Információ

Miért rövidebbek a szekvenálási adatok, mint a PCR-termékek?

Miért rövidebbek a szekvenálási adatok, mint a PCR-termékek?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Megterveztem és teszteltem primereket RT-PCR-hez, majd a PCR-termékeket megtisztítottam a gélekből, és elküldtem a GATC-be (SUPREMERUN) a forward primerek segítségével.

A refseq leolvasása után azt látom, hogy ~30%-kal rövidebbek, mint a PCR termék. Példa:

PCR várható hossza = 182 bp Olvasási hossz = 133 bp

Meg kell említenem, hogy a gélekben a várt PCR méretek rendben voltak.

Van valakinek ötlete, hogy mi az oka ennek a hosszcsökkenésnek?

Kösz


A megbízható szekvenálási leolvasások általában 50 bp-vel a primerek kezdetétől lefelé kezdődnek. Ez azt jelenti, hogy a 180 bp-s sáv (a gélen) egy primerrel szekvenálva leolvasható szekvenciát eredményez az 50-180 bp régióban (130 bp hosszúság). Azt is észrevettem, hogy a szekvenciák általában valamivel a megbízható adatok előtt jelentek meg, azaz a tiszta adatok 52-55 bp után indulnak, de a szekvenálás a primer indítása után 48 bp után bázispárokat jelent.

Ha teljes sávú szekvenciára van szüksége, akkor két primerből álló készlettel kell szekvenálnia, mindegyik más-más irányban. Mióta PCR-e ezt a sávot, már megvan a szekvenáló primerje.


Az A/J és CAST/Ei egértörzsekből származó 17-es kromoszóma mély, rövid leolvasású szekvenálása jelentős csíravonal-variációkat és olyan jelölt géneket azonosít, amelyek szabályozzák a máj trigliceridszintjét

A genomszekvenciák alapvető eszközei az összehasonlító és mutációs elemzéseknek. Itt bemutatjuk az egér 17-es kromoszóma rövid leolvasási szekvenciáját a Mus musculus domesticus származtatott A/J törzs, és a Mus musculus castaneus származtatott CAST/Ei törzs. Megközelítéseket írunk le a gerinces kísérleti szervezetek genomjában a nukleotid- és szerkezeti eltérések pontos azonosítására, és bemutatjuk, hogyan alkalmazhatók ezek a technikák a jelölt gének fontossági sorrendjének meghatározására a kvantitatív tulajdonságlókuszokon belül.


Bevezetés

A PCR-amplikonok nagy áteresztőképességű piroszekvenálása a mikrobiális ökológia értékes technikájává vált, és példátlan részletességgel tárta fel a különféle tengeri és szárazföldi környezetben [1]–[9], valamint az emberi mikrobiomában [10]& #x02013[13]. Ennek a megközelítésnek az ereje az elért olvasási mélységben rejlik, ahol egyidejűleg több tíz-százezer egyedi szekvenálási leolvasást generálnak, és felhasználják az adott közösségben található mikrobiális működési taxonómiai egységek (OTU) összetételének és mennyiségének becslésére. Ennek a nagy olvasási mélységnek azonban az ára a viszonylag magas hibaarány ára az általánosan alkalmazott szekvenálási technológiával (azaz Roche 454 GS FLX titánkémiai technológiával, 454-Ti) végzett egyedi leolvasásoknál [14]. A genomiális (újra) szekvenálással összefüggésben alacsony konszenzusos hibaarány érhető el szekvencia-összeállítás révén, azonban a PCR-amplikonok esetében a redundancia megkülönböztethetetlen a bőségtől, és az egyedi leolvasásokhoz kapcsolódó magas hibaarányok ezért hozzájárulnak a diverzitás túlbecsléséhez, mivel A hibás leolvasások kevésbé bőséges, de szorosan kapcsolódó OTU-ként nyilvánulnak meg [15].

Számos kísérletet tettek arra, hogy felmérjék és kezeljék 454 egyszeri olvasási hiba hatását a közösség gazdagságának becslésére. Ezek az erőfeszítések elsősorban az OTU diverzitásbecslések pontosságára irányultak, különös figyelmet fordítva az OTU-k számbavételére. Ritka bioszféra [6], [15]–[17]. Az egyik következetes megállapítás az, hogy az amplikon piroszekvenálási adatok feldolgozásának standard technikái több száz �lse” OTU kimutatását eredményezhetik, többnyire alacsony gyakorisággal, még egyetlen tesztszervezetből is [15]. Ezek a megállapítások aggodalomra adnak okot, hogy a fajok abundanciája túlbecsülhető az amplikon piroszekvenálási adatok tekintetében. Ezt követően szigorúbb megközelítéseket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik, hogy a hibákat tartalmazó leolvasások mennyiségét beleszámítsák a gyakrabban előforduló, állítólag hibamentes leolvasásokba, amelyekből származtak [16]–[21].

Az újonnan kifejlesztett �-noising” módszerek által alkalmazott számítási stratégiák három kategóriába sorolhatók: 1) identitás-alapú klaszterezés, ahol a zajmentesítést nukleotidszekvenciák egymáshoz igazításával és klaszterezésével érik el (pl. single-linkage pre-klaszterezés, SLP [17] CD-HIT-OTU, http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit-otu és “otupipe”, http://drive5.com/otupipe/) 2) Nem igazítási klaszterezés , amely a K-mer klaszterezést alkalmazza, nem pedig az igazításon alapuló távolságszámításokat az olvasások zajmentesítésére [22] vagy akár közvetlenül az olvasások OTU-khoz [20] történő hozzárendelésére. zajtalanító csővezeték [18], [19], [21], [23]. Mindezek a módszerek olyan minőségi szűrőket is használnak, amelyekről úgy tűnik, hogy az alacsony olvasási pontossággal korrelálnak, mint például a rendellenes olvasási hossz, a vonalkóddal és/vagy a PCR-primerrel való eltérés, valamint az alacsony minőségi pontszám. Ahhoz, hogy megvizsgáljuk és összehasonlítsuk e különböző megközelítések teljesítményét a közösségi struktúrák pontos helyreállításában, három publikált módszert választottunk, az SLP-t [17], a PyroTaggert [20] és az AmplionNoise-t [19] a három kategória reprezentálására.

Minden zajtalanító csővezeték egy “true” amplikon szekvencia abundanciáját rendeli hozzá saját bőségének és a belőle keletkezett “noise” olvasásoknak az összegeként, eltávolítva a “noise� adatkészletből folyamat. Mindazonáltal az egyes zajtalanító folyamatok különböző stratégiákat alkalmaznak a “true” olvasás szekvenciaazonosságának meghatározására (azaz az egyes OTU-k reprezentatív szekvenciájának kiválasztására). Végső soron a reprezentatív szekvenciák hűsége fontos a pontos taxonómiai hozzárendeléshez és a filogenetikai elemzéshez. Ezenkívül a zaj túlzottan agresszív eltávolítása klaszterezés révén elkerülhetetlenül a valódi, de szorosan összefüggő szekvenciák helytelen csoportosításához vezet, amelyek nagyon eltérő ökotípusoknak felelhetnek meg [24].

