekében, hogy a fehérje adszorpciója spontán történjen, hirdetéseketG negatív számnak kell lennie.

    Vroman Effect Edit

    A fehérjék és más molekulák folyamatosan versengenek egymással a felület kötőhelyei miatt. A Leo Vroman által kifejlesztett Vroman-effektus azt feltételezi, hogy a kicsi és bőséges molekulák lesznek az elsők, amelyek bevonják a felületet. Idővel azonban az adott felülethez nagyobb affinitású molekulák helyettesítik őket. Ez gyakran megfigyelhető a vérrel érintkező anyagoknál, ahol a rendszerint bőséges fibrin először kötődik a felülethez, és idővel nagyobb fehérjék váltják fel. [6]

    Adszorpciós sebesség Szerkesztés

    Ahhoz, hogy a fehérjék adszorbeálódjanak, először érintkezésbe kell kerülniük a felülettel egy vagy több fő transzportmechanizmuson keresztül: diffúzió, termikus konvekció, tömegáramlás vagy ezek kombinációja. A fehérjék transzportjának vizsgálatakor egyértelmű, hogy a koncentráció gradiensek, a hőmérséklet, a fehérje mérete és az áramlási sebesség hogyan befolyásolja a fehérjék szilárd felületre érkezését. Alacsony áramlási és minimális hőmérsékleti gradiens mellett az adszorpciós sebesség a diffúziós sebesség egyenlet alapján modellezhető. [5]

    Diffúziós sebesség egyenlet Szerkesztés

    • D a diffúziós együttható
    • n a fehérje felületi koncentrációja
    • Co a fehérjék tömeges koncentrációja
    • t az idő

    A nagyobb tömegkoncentráció és/vagy magasabb diffúziós együttható (a molekulamérettel fordítottan arányos) azt eredményezi, hogy nagyobb számú molekula érkezik a felszínre. Az ebből eredő fehérjefelületi kölcsönhatások az adszorbeált fehérje magas lokális koncentrációját eredményezik, amely akár 1000-szer magasabb koncentrációt is elérhet, mint az ömlesztett oldatban. [5] A test azonban sokkal összetettebb, áramlást és konvektív diffúziót tartalmaz, és ezeket figyelembe kell venni a fehérje adszorpciójának sebességénél.

    Flow egy vékony csatornában Szerkesztés

    • C a koncentráció
    • D a diffúziós együttható
    • V az áramlás sebessége
    • x a távolság a csatornán
    • γ a fal nyírási sebessége
    • b a csatorna magassága

    Ez az [5] egyenlet különösen alkalmazható az artériákban, pl. sztentek.

    Az erők és kölcsönhatások négy alapvető osztálya a fehérje adszorpciójában: 1) ionos vagy elektrosztatikus kölcsönhatás, 2) hidrogénkötés, 3) hidrofób kölcsönhatás (nagyrészt entropikusan vezérelve) és 4) töltés-transzfer vagy részecske-elektron donor/akceptor típusú kölcsönhatás. . [7]

    Ionos vagy elektrosztatikus kölcsönhatások szerkesztése

    A fehérjék töltését az aminosav-oldalláncok, valamint a terminális aminosav és a karbonsav pKa-értéke határozza meg. Azok a fehérjék, amelyek izoelektromos pontja (pI) a fiziológiás feltételek felett van, pozitív töltésűek, míg a fiziológiás feltételek alatti pI-vel rendelkező fehérjék negatív töltéssel rendelkeznek. A fehérje nettó töltése, amelyet alkotóelemeinek összesített töltése határoz meg, elektroforetikus migrációt eredményez egy fiziológiás elektromos térben. Ezek a hatások rövid hatótávolságúak a víz nagy dielektromos állandója miatt, azonban ha a fehérje közel van egy töltött felülethez, az elektrosztatikus csatolás válik a domináns erővé. [8]

    Hidrogénkötés Szerk

    A víz ugyanolyan hajlamos hidrogénkötéseket létrehozni, mint a polipeptid bármely csoportja. A hajtogatási és asszociációs folyamat során a peptid- és aminosavcsoportok hidrogénkötést cserélnek vízzel. Így a hidrogénkötésnek nincs erős stabilizáló hatása a fehérje adszorpciójára vizes közegben. [9]

