Információ

Mi a különbség a riasztókapcsolók és a ribokapcsolók között?

Mi a különbség a riasztókapcsolók és a ribokapcsolók között?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Az Alarmone egy intracelluláris szignálmolekula, amely kemény környezeti tényezők hatására keletkezik. Szabályozzák a génexpressziót transzkripciós szinten. A riboswitch egy hírvivő RNS-molekula szabályozó szegmense, amely egy kis molekulához kötődik, ami az mRNS által kódolt fehérjék termelődésének megváltozását eredményezi, és a környezeti változások érzékelésének módjaként működik.

Olvastam néhány közleményt ("ZTP 5-Amino 4-lmidazol Carboxamide Riboside S-Triphosphate): A Proposed Alarmone for 1O-Formyl-Tetrahydrofolate Deficiency", Bochner 1982; „Egy ősi ribokapcsoló osztály a baktériumokban szabályozza a purin bioszintézist és az egyszén-anyagcserét” Kim 2015), amely azt vizsgálja, hogy a ZTP hogyan hozhat változásokat 10f-THF hiány esetén. Bochner (1982) számos kísérletben a ZTP-t javasolta a 10f-THF riasztójaként; Bochner egyes feltételezései nem biztos, hogy teljesen helytállóak, és egy későbbi tanulmány nem képes megismételni néhány kísérletet. Később Kim (2015) a ZTP-t javasolta riboswitchként.

Nem vagyok teljesen tisztában az „alarmone” és a „riboswitch” fogalma közötti különbségekkel. Úgy tűnik számomra, hogy Bochner és Kim is gyakorlatilag ugyanazt a tézist javasolja.


Most hallom először az alarmone szót, úgyhogy viseljetek el, rendben?

"Az Alarmone egy intracelluláris szignálmolekula, ami durva környezeti tényezők hatására keletkezik. Szabályozzák a génexpressziót transzkripció szinten" <- ez valószínűleg a transzkripciós faktorok aktiválására/gátlására utal, meg ilyesmi. Ha kicsit tovább nézzük azt a wikipédia-cikket, ahonnan a leírást másoltad, azt látjuk, hogy a ppGpp riasztónak számít.

A wikipédia ppGpp-ről szóló cikke szerint (https://en.wikipedia.org/wiki/Guanozin_pentafoszfát) látunk pl. ez a vonal "Amikor (p)ppGpp asszociál a promoterhez, az befolyásolja az RNS-polimeráz enzim azon képességét, hogy kötődjön és transzkripciót kezdeményezzen", így ez a riasztó úgy hathat, hogy gátolja az RNS polimeráz azon képességét, hogy kötődjön a promoterhez.

A riboswitch viszont egy szerkezeti elem egy RNS molekulán belül, amely konformációs változást okoz esetén ligandumot köt. Ez a konformációs változás hatással van a transzkripcióra vagy a transzlációra stb. Így egy riasztó valószínűleg kapcsolódhat egy ribokapcsolóhoz, hogy kifejtse hatását, de a riboswitch egy egészen specifikus dolog. Néhány mechanizmusról a wikipédia cikkben olvashat: https://en.wikipedia.org/wiki/Riboswitch

Tehát alapvetően gondoljunk az alarmonokra mint jelzőmolekulákra és a ribokapcsolókra mint szerkezeti elemekre az átiratokban, amelyek szabályozzák a génexpressziót. esetén ligandumkötés.


Fordított ismétlés

An fordított ismétlés (vagy IR) egy egyszálú nukleotidszekvencia, amelyet lefelé a fordított komplementje követ. [1] A kezdeti szekvencia és a fordított komplement közötti nukleotidszekvencia bármilyen hosszúságú lehet, beleértve a nullát is. Például az 5'---TTACGnnnnnn CGTAA---3' egy fordított ismétlődő szekvencia. Ha a közbülső hosszúság nulla, az összetett sorozat egy palindrom szekvencia.