Tényezők széles köre befolyásolja a mikrobiális közösség szerkezetének meghatározását a 16S rRNS génamplikonokból. A PCR amplikon méretéről azt feltételezték, hogy befolyásolja a megfigyelhető diverzitást [25], feltehetően a hosszabb amplikonok alacsonyabb amplifikációs/klónozási hatékonysága miatt, bár a PCR amplikon mérete és a primer kiválasztása elkerülhetetlenül összefügg, és hatásukat nehéz elkülöníteni [26], [27]. . További PCR torzítások, beleértve a primer hibás illeszkedést [28], [29], a differenciális amplifikációs hatékonyságot [30], [31] és a differenciális annealing hatékonyságot [29], szintén befolyásolhatják a megfigyelt diverzitást és szerkezetet. Ezek a problémák a fent tárgyalt magas hibaarányokkal kombinálva torzíthatják a közösség taxonómiai gazdagságára és bőségére vonatkozó becsléseket.

A fent vázolt zajcsökkentési stratégiákat nem vizsgálták a valóban ritka taxonok iránti érzékenység vagy a becsült közösségszerkezet pontossága szempontjából. Különösen az összehasonlító vizsgálatokhoz elengedhetetlen, hogy a visszanyert olvasási gyakoriságok megbízhatóan értelmezhetők legyenek a populáció bőséges bizonyítékaként. Ezenkívül fontos annak biztosítása, hogy a ritka olvasmányok valóban ritka taxonokat jelezzenek, mivel ezek alkotják a modern világ filozófiai alapját. Ritka bioszféra koncepció [6]. Ezért a PCR utáni piroszekvenálás munkafolyamatának a megfigyelt mikrobiális közösség szerkezetére és sokféleségére gyakorolt ​​​​potenciális hatását továbbra is alulvizsgálják. Ennek a témának alapos vizsgálata szükséges eleve közösségösszetétel és -struktúra ismerete.

Ebben a tanulmányban hat különbözőt használtunk in vitro- szimulált közösségek (iv-SCs) a 16S rRNS gén PCR amplikonjainak a mikrobiális közösség szerkezetének rekonstrukciójával kapcsolatos torzítások jellemzésére piroszekvenálási adatok segítségével. Ennek elérése érdekében a megfigyelt közösségek szerkezetében fellépő lehetséges torzulásokat, a ritka taxonok gyakorlati kimutatási határát és a PCR torzításának hatásait a kezdeti PCR-lépésben mind megvizsgálták, és felmérték, hogy milyen hatással vannak e technika alkalmazására a mikrobiális ökológiai kutatásban.


Eredmények

A Rep-PCR-rel dúsított könyvtár nagymértékben reprodukálható LCp-t termel

A Rep-PCR gél alapú ujjlenyomatokhoz hasonlóan a szekvenált Rep-PCR termékek LCp-vé alakíthatók, ami az olvasási hossz és a bőség függvénye. A csúcsok alakja és helyzete nagymértékben reprodukálható minden technikai ismétlésben az első két szekvenálás során (1. ábra, Kiegészítő 1. és 2. ábra), jelezve, hogy a vonalkód-szekvenciák nem befolyásolják a csúcsok alakját vagy helyzetét az ismétlés során. PCR-2. Mégis, amint azt alább kifejtjük, kisebb futási hatást figyeltünk meg a harmadik egymást követő futtatásban, ami a rövid/hosszú leolvasások eltolt eloszlását eredményezte.

Pediococcus claussenii Oxford Nanopore Technology alapú rep-PCR amplikon szekvenálás (ON-rep-seq) olvasási hossz-számlálási profilok (LCps). Az LCp-ket az ON-rep-seq of Pediococcus claussenii. Minden műszaki másolata P. clausenni A profilok nagyfokú hasonlóságot mutatnak három egymást követő szekvenálási futtatás során (piros, kék és zöld az A, B és C futásnál), és két technikai ismétlésben minden egyes futtatásban. A megfelelő csúcs hosszának megfelelő szekvenciákat korrekcióra vetettük alá Canu segítségével, és a konszenzus szekvenciákat blastn segítségével ellenőriztük. Minden profil esetében hat-nyolc kiváló minőségű leolvasás generálható, amelyek mindegyike >99%-os hasonlóságot mutat a referencia genomjával. P. clausenni. Az egyes csúcsok feletti számok a csúcsérzékelési érzékenységet jelzik, ahol az 1 a legszembetűnőbb. Az olvasáskorrekcióhoz szükséges csúcson belüli leolvasások minimális száma 50

Az LCp korrigált leolvasása részletes azonosítást tesz lehetővé

A Rep-PCR profil gélen lévő egyetlen sávja (vagy csúcsa az LCp-ben) főként ugyanannak az amplikonnak a képviselőit tartalmazza, ami lehetővé teszi az alappontosság korrekcióját olyan eszközökkel, mint például a Canu 22 . Ezzel a feltételezéssel kifejlesztettünk egy folyamatot, amely három lépésben működik: törzs-specifikus LCp generálás és összehasonlítás, csúcson belüli olvasás korrekciója és csúcs konszenzus szekvencia annotációja. A csővezeték átlagosan 10 jó minőségű konszenzusos leolvasást generált minden izolátumhoz (max = 26 perc = 3 SD = 4), átlagos hossza 1 kbp (max = 3,6 kbp min = 0,3 kbp SD = 0,6 kbp). A korrekcióhoz használt leolvasások száma egy csúcson belül (klaszterméret) 50 és 2400 között változott (átlag = 254 SD = 246).

Az egyes minták korrigált leolvasási sorozatának metagenomikus osztályozónak (kraken2 vagy centrifuga) való alávetése lehetővé tette az összes baktérium egyértelmű osztályozását a fajok és alfajok szintjéig (1. táblázat). Az Illumina szekvenálással validált törzs korrigált leolvasásainak átlagos szekvenciahasonlósága (S. enterica Typhimurium C5 szerovariáns) elérte a 99,4%-ot (BLAST min = 98,3%, max = 100%, SD = 0,5%). A vizsgált izolátumok között van pl. Lactobacillus casei és Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 16S rRNS génszekvencia-összehasonlítása alapján ismerten megkülönböztethetetlen, ill Lactococcus lactis subsp. cremoris amitől nem lehet megkülönböztetni Lactococcus lactis subsp. lactis. Mindezeket a törzseket egyértelműen megkülönböztettük az ON-rep-seq. Két baktériumfaj: Bacteroides thetaiotaomicron és Lactococcus lactis subsp. cremoris Különböző tenyészetgyűjteményekből származó párokban tesztelték, minden esetben nagymértékben reprodukálható LCp-t eredményezve (1. kiegészítő ábra).

Törzsszintű differenciálás LCp segítségével

Öt Listeria monocytogenes, négy Salmonella enterica (három szerovar Typhimurium és egy szerovar Oranienburg), és kettő Bacillus cereus törzseket használtak a törzsszintű megkülönböztetés módszerének értékelésére. Kidolgoztunk egy algoritmust (LCpCluster.R), amely megbecsüli az ON-rep-seq által generált LCp párok közötti hasonlóság szintjét. Öt között L. monocytogenes törzsek esetében négy egyedi profilt azonosítottunk (2a. és 3. ábra). Az EGDe és LO28 törzsek azonos profilokat hoztak létre (2a. és 3. ábra).