    Illusztráció: két vízmolekula kölcsönhatásba lépve hidrogénkötést képez

    Hidrofób kölcsönhatások szerkesztése

    A hidrofób kölcsönhatások lényegében entropikus kölcsönhatások, amelyek alapvetően a vizes közegben kialakuló rend/rendellenesség jelenségei miatt következnek be. A határfelületi területek minimalizálásához kapcsolódó szabad energia felelős a vízcseppek és légbuborékok felületének minimalizálásáért a vízben. Ugyanez az elv az oka annak, hogy a hidrofób aminosav-oldalláncok a víztől távolodnak, minimálisra csökkentve a vízzel való kölcsönhatásukat. A molekula külső oldalán lévő hidrofil csoportok a fehérje vízoldhatóságát eredményezik. Ezt a jelenséget úgy jellemezhetjük, hogy ezeket a hidrofób kapcsolatokat határfelületi szabadenergia-koncepciókkal kezeljük. Ennek megfelelően ezeknek a kölcsönhatásoknak a mozgatórugója a teljes határfelületi szabadenergia minimalizálása, azaz a felület minimalizálása. [10]

    Charge-Transfer Interactions Edit

    A töltés-transzfer kölcsönhatások a fehérje stabilizálásában és a felületi kölcsönhatásban is fontosak. Az általános donor-akceptor eljárásokban elképzelhető, hogy túlzott elektronsűrűség van jelen, amely egy elektrofil fajnak adományozható. Vizes közegben ezek az oldott anyagok kölcsönhatásai elsősorban a pi orbitális elektronhatásoknak köszönhetőek. [11]

    Hőmérséklet szerkesztése

    A hőmérséklet hatással van mind az egyensúlyi állapotra, mind a fehérje adszorpció kinetikájára. A magas hőmérsékleten adszorbeált fehérje mennyisége általában nagyobb, mint a szobahőmérsékleten. A hőmérséklet változása a fehérje adszorpcióját befolyásoló konformációs változásokat okoz. A fehérjékben ezek a konformációs átrendeződések entrópia-növekedést eredményeznek, amely a fehérje adszorpciójának fő hajtóerejeként működik. A fehérje adszorpciójára gyakorolt ​​hőmérsékleti hatás az élelmiszer-gyártási folyamatokban tapasztalható, különösen a folyékony élelmiszerek, például a tej esetében, amely súlyos szennyeződést okoz a hőkezelést végző berendezések falfelületén. [12] [13]

    Ionerősség Szerk

    Az ionerősség határozza meg a Debye-hosszt, amely korrelál az elektrolitban lévő rögzített töltés elektromos potenciáljának csillapítási távolságával. Tehát minél nagyobb az ionerősség, annál rövidebbek az elektrosztatikus kölcsönhatások a töltött entitások között. Ennek eredményeként a töltött fehérjék ellentétes töltésű szubsztrátokhoz való adszorpciója akadályozott, míg a hasonló töltésű szubsztrátok adszorpciója fokozódik, ezáltal befolyásolva az adszorpciós kinetikát. Ezenkívül a nagy ionerősség növeli a fehérjék aggregációs hajlamát. [12]

    Multi-protein rendszer Szerk

    Ha egy felületet több fehérjét tartalmazó oldatnak teszünk ki, bizonyos fehérjemolekulák adszorpciója előnyben részesül a többinél. A felszínhez közeledő fehérjemolekulák versengenek a kötőhelyekért. A többfehérje rendszerben a molekulák közötti vonzás léphet fel, míg az egyfehérje oldatokban az intermolekuláris taszító kölcsönhatások dominálnak. Ezen túlmenően van egy időfüggő fehérjeterjedés, ahol a fehérjemolekulák kezdetben minimális kötőhelyekkel érintkeznek a felszínen. A fehérje felszínen való tartózkodási idejének növekedésével a fehérje kibontakozhat további kötőhelyekkel való kölcsönhatás érdekében. Ez a fehérje és a felület közötti érintkezési pontok időfüggő növekedését eredményezi. Ez tovább csökkenti a deszorpció valószínűségét. [5]

    Oldatkiürítési technika Szerk

    Ez a technika méri a fehérjék koncentrációváltozását az ömlesztett oldatban az adszorpció előtt és után, Δcp. Bármilyen fehérjekoncentráció változás az adszorbeált rétegnek tulajdonítható, Γp.