Mind a fordított ismétlődések, mind a direkt ismétlődések olyan típusú nukleotidszekvenciákat alkotnak, amelyek ismétlődően fordulnak elő. Ezek az ismétlődő DNS-szekvenciák gyakran egy nukleotidpártól a teljes génig terjednek, míg az ismétlődő szekvenciák közelsége széles körben elterjedt és egyszerű tandem tömbök között változik. [2] A rövid tandem ismétlődő szekvenciák létezhetnek néhány kópiaként egy kis régióban, vagy akár több ezer kópiaként, amelyek a legtöbb eukarióta genomjában szétszóródnak. [3] A mintegy 10-100 bázispárból álló ismétlődő szekvenciákat miniszatelliteknek, míg a rövidebb, többnyire 2-4 bázispárból álló ismétlődő szekvenciákat mikroszatellitáknak nevezzük. [4] A leggyakoribb ismétlődések közé tartoznak a dinukleotid ismétlődések, amelyekben az egyik DNS-szálon az AC, a komplementer szálon pedig a GT bázis található. [2] A genom egyes elemei egyedi szekvenciákkal exonként, intronként és szabályozó DNS-ként funkcionálnak. [5] Bár az ismétlődő szekvenciák legismertebb lokuszai a centromer és a telomer, [5] a genom ismétlődő szekvenciáinak nagy része a nem kódoló DNS között található. [4]

A fordított ismétlődéseknek számos fontos biológiai funkciója van. Meghatározzák a határokat a transzpozonokban, és jelzik azokat a régiókat, amelyek képesek önkomplementer bázispárosításra (egy szekvencián belüli régiók, amelyek bázispárosodhatnak egymással). Ezek a tulajdonságok fontos szerepet játszanak a genom instabilitásában [6], és nemcsak a sejtek evolúciójához és a genetikai sokféleséghez [7], hanem a mutációkhoz és betegségekhez is hozzájárulnak. [8] E hatások részletes tanulmányozása érdekében számos programot és adatbázist fejlesztettek ki, amelyek segítik a különböző genomokban lévő fordított ismétlődések felfedezését és megjegyzéseit.


Stratégia és gyógyszerkutatás

2.26.5.1 Riboswitchek

A ribokapcsolók bizonyos mRNS-ekben jelenlévő metabolitkötő domének. 85,86 A mai napig kimutatták, hogy a riboswitchek bakteriális, régészeti, gombás és növényi mRNS-ekben fordulnak elő. Bár a mai napig nem azonosították, lehetséges, hogy az emlős mRNS-ekben is előfordulnak. A ribokapcsolók jellemzően két domént tartalmaznak, egy aptamer domént, amely a metabolit megkötéséért és egy másik, a genetikai szabályozásért felelős domént. A riboswitch ligandumok példái közé tartozik a glicin, koenzim B12, tiamin, flavin mononukleotidok, S- adenozil-metionin és guanin. 87,88 Mint ilyenek, a riboswitchek egyedülálló céllehetőséget jelentenek a gyógyszerek számára. Elvileg lehetővé kell tenni olyan agonisták és antagonisták azonosítását, amelyek a fehérjereceptorokkal analóg módon modulálják a riboswitch működését. Az ilyen megközelítést érvényesítő tanulmányokat azonban még nem publikálták.


Ribozimek

Az RNS katalitikus funkciójával kapcsolatos erőfeszítések többsége a természetes és in vitro kiválasztott ribozimek és kétértékű kation-modulált katalitikus funkcióik. Sokkal kevesebb erőfeszítést fordítottak az RNS kémiai reakciókat katalizáló képességére, és az ilyen folyamatokat elősegítő RNS-alapú állványok azonosítására.

A Pistol Ribozyme egy pszeudoknot-hajtást alkalmaz, amely megkönnyíti a helyspecifikus, soron belüli hasítást