Példák törzsszintű differenciálásra LCp összehasonlítással. ab Oxford Nanopore Technology alapú rep-PCR amplikon szekvenálás (ON-rep-seq) ötből L. monocytogenes (a), négy S. enterica (b), és kettő B. cereus (c) törzseket használtuk az olvasási hossz-számlálási profilok (LCp) előállításához. Minden bakteriális LCp-t kettős példányban állítottunk elő. Mind a 22 minta korrigált csúcsaiból származó konszenzusszekvenciák lehetővé tették az egyértelmű faj- és alfajszintű azonosítást. Az LCp-k összehasonlítása négy különböző profilt mutatott ki a L. monocytogenes faj. Az EGDe és az LO28 törzsek nagyon hasonló profilokat adtak, ami azt jelzi, hogy e két törzs között magas szintű genetikai rokonság van.a), amit az Illumina alapú shotgun szekvenálás (orthoANI = 99,9%) igazolt. Hasonlóképpen a C5 és u292 törzsek S. typhimurium ugyanazt a profilt mutatta (orthoANI = 99,9%), míg két másik törzset különbözőnek lehetett besorolni (b). A piros nyilak további csúcsot jeleznek, amely megkülönbözteti a 4/74 törzset az u292-től és a C5-től, amelyről kimutatták, hogy profág eredetű. A további csúcsok jelenléte a GR177 törzs LCp-jében lehetővé tette a kettő közötti egyértelmű különbségtételt B. cereus törzsek (c)

Sor/oszlop klaszterezés a Ward.D2 hierarchikus klaszterezés szerint D_KLsym távolságon. A hasonlóságot mutató hőtérkép (10^(-D_KLsym)), és a klaszterek a cut-off szerint = 0,09. Öt elemzése Listeria monocytogenes, kettő Bacillus cereus, és négy Salmonella enterica szerovár Typhimurium törzsek minden esetben lehetővé tették a fajszintű, 11-ből 8 esetben a törzsszintű differenciálódást. Nevezetesen, a további csúcs jelenléte lehetővé tette a 4/74 egyértelmű megkülönböztetését a C5-től és az u292-től, ami nem volt lehetséges a WGS-adatokon alapuló OrthoANI és MLST elemzéssel. A törzs a színeket a profilok vizuális vizsgálatából származó elfogadott alakzathasonlóságnak megfelelően címkézi, összhangban a klaszteres színekkel a kiválasztott határértéknél

Az összes technikai ismétlés megfelelő csúcsainak konszenzusszekvenciáinak összehasonlításakor nem lehetett SNP-variánsokat kimutatni. A WGS-adatokat az EGDe és az LO28 törzsek közötti genetikai hasonlóság becslésére használták. A két genom közötti átlagos nukleotid azonosság (OrthoANI) index elérte a 99,9%-ot. Ezenkívül a k-mer eloszlás összehasonlítása nagyfokú hasonlóságot mutatott a két törzs között (Jaccard távolság a megosztott k-merek esetén = 0,0005). Végül, L. monocytogenes Az EGDe és LO28 ellen leképezett MLST sémák csak egy eltérő lókuszt találtak (dapE) a hét tesztelt közül (1. kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a két törzs között nagy a genetikai hasonlóság, amely speciális megközelítést igényel a differenciálódás biztosításához.

Négy között S. enterica törzsek esetében az LCpCluster.R három egyedi profilt ismert fel (2b. és 3. ábra). Az u292 és C5 szerovar Typhimurium törzsek ugyanazt az ON-rep-seq LCp-t mutatták, SNP variánsok nélkül a megfelelő csúcsokban. E két törzs WGS-összehasonlítása magas, 99,9%-ot elérő OrthoANI-t és magas k-mer eloszlási hasonlóságot mutatott (Jaccard távolság a megosztott k-merek esetén = 0,0005). Salmonella enterica Az u292 és C5 genomjaival szemben feltérképezett MLST sémák szintén ugyanazokat az allélprofilokat mutatták (1. kiegészítő táblázat). Ez arra utal S. enterica Az u292 és C5 törzseket nem lehetett egyértelműen megkülönböztetni genomjuk alapján mindkét módszerrel.

Érdekes módon a Typhimurium 4/74-es szerovariáns törzse, amely hasonló LCp-t mutatott, mint az u292 és a C5, mégis egyértelmű további csúccsal a pozícióban.

1370 bp (2b. és 3. ábra), 99,9% feletti OrthoANI-t ért el, magas k-mer eloszlási hasonlóság (Jaccard távolság a megosztott k-merek esetén <0,0003), és azonos MLST profillal rendelkezett az u292-vel és C5-tel összehasonlítva. Ebben a konkrét példában az ON-rep-seq nagyobb diszkriminációs erőt mutatott az OrthoANI-nál, a k-mer eloszláselemzésnél és a WGS-adatokon alapuló MLST-elemzésnél. A pozícióban lévő csúcs további vizsgálata

1370 bp feltárta, hogy a konszenzus szekvencia nagy hasonlóságot mutat (blast azonosság 1372/1384 bp 99,1%) a SopEΦ profággal. Sőt, ez a szekvencia csak a 4/74-es törzs genomvázlatában volt megtalálható (blast azonosság 1371/1384 bp 99,1%), de a többiben nem. S. enterica törzsek.

Végül a kettő B. cereus törzsek egyértelműen megkülönböztető LCp-t generáltak, és különböző törzsekbe sorolták őket (2c. és 3. ábra). Az LCp.Cluster eredmények, amelyek a Ward.D2 hierarchikus klaszterezés szerinti csoportosítást mutatják a D_KLsym távolságon, mind a 48 izolátum négy technikai ismétlésében az első két futtatásból, a 2. kiegészítő ábrán láthatók.

Az elméleti áteresztőképesség több mint 1000 izolátumot ér el

A módszer validálásához két R9.4.1 áramlási cellát benchmarkoltunk a maximálisan generált kimenetre. Az első benchmark áramlási cella összesen több mint 2,6 millió leolvasást generált (minőség-ellenőrzés és demultiplexelés után). A részletekért lásd a 2. kiegészítő táblázatot. Az első négy egymást követő futtatásban, amelyek mindegyike 4 óráig tartott, az áramlási cella mosási lépéseivel és legalább 24 órás tárolással összefonva elegendő adatot generáltunk ahhoz, hogy sikeresen demultiplexeljenek és azonosítsanak 4 × 96 baktériumprofilt egyetlen áramlási cellán. Az utolsó futtatás 0,22 millió leolvasást generált, ami elegendő volt a 96 mintából 94 szekvenciájának észleléséhez és kijavításához.