    Ez a módszer nagy felületű anyagokat is igényel, például szemcsés és gyöngyös adszorbenseket. [14]

    Ellipszometriai szerkesztés

    Az ellipszometriát széles körben alkalmazzák a fehérje adszorpciós kinetikájának, valamint az adszorbeált fehérjeréteg szerkezetének mérésére. Ez egy optikai technika, amely a fény polarizációjának változását méri a felületről való visszaverődés után. Ehhez a technikához sík, tükröződő felületekre van szükség, előnyösen kvarcra, szilíciumra vagy szilícium-dioxidra, és a törésmutatóban erős változásra van szükség a fehérje adszorpciója során. [12]

    Atomerő-mikroszkópia Szerkesztés

    Az atomerő-mikroszkópia (AFM) egy hatékony mikroszkópos technika, amelyet a minták nanoméretű vizsgálatára használnak, és gyakran használják a fehérjék felületi eloszlásának képére. Egy konzolból áll, amelynek hegye a felületen átvizsgálható. Ez egy értékes eszköz a fehérje-fehérje és a fehérje-felület kölcsönhatás mérésére. Számos AFM vizsgálat korlátozó tényezője azonban, hogy a képalkotást gyakran a felület szárítása után végzik, ami befolyásolhatja a fehérje feltekeredését és a fehérjeréteg szerkezetét. Ezenkívül a konzolhegy kimozdíthat egy fehérjét, vagy hullámosíthatja a fehérjeréteget. [12] [15]

    Felületi plazmonrezonancia Szerk

    A felületi plazmon rezonanciát (SPR) széles körben alkalmazzák nagy érzékenységű fehérjeadszorpció mérésére. Ez a technika felületi plazmonok gerjesztésén alapszik, azaz hosszanti elektromágneses hullámok, amelyek a fémek és a dielektrikumok határfelületén keletkeznek. A molekulák vezető felületére és vékony rétegekre történő lerakódás 200 nm-en belül módosítja a rendszer dielektromos tulajdonságait és ezáltal az SPR választ is, jelezve a fémfelületen lévő molekulák jelenlétét. [16]

    Kvarckristály mikromérleg Szerk

    A kvarckristály mikromérleg (QCM) egy korong alakú kvarckristály köré épülő akusztikus érzékelő. Kihasználja a fordított piezoelektromos hatást. A QCM-et és a kiterjesztett változatokat, például a QCM-D-t széles körben használják fehérjeadszorpciós vizsgálatokhoz, különösen a címkézés nélküli fehérje adszorpció valós idejű monitorozására. Az adszorpciós vizsgálatokon kívül a QCM-D a rugalmassági modulusokról, a viszkozitásról és a konformációs változásokról is szolgáltat információkat [17]

    Optikai hullámvezető fénymódú spektroszkópia Szerkesztés

    Az optikai hullámvezető fénymódusú spektroszkópia (OWLS) egy vékonyfilmes optikai hullámvezetőre épülő eszköz, amely diszkrét számú irányított elektromágneses hullámot vesz körül. A vezetés egy rácsos csatlakozó segítségével történik. A hullámvezető feletti vékonyréteg réteg effektív törésmutatójának mérésén alapul. Ez a technika csak nagyon átlátszó felületeken működik. [17]

    A felületeken adszorbeált fehérje mennyiségének mérésére széles körben használt egyéb módszerek közé tartozik a radioaktív jelölés, a Lowry-teszt, a pásztázószög reflektometria, a teljes belső reflexiós fluoreszcencia, a bicinkoninsav vizsgálat stb.

    Kémiai összetétel Szerk

    A fémes kötés a pozitív fémionok és a környező vegyértékelektronfelhők közötti specifikus kötésre utal. [18] Ez az intermolekuláris erő viszonylag erős, és az atomok ismételt kristályos orientációját idézi elő, amelyet rácsrendszernek is neveznek. A közös rácsképződményeknek többféle típusa létezik, és mindegyiknek megvan a maga egyedi tömítési sűrűsége és atomi közelsége. A fémionok negatív töltésű elektronfelhői a töltés taszítása miatt sztérikusan akadályozzák a negatív töltésű fehérjerégiók adhézióját, így korlátozzák a fehérjék fémfelülethez való kötőhelyeit.

    A rácsképződés a potenciális fémion-függő adhéziós helyekkel (MIDAS) való érintkezéshez vezethet, amelyek a kollagén és más fehérjék kötőhelyei. [19] A fém felülete eltérő tulajdonságokkal rendelkezik, mint a tömb, mivel a normál kristályos ismétlődő alegységek a felületen végződnek. Ezáltal a felszíni atomok az egyik oldalon szomszédos atom nélkül maradnak, ami eleve megváltoztatja az elektroneloszlást. Ez a jelenség azt is megmagyarázza, hogy a felszíni atomoknak miért nagyobb az energiája, mint a tömegének, amelyet gyakran egyszerűen csak úgy emlegetnek felületi energia. Ez a magasabb energiájú állapot kedvezőtlen, és a felszíni atomok a rendelkezésre álló reaktív molekulákhoz kötődve próbálják csökkenteni. [20]

    Ez gyakran fehérje adszorpcióval valósul meg, ahol a felületi atomok előnyösebb energiaállapotba redukálódnak.