A kisméretű, önhasító nukleolitikus ribozimek területét felpezsdítette a twister, twister-sister, pisztoly és csatabárd ribozimek közelmúltbeli felfedezése. Beszámolunk a kristályszerkezetéről env25 pisztolyribozim, amely egy kompakt tercier architektúrát vesz fel, amelyet egy beágyazott pszeudoknot hajtás stabilizál. A G-U hasítási hely szétszóródott konformációt vesz fel, a G modellezett 2'-O-jának egyenes vonalba rendezésével, hogy megtámadja a szomszédos, hasítandó P-O5' kötést. Az erősen konzervált G40 (N1 pozíció) és A32 (N3 és 2’-OH pozíciók) aminosavakat úgy rendezik el, hogy általános bázisként, illetve általános savként működjenek, hogy felgyorsítsák a hasítási kémiát, szerepüket mutánsokon végzett hasítási tesztekkel igazolják, és megnövekedett p értéket.Ka 4,7 az A32 esetében. A pisztolyribozim szerkezete határozza meg, hogy az általános és helyi topológiák hogyan diktálják a soron belüli elrendezést a G-U hasítási helyén, a mutánsokon végzett hasítási tesztekkel azonosítják a sav-bázis katalizált hasítási kémiában részt vevő kulcsfontosságú maradékokat.

Ren, A., Vusurovic, N., Gebetsberger, J., Gao, P., Juen M., Kreutz, C., Micura, R. & Patel, D. J. (2016). A pisztoly ribozim egy beágyazott pszeudoknot hajtást alkalmaz, amely megkönnyíti a helyspecifikus, soron belüli önhasítást. Nat. Chem. Biol. 12, 702-708.

A twister ribozim hasítási helye

A kisméretű önhasító nukleolitikus ribozimek katalitikus doméneket tartalmaznak, amelyek felgyorsítják a foszfodiészter gerincek helyspecifikus hasítását/ligálását. A Ronald Micura laboratóriummal (Innsbrucki Egyetem, Ausztria) való együttműködés részeként beszámoltunk a 2,9 Å kristályszerkezetről. env22 twister ribozim, amely egy kompakt tercier redőt vesz fel, amelyet ko-helikális halmozás, kettős pszeudoknot képzés és hosszú távú párosítási kölcsönhatások stabilizálnak. Az U-A hasítási hely széthúzott konformációt vesz fel az U modellezett 2'-O-jával, amely a szomszédos, hasítandó P-O5' kötés elleni támadásra van elhelyezve. Mind az invariáns guanozin, mind a Mg 2+ közvetlenül koordinálódik a nem áthidaló foszfát-oxigénekkel az U-A hasítási lépésben, ahol az előbbi a katalízishez, az utóbbi pedig a szerkezeti integritáshoz járul hozzá. A kulcsfontosságú mutációk hasítási aktivitásra gyakorolt ​​hatása egy invariáns guanozint azonosított, amely hozzájárul a katalízishez. Az in-line szerkezetünk igazodik env22 A twister ribozimet összehasonlítják a twister ribozim két, a közelmúltban bejelentett off-line ortogonálisan elrendezett szerkezetével, amelyek hasonló globális redőket vesznek fel, de a hasítási hely körüli konformációs jellemzőikben különböznek.

Ren, A., Kosutic, M., Rajashankar, K. R., Frener, M., Santner, T., Westhof, E., Micura, R. és Patel, D. J. (2014). In-line illesztés és Mg 2+ koordináció a twister ribozim hasítási helyén. Nat. Commun. 15: 5534.

Kosutic, M., Neuner, S., Ren, A., Flur, S., Wunderlich, C., Mayrhofer, E., Vusurovic, N., Seikowski, J., Westhof, E., Hobartner, C., Patel, DJ, Kreitz, C. és Micure, R. (2015). Mini-twister változat és a maradékok/kationok hatása a ribozim osztály foszfodiészter hasítási kémiájára. Angew. Chemie Int. Edn. 54, 15128-15133.