A második áramlási cella összesen 2,49 millió leolvasást generált 1, 0,56 és 0,87 milliót az első (4 óra), a második (4 óra) és a harmadik (12 óra) futtatás során. Lásd a táblázatot, a 2. kiegészítő táblázatot. A második áramlási cella mindhárom futtatása elegendő adatot generált 96 baktériumprofil sikeres elemzéséhez. Az összes minta elemzéséhez szükséges leolvasások minimális számának ellenőrzése érdekében az adatokat iteratív részmintavételezéssel vettük alá, és a vevő működési jellemzői (ROC) görbéivel elemzésnek vetették alá, hogy számszerűsítsék a páronkénti azonos/nem ugyanazon alakváltozási megkülönböztetéstől függő kompromisszumot. a klaszterezési küszöbön. Az elemzés során megfigyelhető volt, hogy a törzsön belüli variancia nagyobb volt, mint a törzsek közötti variancia kis eltérések esetén az utóbbinál, és az előbbi esetben a rövid leolvasások és a hosszú leolvasások aránytalansága (a megfigyelés mintaátlaggal igazolt). olvasási hossz regresszió vs. minta olvasási szám Kiegészítő 3. ábra). Ez az aránytalanság az újrafelhasznált áramlási cellán végzett harmadik szekvenálási futtatásnak tulajdonítható, ezért a legutóbbi repC-futást kihagytuk a klaszteranalízisből és az azt követő legtöbb ROC-görbe elemzésből.

Összehasonlítottuk a különböző adathalmazok klaszterezését: minden, wo.rep*C (a harmadik egymást követő futtatás nélkül: repC), 2, 10, 20 és 50%-os részminta. Az idő nagy részében a wo.rep*C teljesített a legjobban, bár az 50, 20 és 10%-os részminták véletlenszerű ingadozásai esetenként felülteljesítettek egyes adatpontokon. Az 50 és 20%-os részmintavétel (átl. #olvasás/minta 4326 és 1730) nagyon hasonlóan teljesített, mint a teljes mintákhoz (átl. #olvasás/s 8652), míg a részminták 10%-a rosszabbul, bár még mindig meglehetősen jó, míg a 2%-os részminták ( Átl. #reads/s 173) sokkal rosszabbul teljesített, bár a releváns információk még ilyen kis olvasási hosszúságú minta esetén is rendelkezésre állnak és visszakereshetők (4a–f kiegészítő ábra).

Az áramlási cella benchmarking eredményei azt mutatták, hogy a generált leolvasások 20%-a (átl. #reads/sample 1730) már elegendő volt az összes minta elemzéséhez. Nevezetesen, hogy egy áramlási cellán egyidejűleg elemezhető izolátumok száma végső soron az LCp csúcsainak számától és helyzetétől függ (a törzsszintű összehasonlításhoz). Ennek ellenére adataink azt mutatják, hogy az R9.4.1 áramlási cella elméleti áteresztőképessége 960 és 1440 izolátum között mozog a szekvenálási futtatás teljesítményétől függően (


Vita

Ebben a munkában egy olyan adatkészletet hoztunk létre, amelyről úgy gondoljuk, hogy általános érdekűnek kell lennie a közösség számára. Ez az adatkészlet ugyanazon minták RNS- és cDNS-szekvenálásából áll, mind az Illumina, mind az ONT technológiával. Fontos, hogy a Lexogen E2 spike-in adatait is szekvenáltuk az egérmintáinkkal együtt, amelyek lehetővé tették számunkra, hogy felmérjük, melyik technológia adja a legpontosabb számszerűsítést.

Bár lexogén spike-in-t alkalmaztak az ONT cDNS-Seq 21 vagy ONT RNA-Seq 7 protokollal kapott mennyiségi meghatározás külön-külön kiértékelésére, mi vagyunk az elsők, akik összehasonlították az ONT cDNS-Seq, RNA-Seq és Illumina cDNS-sel kapott kvantifikációt. Seq.

A spike-in adatok felhasználásával azt találtuk, hogy az ONT RNA-Seq protokoll a legpontosabb, valamivel jobb, mint a széles körben használt Illumina TruSeq protokoll. Ezzel szemben a cDNS-Seq adatok torzabbak voltak, és gyengébb mennyiségi meghatározást eredményeztek.

Megállapítottuk továbbá, hogy a poly(T) belső futtatását tartalmazó átiratok általában csonkolódnak és túlmintázzák az ONT cDNA-Seq protokoll használatakor. Ugyanennek a könyvtár-előkészítésnek az Illumina technológiával történő szekvenálása lehetővé tette számunkra, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a csonkolási probléma a minta-előkészítéssel és nem a szekvenálással volt kapcsolatos. Megmutatjuk továbbá, hogy ez a torzítás nem korlátozódik a mi adatkészletünkre, és megtalálható egy emberi ONT adatkészletben 11 . A poli(A) belső futtatásaihoz kapcsolódó csonkolási torzításokról korábban beszámoltak, és ezek a rögzített poli-dT primerek (poli-TVN) használatát motiválták 22 . Másrészt a poli(T) belső futtatásához kapcsolódó torzítások nem észleltek, bár az egérben kifejezett transzkriptumok több mint 20%-át érinthetik. Ez a torzítás más, hosszú ideig leolvasott cDNS-Seq adatokat is érinthet. Bár az elfogultságokat a korábbi munkákban 23 keresték, az észrevétlen maradhatott, mert a szerzők akkor legalább 20 A-s belső futtatásokra összpontosítottak.

Ezután adatainkat felhasználtuk egérgének számszerűsítésére, és azt találtuk, hogy az ONT RNS-Seq kvantifikálása jól korrelált az Illumina cDNS-Seq kvantifikációjával (5c. ábra), de amikor a transzkriptum szintjén próbáltuk meg kvantifikálni, a korreláció összességében gyengébb volt (5a. ábra). . Csábító lehet az a gondolat, hogy az ONT RNA-Seq jobb transzkriptumszintű kvantifikációt eredményez, mivel az olvasások hosszabbak, és a rövid leolvasásokkal ellentétben egyértelműen egyetlen átirathoz vannak hozzárendelve. A gyakorlatban az ONT RNS-Seq leolvasások 70%-a egyetlen átirathoz van hozzárendelve, míg a fennmaradó 30% félreérthetően leképezett. Ez különösen igaz azokra az átiratokra, amelyek az 5′ végén különböztek, mint például a Swi5-ben. A transzkriptumok és nem a gének számszerűsítése továbbra is kihívást jelent, és speciális bioinformatikai módszerek kidolgozását igényli. Amikor a 24-es lazacot hosszú leolvasásokhoz próbáltuk használni, mint a 12-ben, nem kaptunk jobb eredményeket, mint az elsődleges igazítások egyszerű számolása. Ebben az irányban azonban van még hova fejlődni, és a spike-in adatkészletünk jó képzési készlet lehet a jövőbeli módszerek számára.

Ebben a munkában úgy döntöttünk, hogy az olvasásokat egy referencia-átirathoz igazítjuk. Valójában, amikor megpróbáltuk leolvasni a referencia genomra, azt figyeltük meg, hogy a feldolgozott pszeudogén mennyiségi meghatározását szisztematikusan túlbecsültük, a szülőgénjük rovására. Megmutatjuk továbbá, hogy ez az elfogult mennyiségi meghatározás az illesztési problémáknak köszönhető: 1- a pszeudogének poli(A)-farkai integrálódnak a genomba, és „vonzzák” a kiolvasásokat a szülőgénből, és 2- az illesztési helyek pontos azonosítása hosszú RNS-szekvencia térképezésekor. olvasása kihívást jelent, ami nem kedvez a szülőgénnek.