    A test belső környezetét gyakran úgy modellezik, hogy 37 °C-os, 7,3-as pH-n lévő vizes környezet sok oldott oxigént, elektrolitokat, fehérjéket és sejteket tartalmaz. [5] Ha huzamosabb ideig oxigénnek vannak kitéve, sok fém oxidálódhat, és az elektronok elvesztésével növelheti felületi oxidációs állapotát. [21] Ez az új kationos állapot nettó pozitív töltéssel és nagyobb affinitással hagyja el a felszínt a negatív töltésű fehérje oldalcsoportokhoz. A fémek és fémötvözetek hatalmas sokféleségén belül sok közülük érzékeny a korrózióra, amikor beültetik a testbe. Az elektronegatívabb elemek gyorsabban korrodálódnak, ha elektrolitban gazdag vizes környezetnek, például az emberi testnek vannak kitéve. [22] Mind az oxidáció, mind a korrózió csökkenti a szabad energiát, így befolyásolja a fehérje adszorpcióját, amint azt az egyenlet mutatja. 1. [23]

    A topográfia hatásai Szerkesztés

    A felületi érdesség és textúra tagadhatatlanul befolyásolja a fehérje adszorpcióját minden anyagon, de a fémmegmunkálási folyamatok mindenütt jelen vannak, hasznos megvizsgálni, hogy ezek hogyan befolyásolják a fehérje viselkedését. Fontos a kezdeti adszorpció, valamint a tapadás és integritás megőrzése. A kutatások kimutatták, hogy a felületi érdesség elősegítheti az állványfehérjék és az oszteoblasztok adhézióját, és a felület mineralizációjának fokozódását eredményezi. [24] A topográfiai jellemzőkkel és érdességekkel rendelkező felületek nagyobb felülettel rendelkeznek a fehérjék számára, amelyekkel kölcsönhatásba léphetnek. [5] Ami az orvosbiológiai mérnöki alkalmazásokat illeti, a mikromegmunkálási technikákat gyakran alkalmazzák a fehérjék implantátumokhoz való tapadásának növelésére a gyógyulási idő lerövidítése reményében. A lézermintázás technikája olyan barázdákat és felületi érdességeket vezet be, amelyek befolyásolják a tapadást, a migrációt és az igazodást. A homokfúváshoz hasonló módszer, a szemcseszórás és a kémiai maratás sikeres felületi érdesítési technikának bizonyult, amely elősegíti a titán implantátumok hosszú távú stabilitását. [25] A stabilitás növekedése az extracelluláris mátrix és a kollagén kötődés megfigyelt növekedésének közvetlen eredménye, ami az oszteoblasztok megnövekedett kötődését és mineralizációját eredményezi a nem érdesített felületekhez képest. [26] Az adszorpció azonban nem mindig kívánatos. Az adszorpció negatívan befolyásolhatja a gépeket, különösen a fehérje adszorpciója az élelmiszeriparban.

    A polimerek nagy jelentőséggel bírnak, ha figyelembe vesszük a fehérje adszorpcióját az orvosbiológiai arénában. A polimerek egy vagy több típusú "merből" állnak, amelyek ismétlődően kapcsolódnak egymáshoz, jellemzően irányított kovalens kötésekkel. Ahogy a lánc növekszik a merek hozzáadásával, az anyag kémiai és fizikai tulajdonságait a monomer molekulaszerkezete határozza meg.A polimerben lévő merek típusának vagy típusainak gondos megválasztásával és gyártási folyamatával a polimer kémiai és fizikai tulajdonságai nagymértékben testreszabhatók a specifikus fehérjék és sejtek adszorbeálására egy adott alkalmazáshoz.

    Konformációs hatások Szerk

    A fehérje adszorpciója gyakran jelentős konformációs változásokat eredményez, ami a fehérjék másodlagos, harmadlagos és kvartáris szerkezetének megváltozására utal. Az adszorpció sebessége és mennyisége mellett az orientáció és a konformáció kritikus fontosságú. Ezek a konformációs változások befolyásolhatják a fehérje kölcsönhatását ligandumokkal, szubsztrátokkal és antigénekkel, amelyek a kérdéses kötőhely orientációjától függenek. Ezek a konformációs változások a fehérje adszorpció eredményeként denaturálhatják a fehérjét és megváltoztathatják natív tulajdonságait.