Diels-Éger ribozim

A szerkezeti és mechanikai jellemzés rendkívül érdekes rendszere a Diels-Alder ribozim, amelyet munkatársunk, Andres Jaschke laboratóriumában azonosítottak a Heildelbergi Egyetemen (Németország), mérsékelt mérete, 20 000-szeres sebességfokozása és dokumentált enantiomer-szelektivitása miatt. katalizált ciklizációs reakció. A katalitikus kötőzsebnek különböző méretű és formájú ligandumokat kell befogadnia, ahogy a reakció a reaktánsoktól az átmeneti állapotú köztitermékekké válik a termékekké. Megoldottuk az antracén és az N-pentil-maleimid ciklizációját katalizáló Diels-Alder ribozim kristályszerkezetét kötetlen állapotban és a reakciótermékkel komplexben. Az RNS egy λ-alakú beágyazott pszeudoknot architektúrát vesz fel, amelynek előre kialakított hidrofób zsebe alakja pontosan komplementer a reakciótermékhez. Az RNS hajtogatását és a termékkötést kiterjedt halmozás és hidrogénkötés határozza meg, míg a sztereoszelekciót a katalitikus zseb alakja szabályozza. A katalízist nyilvánvalóan a közelség, a sztérikus komplementaritás és az elektronikus hatások kombinációjával érik el. Szerkezeti párhuzamokat figyeltünk meg a ribozim- és antitest-katalizált Diels-Alder szén-szén kötésképző reakciók egymástól függetlenül kialakult katalitikus zsebarchitektúrájában. A Diels-Alder ribozim szabad és termékhez kötött állapotában azonosított felismerési elveinek platformot kell biztosítaniuk testreszabott specifitású és szelektivitású, tervezett katalizátorok tervezéséhez.

Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., Tereschko, V., Skripkin, E., Hobartner, C., Polonskaia, A., Phan, AT, Wombacher, R., Micura, R., Dauter , Z., Jaschke, A. és Patel, DJ (2005). A Diels-Alder ribozim által katalizált szén-szén kötés kialakulásának szerkezeti alapja. Természeti Struktúra. Mol. Biol. 12, 218-224. [PubMed Abstract]


Eredmények és vita

A hősokk-stressz válasz monitorozási rendszerei B. subtilis

Ebben a tanulmányban a stresszre adott válaszokat vizsgáltuk B. subtilis különböző, de kapcsolódó hősokk-körülmények alkalmazásával: (i) növekedés és hősokk 50 °C-on, amely hőmérséklet nem halálos B. subtilis de már jelentős hősokk-választ indukál a chaperonok és proteázok fokozott expressziójával, (ii) ellenáll a súlyos hősokknak azáltal, hogy méri az exponenciálisan növekvő sejtek túlélését, amelyek 53 °C-on súlyos, halálos hősokknak vannak kitéve, ami szintén a hőrezisztencia (37/53 °C) mértékének tekintették (1A. ábra), és (iii) a hőtolerancia kialakulását az exponenciálisan növekvő sejtek túlélésének mérésével, amelyeket enyhe, 48 °C-on, 15 percig tartó enyhe elősokkolás hatására a kitettség előtt az 53 °C (48/53 °C) súlyos hősokkhoz (1A. ábra). Kísérletileg megállapítottuk, hogy az 55 °C a megfelelő hőmérséklet az erős hőség hatásának vizsgálatára B. subtilis agarlemezeken növekvő sejtek. A különféle hőviszonyoknak való kitettség mellett más potenciálisan proteotoxikus stresszeket is megvizsgáltunk, mint például a só- és az oxidatív stresszt [9,17,48].

(A) A termotolerancia protokoll vázlata. A 37 °C-on exponenciálisan növekvő sejttenyészetet felosztjuk és 48 °C-on inkubáljuk, vagy 37 °C-on hagyjuk. 15 perc elteltével mindkét tenyészetet 53 °C-ra toljuk. (B-F) A pGpp, ppGpp és pppGpp szintjei különböző körülmények között. A csillagok (*) a jelentőségét jelzik (padj. ≤ 0,05) kombinált pGpp, ppGpp és pppGpp szintek a Kruskal-Wallis és Dunn-Bonferroni teszt szerint. (B) A sejteket minimális tápközegben tenyésztettük OD-ig600 0,4 és 50 °C-ra helyezzük át. Négy független kísérlet átlagát és standard hibáját (SEM) mutatjuk be. (C) A sejteket minimális tápközegben növesztettük a közepes exponenciális fázisig (OD600