Ezért erősen javasoljuk, hogy a leolvasásokat a referencia-transzkriptomra térképezze fel, és ne a genomot, mivel a referencia-átiratok nem tartalmaznak intronokat, sem poli(A)-farkat. A referencia genom helyett a referencia annotációhoz való igazítás egyértelmű korlátja azonban az, hogy nem fedezhetünk fel új átiratokat. Következésképpen az ezekből az új átiratokból származó olvasmányok feltérképezése megszűnik, vagy helytelenül vannak hozzárendelve alternatív átiratokhoz (mint az APOE génben, a 11. kiegészítő ábra). Az igazítási eszközök javítása a feldolgozott pszeudogének helyes kezeléséhez elengedhetetlennek tűnik az átiratok azonosításához és számszerűsítéséhez, különösen a nem modellfajok esetében, ahol nem áll rendelkezésre kimerítő megjegyzés.

Általánosabban, az ismétlést tartalmazó gének mennyiségi meghatározása nehéz. A hosszú leolvasások különösen hasznosak e gének számszerűsítésére, például a hosszú, nem kódoló RNS-ekre, amelyek transzponálható elemekben gazdagok.

Jelenleg nagy érdeklődés övezi az ONT RNA-Seq-ben rejlő lehetőségeket a gének és átiratok azonosítására és számszerűsítésére, amint azt az ezzel a technológiával elérhető adatkészletek jelenleg alacsony, de bővülő száma is mutatja. Itt javasoltuk az első egérre vonatkozó adatkészletet számos érdekes és egyedi funkcióval, mint például a Lexogen E2 spike-in, az ONT könyvtár előkészítésének Illumina szekvenálása vagy a Lexogen TeloPrime protokoll. Úgy gondoljuk, hogy az ONT szekvenálás ígéretes az RNS tanulmányozására, különösen akkor, ha a leolvasások és a teljes hosszúságú leolvasások száma folyamatosan növekszik. A technológia és a könyvtár-előkészítési protokoll továbbfejlesztése a több leolvasás és több teljes hosszúságú leolvasás elérése érdekében várhatóan szintén nagyon hasznos lesz az összes gén és átirat pontos mennyiségi meghatározásában. A PromethION eszköz közelmúltbeli bevezetése lehetővé teszi a transzkriptomok mély szekvenálását, amely lehetővé teszi a MinION eszköz korlátainak leküzdését.


Genomika

Míg a genetikai markerek értékesek a molekuláris eszközök kifejlesztésében és a taxonómiai struktúra kialakításában, a genomok jelentik az alapot az anaerob gombabiológia megértéséhez. Egy anaerob gomba különféle genomi szegmenseinek gén-, intergenikus és rRNS-t kódoló régióinak első alapos elemzését Nicholson és munkatársai végezték el. (2005) irányított plazmidkönyvtárak segítségével. A tanulmány megfigyeléseket nyújtott az intronhatárokat szabályozó szabályokról, a különböző típusú géneknél megfigyelt kodontorzításokról és egy anaerob gombapromoter szekvenciájáról. Az anaerob gombagenomok azonban köztudottan nehezen szekvenálhatók magas AT-tartalmuk, ismétlési gazdagságuk, összetett fiziológiájuk és ismeretlen ploiditásuk miatt. A kezdeti tanulmány óta öt anaerob gomba genomot tettek közzé és nyilvánosan elérhetővé tettek, ami a régóta olvasott szekvenálási technológiák fejlesztésének közvetlen eredménye a fent említett problémák leküzdése érdekében: Piromyces sp. E2, P. ruminantium C1A (korábban Orpinomyces sp. C1A), Neocallimastix californiae, Piromyces finnis, és Anaeromyces robustus (Youssef et al., 2013 Haitjema et al., 2017). Ennek ellenére azonban az e genomok létrehozása során alkalmazott és/vagy kifejlesztett módszerekről azt találták, hogy a kutatói közösségen belüli más anaerob gombák esetében nem mindig sikeresek. Ennek eredményeként számos közelmúltbeli erőfeszítés kudarcot vallott akár (i) elég jó minőségű genomiális DNS létrehozása, (ii) rövid leolvasott szekvencia adatok összeállítása vagy (iii) újonnan szekvenált genomok megjegyzései terén. Ebben a részben áttekintjük az anaerob gombagenomok generálása és elemzése során felmerülő gyakorlati megfontolásokat és aktuális kihívásokat, valamint kiemeljük az eddig megszerzett értékes ismereteket.

A tenyésztésre és a genomi DNS izolálására vonatkozó követelmények

A sikeres genomszekvenálás fő követelménye a nagy molekulatömegű (㸐 kb) DNS kiváló minőségben (RNS, fehérje vagy szénhidrát szennyeződés nélkül) és mennyiségben (㸒 μg). Az anaerob gombák esetében számos probléma hátráltatja a kutatókat ezen követelmények teljesítésében. Az anaerob gombasejteket vastag, ellenszegülő kitint tartalmazó sejtfal védi (Orpin, 1977), amely ellenáll a mikrobák által okozott lebomlással és a hagyományos sejtlízis eljárásokkal szemben. Mechanikai kezelések, például fagyasztva szárítás, őrlés folyékony N-ben2, vagy gyöngyverés hatékony stratégiák az anaerob gombasejtek feltörésére, és javasolták a kémiai vagy kit alapú extrakciós módszerek alkalmazása előtt (Solomon et al., 2016b). A mechanikai kezeléseket azonban óvatosan kell végezni, mivel az intenzív mechanikai megszakítás hő által kiváltott DNS-nyírást okozhat, ami alacsony molekulatömegű DNS-t eredményez. További enzimatikus lízis is beépíthető az extrakciós munkafolyamatba, de eddig csak a litikázkezelésről számoltak be, amely javítja a DNS-hozamot és a tisztaságot (Solomon et al., 2016b).

Az anaerob gomba sejtfal gátjának leküzdése után a perzisztens RNS, fehérje és szénhidrát maradványok jelentős kihívást jelentenek a genomiális DNS tisztítása során. Solomon et al. (2016b) több kémiai és kit alapú extrakciós módszert hasonlított össze, köztük a Youssef és munkatársai által használt cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) protokollt. (2013) sikeres genomszekvenálása előtt P. ruminantium C1A. A kereskedelemben kapható PowerPlant ® Pro DNS izolációs készlet a Youssef és munkatársai által használt CTAB módszer mellett. (2013). Piromyces, Neocallimastix, és Anaeromyces nemzetségek. A kutatói közösségen belül azonban számos kutatónak szembesült kihívásokkal a megfelelő minőségű és/vagy molekulatömegű DNS izolálása, különösen a hagymás gombákból, annak ellenére, hogy egy vagy több ilyen megközelítést alkalmaztak.