    Adszorpció polimer állványokhoz Szerk

    A szövettechnológia egy viszonylag új terület, amely egy állványzatot használ platformként, amelyen a kívánt sejtek szaporodnak. Nem világos, hogy mi határozza meg az ideális állványzatot egy adott szövettípushoz. A megfontolások összetettek, és a fehérje adszorpciója csak növeli a bonyolultságot. Bár az építészet, a szerkezeti mechanika és a felületi tulajdonságok kulcsszerepet játszanak, a degradáció és a fehérje adszorpció sebességének megértése is kulcsfontosságú. A mechanikai és geometriai alapelemeken túlmenően egy megfelelő állványkonstrukció olyan felületi tulajdonságokkal is rendelkezik, amelyek a különösen érdekes sejttípusok rögzítésére és migrációjára optimalizáltak.

    Általában azt találták, hogy azok az állványok a legsikeresebbek, amelyek nagyon hasonlítanak a szerkesztett szövet természetes környezetéhez. Ennek eredményeként sok kutatás folyt a természetes polimerek vizsgálatára, amelyek a feldolgozási módszertanon keresztül szabhatók a meghatározott tervezési kritériumokhoz. A kitozán jelenleg az egyik legszélesebb körben használt polimer, mivel nagyon hasonlít a természetben előforduló glikozaminoglikánokhoz (GAG), és emberi enzimek által lebontható. [28]

    Chitosan Edit

    A kitozán egy lineáris poliszacharid, amely kapcsolt kitin-eredetű maradékokat tartalmaz, és bioanyagként széles körben tanulmányozzák, mivel nagymértékben kompatibilis a szervezetben lévő számos fehérjével. A kitozán kationos, így elektrosztatikusan reagál számos proteoglikánnal, anionos GAG-val és más negatív töltésű molekulával. Mivel sok citokin és növekedési faktor kapcsolódik a GAG-hoz, a kitozán-GAG komplexeket tartalmazó vázak képesek megtartani ezeket a fehérjéket, amelyeket a tapadó sejtek választanak ki. A kitozán másik minősége, amely jó bioanyag potenciált biztosít számára, az oldatokban található nagy töltéssűrűség. Ez lehetővé teszi a kitozán számára, hogy ionos komplexeket képezzen számos vízoldható anionos polimerrel, kibővítve a hozzá kötődni képes fehérjék körét, és ezáltal kibővíteni a lehetséges felhasználási lehetőségeit. [29]

    Polimer Állványszerkezet Célszövet Alkalmazás cella típusa Ref
    Kitozán 3D porózus blokkok Csont Osteoblaszt-szerű ROS [30]
    Kitozán-poliészter 3D szálhálók Csont Humán MSC [31]
    Kitozán-alginát Injekciós gél Csont Osteoblaszt-szerű MG63 [32]
    Kitozán-zselatin 3D porózus hengerek Porc Kondrociták [33]
    Kitozán-GP Injekciós gél Porc Kondrociták [34]
    Kitozán-kollagén Porózus membránok Bőr Fibroblaszt és keratinocita együtttenyésztés [35]
    Asztal 1: Kitozán alapú állványok szerkezetei, célszövetei és alkalmazási sejttípusai

    A fehérje adszorpciója kritikus fontosságú számos ipari és orvosbiológiai alkalmazásban. A fehérjeadszorpció pontos előrejelzése lehetővé teszi az előrelépést ezeken a területeken.

    Biomolekuláris adszorpciós adatbázis szerkesztése

    A Biomolecular Adsorption Database (BAD) egy szabadon elérhető online adatbázis, amely az irodalomból gyűjtött kísérleti fehérjeadszorpciós adatokat tartalmaz. Az adatbázis felhasználható a mikrofluidikus készülékek gyártásához szükséges anyagok kiválasztására, valamint a lab-on-a-chip készülékek optimális működési feltételeinek kiválasztására. A felületre adszorbeált fehérje mennyisége megjósolható a BAD-nál elérhető neurális hálózat alapú előrejelzés segítségével. Ez az előrejelzés 5% alatti hibának bizonyult a BAD-ban elérhető összes adatra vonatkozóan. Más paraméterek, például a fehérjerétegek vastagsága és a fehérjével borított felületek felületi feszültsége is becsülhető. [ idézet szükséges ]


    Nézd meg a videót: Mi történik a Lélekkel a halál után? (Augusztus 2022).