0,4) és DL-norvalinnal (NV 0,5 mg ml -1 ), szerin-hidroxamáttal (SHX 5 μg ml -1 ), NaCl-tal (6%) vagy diamiddal (0,5 mM) kezeltük 10 percig. Három-négy független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. (D) A vad típusú sejteket 37 °C-on növesztettük, és 15 percre 48 °C-ra toltuk (sokk előtt), majd 53 °C-ra vagy közvetlenül 53 °C-ra. A mintákat 2, 5 és 15 perckor vettük. Négy független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. (E) Vad típusú sejtek vagy törzsek a (p)ppGpp szintetázokban mutációkkal (relP/Q - : BHS204, rel E324V: BHS709 (p)ppGpp°: BHS214) hősokkkal vagy anélkül kezeltük 50 °C-on 2 percig. Három-hat független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. A (p)ppGpp° mutánsban (a mennyiségi meghatározás alsó határa: 0,26 pmol x ml-1 x OD-1) nem észleltünk riasztási csúcsokat. A csillagok (*) jelentős változásokat jeleznek (p ≤ 0,05) kombinált pGpp, ppGpp és pppGpp szintek Welch szerint t-teszt. (F) A kloramfenikol hatása az alarmon felhalmozódására stressz alatt. A sejteket minimál tápközegben növesztettük, és 10 percig DL-norvalinnal (0,5 mg ml-1 ), 50 °C-on 2 percig hősokkkal vagy 10 percig diamiddal (1 mM) kezeltük. Egy részhez egyszerre klóramfenikolt (Cm, 25 μg ml -1 ) adtunk. Két független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be.

A celluláris (p)ppGpp szintje megnő a hősokk expozíciója során

A hő SR-re gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához először felmértük a pGpp, ppGpp és pppGpp ((p)ppGpp) riasztók intracelluláris szintjét a hősokk reakció során 50 °C-on. E három alarmon sejtkoncentrációjának összegét tekintjük a teljes (p)ppGpp alarmon koncentráció mértékének. A sejteket 37 °C-on, minimális tápközegben növesztettük 600 nm-es optikai sűrűségig (OD600 nm). 2, 5 és 10 perces 50 °C-on végzett inkubálás után a riasztószerek intracelluláris szintjét folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával (LC-MS) vizsgáltuk (lásd Módszerek) (1. ábra) [49].

Már 2 perc elteltével a riasztószintek kb. hétszeres (13-88 pmol OD-1 ml-1) (1B. ábra), ami hasonló tartományban van a DL-norvalin (NV) által kiváltott aminosav-éhezés során megfigyelt tartományban (1C. ábra). Ezenkívül a szerin-hidroxamáttal (SHX) végzett kezelés során jelentősen megnövekedett (p)ppGpp-szintek figyelhetők meg, 6%-os (w/v) NaCl vagy 0,5 mM diamid, a tiolcsoportok erős oxidálószere által kiváltott sóstressz (1C. ábra). 50,51]. Meg kell jegyezni, hogy a (p) ppGpp szintek csak átmenetileg emelkedtek a hősokk alatt, és 10 perc elteltével szinte az alapszintre tértek vissza (1B. ábra). Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a nem halálos hősokknak való kitettség 50 °C-on a (p)ppGpp riasztószint gyors, de átmeneti növekedését idézi elő.

Felmértük a riasztóanyagok szintjét hőrezisztencia körülmények között (37/53 °C) és feltöltés után (48 °C) hőtolerancia körülmények között (48/53 °C) (1A és 1D ábra). Átmenetileg emelkedett (p)ppGpp-szinteket figyeltünk meg (1D. ábra), azonban a riasztási szintek különösen magasak voltak a 37/53 °C-os erős hősokk-eltolódás során (körülbelül 25-szörös növekedés), és az indukció is alacsonyabb volt mind a 37. /48 °C vagy 48/53 °C körülmények között (kb. 2-3-szoros növekedés) (1D. ábra). Úgy tűnik, hogy a 48 °C-on történő feltöltés korlátozza a hőtoleráns sejtek riasztóanyag-szintézisét, amikor ezt követően 53 °C-on halálos hősokknak vannak kitéve (1D. ábra).