A DNS extrakciós módszer mellett az anaerob gomba biomassza előállításához alkalmazott tenyésztési körülmények is befolyásolhatják a nukleinsav extrakciók hatékonyságát és az eredmények értelmezhetőségét. A magas DNS-hozamok érdekében az anaerob gombáknak aktívan szaporodniuk kell, ezért eddig 3-4 napos inkubációs időt alkalmaztak, ami a log-középső és a késői log fázisú tenyészetekhez vezetett (Youssef et al., 2013 Solomon et al., 2016a). ). A tenyészet térfogatára vonatkozó stratégiák a több kisebb párhuzamos tenyészet összevonásától (ami a hatékonyabb technikának tűnik) az 1-2 literes tenyészetekig terjedtek. A jövőbeni kísérletek során a zoospórák begyűjtése (Calkins és mtsai, 2016) a nukleinsav-kivonások potenciális kiindulópontja lehet, ami potenciálisan leegyszerűsíti az extrakciós eljárásokat, mivel ebből a növekedési fázisból hiányzik a visszahúzódó sejtfal. Ez azt is lehetővé tenné a tudósok számára, hogy szabványosabban hasonlítsák össze a különböző anaerob gombák genomjait és #x00026 epigenomjait, mivel minden sejt biztosabb lenne abban, hogy hasonló növekedési állapotban vannak. Ahhoz azonban, hogy ez a leghatékonyabb legyen, szükség van a kultúrák “szinkronizálására”, ahogyan azt korábban már megtették Saccharomyces cerevisiae (Hur et al., 2011).

A genom összeállítása során gyakorlati kihívásnak tekintették kis szennyező DNS-fragmensek jelenlétét a bendőfolyadékot tartalmazó tápközegben. Egyes kutatók ezért a bendőfolyadéktól mentes bazális tápközeghez fordultak (Lowe és mtsai., 1985) antimikrobiális szerekkel (penicillinnel, sztreptomicinnel és kloramfenikollal, Youssef és mtsai, 2013) kombinálva, hogy kiküszöböljék a háttér-DNS-t és a lehetséges DNS-szennyeződést. metanogénekből és baktériumokból származnak. Ezek a kis szennyező DNS-fragmensek azonban könnyen eltávolíthatók a DNS-méret-szelekció segítségével, amely jellemző a régóta olvasott PacBio Single Molecular Real-Time (SMRT) szekvenáló könyvtár előkészítésére. Például Haitjema et al. (2017) BluePippin tisztítást alkalmaztak, hogy csak nagy molekulatömegű (㸐 kb) DNS-fragmenseket válasszanak ki a genom szekvenálásához. P. finnis, N. californiae, és A. robustus. Ez az eljárás eltávolította a bendőfolyadékban jelen lévő szennyező DNS-t, amely jellemzően kis fragmentumok formájában van jelen, különösen a sterilitás érdekében a tápközeg autoklávozása után. A DNS izolálásának és tisztaságának további javítása érdekében rostos növényi anyagok helyett oldható cukrokat (például cellobiózt és glükózt) tartalmazó tápközeget alkalmaztak (Youssef et al., 2013 Haitjema et al., 2017). Noha ezek a növekedési feltételek a mai napig sikeresnek bizonyultak az összes szekvenált anaerob gomba esetében, még nem látható, hogy ez a termesztési megközelítés univerzálisan alkalmazható-e.

Sorrend, összeállítás és megjegyzések

A genom elemzéséhez Piromyces species E2, the first anaerobic fungal genome sequenced (made public in 2011), Sanger sequencing (read length 800� bp) in combination with Illumina Solexa (read length 2 × 75 bp) sequencing was employed followed by assembly with the use of Velvet (Haitjema et al., 2017). Due to the short reads generated with the sequencing techniques used, only a fragmented assembly with 39.7% of scaffolds representing gaps and high contig number was achieved. Similar results were observed with the genome sequencing of P. ruminantium C1A by Youssef et al. (2013) when only an Illumina 100 bp paired-end sequencing approach on a HiSeq 2000 approach was applied. The derived reads were not sufficient for whole genome assembly, as the resulting assembly (also done with Velvet) was highly fragmented with 82,325 contigs of which 32.4% were very short. To overcome these issues Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing with an average read length of 2,124 bp on a PacBio RS sequencing platform was performed (Youssef et al., 2013). The combination of both data sets lead to a non-fragmented final assembly allowing identification of large additional introns not detected when only using the Illumina data. The low GC (8.1%) content in the respective sequences and the frequent occurrence of microsatellites is likely to have led to the earlier lack of detection (Ross et al., 2013).

For the most recently sequenced genomes, of the species N. californiae, Pir. Finnis, és A. robustus, only PacBio SMRT sequencing was performed with high molecular weight DNA fragments (㸐 kb), which yielded far improved genome assemblies, and the highest quality anaerobic fungal genomes reported to date (Haitjema et al., 2017). Assembly with Falcon (https://github.com/PacificBiosciences/FALCON), FinisherSC (Lam et al., 2015) and Quiver (https://github.com/PacificBiosciences/GenomicConsensus) generated even better assemblies compared to the hybrid Illumina-SMRT approach used by Youssef et al. (2013). This improvement is likely a result of improved isolation of high molecular weight DNA and sequencing of larger fragments. A comparison of all currently available gut fungal genome assemblies is presented in Table 2. Due to the long-read sequence technology, SMRT sequencing on PacBio is currently the gold standard platform for sequencing anaerobic fungal genomes, being capable of sequencing low GC content genomes and delivering non-fragmented final assemblies with low contig number and superior scaffold length. As such, a number of novel anaerobic fungal isolates are currently in the queue awaiting genome sequencing via PacBio at the DOE-JGI to increase the pool of high-quality genomic assemblies.

2. táblázat. Summary statistics for the anaerobic fungal genomes assembled to date (modified from http://genome.jgi.doe.gov/Pirfi3/Pirfi3.info.html).

Whilst it is now possible to generate high quality anaerobic fungal genomes, it remains a challenge to assign correct functional annotations to novel anaerobic fungal genes. This becomes obvious, when the KOG data for all the available sequenced anaerobic fungal genomes is compared (Figure 4). On average 6% of the gene functions remained unknown and for 19% only a general function prediction was possible. Therefore, no function can be concisely described for 25% of the anaerobic fungal genes. Due to the lack of anaerobic fungal gene content in existing databases (e.g., KEGG and PFAM) accurate annotation of function is likely to remain a key challenge until this has been addressed. Interestingly, a recent study by Mondo et al. (2017) used epigenetic tools as a means to improve gene annotation across fungi. In particular, they showed that the early branching fungal lineage (including the anaerobic fungi) displayed unusual methylation islands (N6-methyldeoxyadenine) at transcriptional start sites of expressed genes (Mondo et al., 2017). As the ability to detect epigenetic modifiers (e.g., via PacBio) continues to improve, such tools will likely become invaluable to studying fungal genomes for which KOG, KEGG, and PFAM data are lacking.

4. ábra. Comparison of gene models identified by KOG classification in the anaerobic fungal genomes sequenced to date. Percentages of the predicted gene models identified are shown due to the differences in genome assembly size between the organisms (see Table 2), with the percentage values for two categories (Function unknown & General function prediction only) also directly stated on the bars. Data sourced from Youssef et al. (2013) and Haitjema et al. (2017).