Az SR aktiválása során fellépő (p)ppGpp szintézise pl. szerin-hidroxamáttal vagy DL-norvalinnal végzett kezeléssel in B. subtilis a celluláris GTP-szint gyors csökkenése kíséri [33], amit szintén megfigyeltünk sóval vagy diamiddal való érintkezés után (S1A ábra). Érdekes módon nem figyeltünk meg a GTP-szint csökkenését 50 °C-os expozíció után (S1A ábra). A GTP szint viszonylag magas szinten volt (S1B ábra) a 37/48 °C, 37/53 °C és 48/53 °C hőmérséklet-emelkedés során. Azonban 15 perccel az emelt hőmérsékletnek való kitettség után a GTP szint minden hőmérséklet-emelkedésnél csökkent (S1B ábra).

Összességében azt tapasztaltuk, hogy a hősokknak való kitettség a (p)ppGpp riasztások gyors, de csak átmeneti növekedését idézi elő, ami nem befolyásolta azonnal a transzkripciós választ szabályozó sejt GTP-szintjét [33]. Ezért úgy tűnik, hogy a riasztási szintek fokozatos választ mutathatnak a hőterhelésre és a hőmérsékleti szintekre.

A rel aktivitás a (p)ppGpp szintézis fő forrása a stresszválasz során

Ezt követően a (p)ppGpp forrásának azonosítását tűztük ki célul a hőstressz reakció során. Ebből a célból olyan mutációkkal rendelkező törzsek, amelyek megzavarják az általa kódolt fehérjék (p)ppGpp szintetáz aktivitását. relP és relQ (relP/Q - törzs) vagy rel (rel E324V inaktív szintetáz) vizsgáltuk (p)ppGpp felhalmozódását és GTP-szintjét hősokk hatására 50 °C-on 2 percig (1E. ábra és S1C. ábra). Kontrollként a (p)ppGpp felhalmozódást egy olyan (p)ppGpp° törzsben is mértük, amely mindhárom alarmon szintetáz génben inaktiváló mutációkat hordozott.relP E154V , relQ E139V és Δrel) (1E. és 2E. ábra). Ezenkívül a (p)ppGpp-függő transzkripciója hpf Az SR aktiválásához kiegészítő kiolvasásként használták (S1D ábra) [52,53].Ahogy az várható volt, a (p)ppGpp° mutánsban semmilyen körülmények között nem detektáltak alarmon nukleotidokat [28] (1E. ábra). Megfigyeltük, hogy hőhatás hatására a relP/K - (relP E154V , relQ E139V ) törzs a (p)ppGpp felhalmozódását (1E. ábra) és a hpf A vad típusú sejtekhez hasonló transzkriptum (S1D ábra), ami azt jelzi, hogy a RelP és a RelQ aktivitása nélkülözhetetlen a (p)ppGpp termeléséhez hőstressz alatt. Ezzel szemben a rel Az E324V törzs csak kis mennyiségű (p)ppGpp-t halmozott fel, rövid hőhatás után még alacsonyabb szinten (1E. ábra). Következetesen felszabályozása a hpf transzkriptum válaszként a stresszre is károsodott a rel E324V törzs (S1D ábra). Ezek az eredmények együttesen erősen arra utalnak, hogy a Rel aktivitása a (p)ppGpp fő forrása hőstressz alatt.

(HIRDETÉS) A (p)ppGpp szintetázokban mutációt mutató törzsek növekedése (relP/Q - : BHS204, rel E324V : BHS709 (p)ppGpp°: BHS214) agarlemezeken 37 °C-on, hőstressz (55 °C), oxidatív stressz (0,1 mM diamid) vagy sóstressz (7% (w/v) NaCl teljes koncentrációja) idején ) éjszakai. (E) A vizsgált vad típus genotípusainak és (p)ppGpp szintézis képességeinek vázlata, Δrel (BHS126 és BHS368) és (p)ppGpp° (BHS214 és BHS319) törzsek. (F) A vad típusú és a Δ celluláris riasztószintjeirel törzs. A csillagok jelentős változásokat jeleznek (p ≤ 0,05) kombinált pGpp, ppGpp és pppGpp szintek Welch szerint t-teszt. Három független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. (G/H) Vad típusú (fekete vonalak) és mutáns törzsek (piros vonalak) hőtoleranciája és túlélése 53 °C-on. Legalább három független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. Nyitott szimbólumok: nincs elősokk, zárt szimbólumok: 15 perc elősokkolás 48 °C-on. (I) Fehérje-aggregátumok felhalmozódása hőstressz során 53 °C-on (37/53 °C) vagy (48/53 °C) elősokk nélkül. A jelzett törzsek exponenciálisan növekvő sejtjeit 48 °C-ra toltuk, vagy 15 percig nem kezeltük, majd további 15 percre 53 °C-ra toltuk. CE: sejtkivonat, SN: felülúszó, PE: pellet (aggregált fehérjefrakció).