Despite these functional annotation challenges, however, analysis of the genome of P. ruminantium C1A by conventional annotation strategies (see Table 2) discovered genomic traits potentially specific for the Neocallimastigomycota phylum and adapted to their anaerobic life-style (Youssef et al., 2013). Reconstruction of the Pecoramyces hydrogenosome allows the metabolism of energy production in anaerobic fungi to be clearly followed, revealing an incomplete tricarboxylic acid cycle and mixed-acid fermentation dependent energy formation. Characterization of the carbohydrate active enzymes (CAZymes) in P. ruminantium C1A also showed a huge and diverse range of lignocellulolytic genes, comprising 357 glycoside hydrolases (GHs), 24 polysaccharide lyases (PLs) and 92 carbohydrate esterases (CEs). From the genome of Fibrobacter succinogenes, a rumen bacterium specialized in lignocellulose utilization, 95 GHs, 5 PLs and 17 CEs were characterized, highlighting the extensive carbohydrate active enzymatic systems possessed by P. ruminantium C1A.

More recently, additional insights into anaerobic fungal CAZymes were generated from the analysis of four high quality anaerobic fungal genomes: Piromyces sp. E2, N. californiae, P. finnis, és A. robustus (Haitjema et al., 2017 genomes available via the Mycocosm website http://genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/index.jsf). As expected, a wealth of CAZyme domains were identified across different regions of the genome, including hundreds of non-catalytic dockerin domain (NCDD) containing proteins native to the anaerobic fungi (Haitjema et al., 2017). Such domains are associated with fungal cellulosomes, which are multi-enzyme complexes produced to accelerate lignocellulose degradation (Gilmore et al., 2015). In particular, development of Hidden Markov Models (HMMs) based on integrated proteomic data obtained for these strains revealed a large, non-catalytic protein domain unique to the anaerobic fungi, later identified as scaffoldin domains for fungal cellulosomes (Haitjema et al., 2017). The high resolution of these anaerobic fungal genomes also enabled comparative genomic analyses, which for the first time quantified the frequency of horizontal gene transfer of CAZyme domains from anaerobic bacteria that are also resident in the rumen environment (Haitjema et al., 2017). Overall, these genomes have laid the foundation to interpret not only metabolic behavior of the anaerobic fungi, but also unique metabolites likely to be produced by these organisms—presumably to fine tune their interaction with other microbes within the rumen microbiome.

Metagenomics

The rumen microbial community is a consortium of bacteria, archaea, anaerobic fungi, and protozoa. Bacteria and archaea represent the major proportion of microbes in terms of cell count, however, the eukaryotic anaerobic fungi and protozoa also represent a large proportion in terms of microbial biomass. To date, most rumen metagenomics studies have focused on the bacterial and archaeal microbial communities (Hess et al., 2011 Pope et al., 2012 Wang et al., 2013 Kamke et al., 2016 Pitta et al., 2016) and lack targeted analysis of eukaryotic genes. Only a few of the mentioned studies detected eukaryotic genes at a low level (Hess et al., 2011 Wang et al., 2013 Pitta et al., 2016). In addition, Brulc et al. (2009) analyzed eukaryotic SSU genes and environmental gene tags (EGTs) from metagenomics data derived from fibrous and non-fibrous rumen samples. No fungal sequences were identified by phylogenetic analysis, but 19% of the detected eukaryotic EGTs were assigned to fungi, not comprising anaerobic fungi expected in the sampled environment. These results are confounding, as they depict rumen eukaryotes as a negligible group in the rumen microbial ecosystem. However, the absence of these eukaryotes may not have been responsible for these findings.

The lack of eukaryotic genes detected in metagenomics studies to date are likely to be caused by sampling strategies excluding eukaryotes, the low eukaryotic DNA content in the rumen (relative to their microbial biomass) and their scarce genetic information, limiting bioinformatics analysis and annotation of eukaryotic genes (Qi et al., 2011). Activity based screening of a dairy cow metagenome library cloned in Escherichia coli, in which anaerobic fungi accounted for 5% of the identified coding sequences, showed that if suitable methods were applied all existing rumen microbial groups were detected (Ferrer et al., 2005).

From a rumen perspective, there is a need to link the available anaerobic fungal genomic data with ecology and function and thus build a more comprehensive database. On this basis, bioinformatics approaches able to identify and annotate anaerobic fungal genes can be developed, enabling scientists to screen rumen metagenome data sets for anaerobic fungal gene content. This will prevent these important fiber degraders from being overlooked in future studies. Furthermore, sampling strategies for future rumen metagenomics studies need to be adjusted to anaerobic fungal cell size (e.g., large enough pore sizes when using nylon bags), growth characteristics (e.g., their growth inside plant fibers as rumen fluid only contains their zoospores) and behavior during nucleic acid extractions (see sections Requirements for culturing and genomic DNA isolation and Future perspectives).


What is PCR

PCR refers to a technique in biotechnology that allows the analysis of a short sequence of DNA by amplifying a selected segment of DNA. It is comparatively a sensitive method as very small volumes are required by a single reaction. The technique is based on the ability of DNA polymerase to synthesize new strands of DNA to the offered template strand in a complementary manner. The reaction mixture of PCR is composed of DNA polymerase, DNA nucleotides, primers, the DNA template to be amplified, and magnesium. The amplification is carried out inside a thermocycler. DNA polymerase should be heat resistant as high temperatures are used in this reaction. The two types of DNA polymerases used in PCR are Taq DNA polymerase and Pfu DNA polymerase. Taq DNA polymerase is widely used in PCR.

DNA polymerase requires a pre-existing DNA strand at the 3′ end to synthesize a new strand. Hence, an oligonucleotide primer is added to the reaction mixture for the initiation of DNA synthesis. The requirement of a primer in PCR allows the amplification of only a specific region in the template. The target sequence is flanked by forward and reverse primers. At the end of a PCR, new copies of a specific DNA sequence, which are called amplicons, are accumulated in billions. The components of the PCR should be optimized in such a way to improve PCR performance while minimizing failure. The standard PCR reaction is shown in 1.ábra.

Figure 1: PCR

Steps of PCR

The three steps of a PCR is described below.

  1. Denaturation – The double-stranded DNA template is separated into two single strands by heating to 94-95 °C.
  2. Lágyítás – Forward and reverse primers bind to the complementary sequences in the template. The temperature depends on the melting temperature of the primer combination.
  3. Primer extension – DNA polymerase enzyme extends each primer at their 3’end by adding complementary bases to the growing strand. The optimum temperature of Taq polymerase, i.e., 72 °C, is used as the temperature in the extension step. The time of the extension depends on the number of base pairs in the template strand.

The three steps are repeated for 28-35 times. Agarose gel electrophoresis is used in the size fractionation of PCR products. The product is stained by ethidium bromide and is observed under UV. The PCR product or the amplified DNA can be used in cloning, sequencing or genotyping.


Semiconductor Sequencing pH-mediated sequencing, silicon sequencing or semiconductor sequencing

is another sequencing by synthesis method that is based on detection of H + ions released during the polymerization of DNA. With this technique, Life Technologies released the Personal Genome Machine in 2011 as, "a rapid, compact and economical bench top machine."

One great thing about this technology is that there is no need for a modified nucleotide, or oligonucleotides as we have seen in reversible chain terminators and Sanger sequencing.

Eljárás

1) Emulsion PCR

Emulsion PCR allows for enriched beads to be placed in microwells (see micro-machined well). Just underneath these microwells are pH sensors that are able to detect the most miniscule changes in pH.

Microwell containing the DNA template with an ISFET ion sensor. Each microwell is loaded up with a bead from emulsion PCR.

Remember that pH is just a logarithmic scale that measures the amount of hydrogen ions (H + ) in a solution. The lower the pH, the more hydrogen ions there are.

2) dNTP&aposs flooded

A particular dNTP is released. If the growing sequence requires that particular dNTP, then a H + ion and pyrophosphate group is released.

Hydrogen ion being released with DNA polymerization.

3) Signal detection

The signal is picked up by the ISFET sensor and translated into a base call. Any homopolymers (multiple of the same base) result in a strong signal.

4) Wash and repeat

Unattached dNTP molecules are washed out, and the cycle repeats with a new dNTP.

Elemzés

The Ion Proton System was release from Life Technologies in 2012.
Ion Torrent Personal Genome MachineIon Proton System
Bases per run 1 Gb Up to 10Gb
Read Length 35-400 bp 200 bp
Run time 4,5 óra 2-4 hours
  • Rapid sequencing speed.
  • Low upfront and operating costs.
  • Real-time sequencing.
  • No need for modified nucleotides or special enzymes.
  • No need for expensive optical equipment.
  • Difficult to capture homopolymer regions such as CCCCCC. This results in multipled hydrogen ions going off at once, and a greater pH change. However, there is a loss of resolution as the number of repeated elements increases.
  • Short read lengths compared to Sanger sequencing and pyrosequencing.
  • Rate limited by dNTP flow.

Videók

Watch how the Ion Torrent system works.

A more detailed look into the Ion Proteon Sequencer.

Hivatkozások


TTP provided a complete range of technology innovation and product development services to Dymo as they built a digital product range.

Client

We use cookies to improve your experience on our site. To find out more, read our updated privacy policy. More information.


Detailed responses to reviewers' comments.

    1. Evans WE, Hon YY, Bomgaars L, et al.: Preponderance of thiopurine S-methyltransferase deficiency and heterozygosity among patients intolerant to mercaptopurine or azathioprine. J Clin Oncol. 2001 19(8): 2293–2301. PubMed Abstract 2. Relling MV, Gardner EE, Sandborn WJ, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for thiopurine methyltransferase genotype and thiopurine dosing. Clin Pharmacol Ther. 2011 89(3): 387–391. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 3. Mizzi C, Peters B, Mitropoulou C, et al.: Personalized pharmacogenomics profiling using whole-genome sequencing. Pharmacogenomics. 2014 15(9): 1223–1234. PubMed Abstract | Publisher Full Text 4. Browning SR, Browning BL: Rapid and accurate haplotype phasing and missing-data inference for whole-genome association studies by use of localized haplotype clustering. Am J Hum Genet. 2007 81(5): 1084–1097. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 5. Browning SR, Browning BL: Haplotype phasing: existing methods and new developments. Nat Rev Genet. 2011 12(10): 703–714. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 6. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, et al.: Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012 40(15): e115. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 7. Li H, Durbin R: Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatika. 2009 25(14): 1754–1760. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 8. Langmead B, Salzberg SL: Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012 9(4): 357–359. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 9. Chaisson MJ, Tesler G: Mapping single molecule sequencing reads using basic local alignment with successive refinement (BLASR): application and theory. BMC Bioinformatics. 2012 13: 238. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 10. Kiełbasa SM, Wan R, Sato K, et al.: Adaptive seeds tame genomic sequence comparison. Genome Res. 2011 21(3): 487–493. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 11. Zanger UM, Schwab M: Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacol Ther. 2013 138(1): 103–41. PubMed Abstract | Publisher Full Text 12. Horton R, Gibson R, Coggill P, et al.: Variation analysis and gene annotation of eight MHC haplotypes: The MHC Haplotype Project. Immunogenetics. 2008 60(1): 1–18. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 13. Van der Auwera GA, Carneiro MO, Hartl C, et al.: From FastQ data to high confidence variant calls: The Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 2013 11(1110): 11.10.1–11.10.33. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 14. Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al.: The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatika. 2009 25(16): 2078–2079. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 15. Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, et al.: Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays. Tudomány. 2010 327(5961): 78–81. PubMed Abstract | Publisher Full Text 16. Frazer KA, Ballinger DG, Cox DR, et al.: A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Természet. 2007 449(7164): 851–861. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 17. Leckband SG, Kelsoe JR, Dunnenberger HM, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for HLA-B genotype and carbamazepine dosing. Clin Pharmacol Ther. 2013 94(3): 324–8. PubMed Abstract | Free Full Text 18. Martin MA, Hoffman JM, Freimuth RR, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Guidelines for HLA-B Genotype and Abacavir Dosing: 2014 update. Clin Pharmacol Ther. 2014 95(5): 499–500. PubMed Abstract | Free Full Text 19. Hershfield MS, Callaghan JT, Tassaneeyakul W, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for human leukocyte antigen-B genotype and allopurinol dosing. Clin Pharmacol Ther. 2013 93(2): 153–8. PubMed Abstract | Free Full Text 20. Zhou SF: Polymorphism of human cytochrome P450 2D6 and its clinical significance: part II. Clin Pharmacokinet. 2009 48(12): 761–804. PubMed Abstract | Publisher Full Text 21. Crews KR, Gaedigk A, Dunnenberger HM, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for cytochrome P450 2D6 genotype and codeine therapy: 2014 update. Clin Pharmacol Ther. 2014 95(4): 376–82. PubMed Abstract | Free Full Text 22. Hicks JK, Swen JJ, Thorn CF, et al.: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guideline for CYP2D6 and CYP2C19 genotypes and dosing of tricyclic antidepressants. Clin Pharmacol Ther. 2013 93(5): 402–8. PubMed Abstract | Free Full Text 23. Odelberg SJ, Weiss RB, Hata A, et al.: Template-switching during DNA synthesis by Thermus aquaticus DNA polymerase I. Nucleic Acids Res. 1995 23(11): 2049–2057. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 24. Listgarten J, Brumme Z, Kadie C, et al.: Statistical resolution of ambiguous HLA typing data. PLoS Comput Biol. 2008 4(2): e1000016. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text 25. Brownstein CA, Margulies DM, Manzi SF: Misinterpretation of TPMT by a DTC genetic testing company. Clin Pharmacol Ther. 2014 95(6): 598–600. PubMed Abstract | Publisher Full Text 26. Stanulla M, Schaeffeler E, Flohr T, et al.: Thiopurine methyltransferase (TPMT) genotype and early treatment response to mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA. 2005 293(12): 1485–1489. PubMed Abstract | Publisher Full Text 27. Ammar R, Paton TA, Torti D, et al.: Nanopore reads and alignments. figshare. 2015. Data Source 28. Pratt VM, Zehnbauer B, Wilson JA, et al.: Characterization of 107 genomic DNA reference materials for CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, VKORC1, és UGT1A1: a GeT-RM and Association for Molecular Pathology collaborative project. J Mol Diagn. 2010 12(6): 835–846. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text

Looking for the Open Peer Review Reports?

They can now be found at the top of the panel on the right, linked from the box entitled Open Peer Review. Choose the reviewer report you wish to read and click the 'read' link. You can also read all the peer review reports by downloading the PDF.


Nézd meg a videót: Real-time PCR (Augusztus 2022).