A Rel aminosav-éhezés során történő aktiválásához töltés nélküli tRNS jelenléte és a riboszómához való kapcsolódása szükséges [21,22]. Cashel korai kísérletei kimutatták, hogy a (p)ppGpp felhalmozódása aminosav-éhezéskor szinte teljesen elnyomta a transzlációs inhibitor kloramfenikol jelenlétét, ami összefüggést jelez a Rel aktiváció és a transzláció között [54]. Érdekes módon az alarmon felhalmozódásának ugyanazt az elnyomását is megfigyeltük hő- és diamidkezelés során is (1F. ábra). Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a Rel szintetáz aktivitást aktiváló hő és oxidatív stressz által közvetített jel hasonló lehet a tRNS által közvetített jelhez, amely aktiválja a riboszómához kapcsolódó Rel-t aminosav éhezés esetén [19,20,54].

B. subtilis a (p)ppGpp-t nem tartalmazó sejtek érzékenyebbek a stresszre

Annak érdekében, hogy felmérjük az alarmontermelés jelentőségét a sejtek túlélésében hőstressz alatt, megfigyeltük a vad típusú (p)ppGpp°, relP/Q - (relP E154V , relQ E139V ) és rel E324V B. subtilis törzseket 37 °C-on és 55 °C-on agarlemezeken (2A. és 2B. ábra). Ahogy az várható volt, 37 °C-on egyik törzsnél sem észleltek nyilvánvaló növekedési hibát. Míg a sejtek túlélése a relP/Q— a törzs 55 °C-on azonos volt a vad típusú törzzsel, a (p)ppGpp° sejtjeiben erős növekedési hibák mutatkoztak, ill. rel E324V törzsek 55 °C-on. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a (p)ppGpp Rel általi termelése, de nem a RelP/Q, kritikus a túlélés szempontjából. B. subtilis hőstressz alatt álló sejtek. Ilyen súlyos növekedési hibákat figyeltek meg mind a (p)ppGpp°, mind a rel Az E324V nem csak hő-, hanem oxidatív és sóstressz hatására is törzsek, míg a relP/Q - a törzs ismét a vad típusú törzsre hasonlított azonos körülmények között (2C. és 2D. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a (p)ppGpp Rel általi termelése kritikus a túlélés szempontjából. B. subtilis sejtek, nemcsak hőstressz, hanem oxidatív és sóstressz körülményei között is.

A magas celluláris (p)ppGpp szint fokozott hőstressz ellenállást biztosít

Ezt követően megkérdeztük, hogy a (p)ppGpp szint befolyásolja-e a hőtolerancia kialakulását és túlélését. Ehhez a (p)ppGpp° törzset használtuk, amely nem képes szintetizálni a (p)ppGpp-t (1E. ábra), valamint egy Δ-t.rel törzs, amely folyamatosan emelkedett (p)ppGpp-t mutat (2F. ábra) és ezzel párhuzamosan csökkent GTP-szinteket (S2A. ábra). A Rel az egyetlen alarmon-hidroláz B. subtilis és a megnövekedett magas (p)ppGpp szint a sejtekben B. subtilis Δrel A törzs a növekedési ütem általános csökkenését is okozza (2F. ábra, S2A és S2B ábra), összhangban a korábbi jelentésekkel [28,29].

A hőrezisztencia (37/53 °C) és hőtolerancia (48/53 °C) kísérletekben azt tapasztaltuk, hogy a vad típusú sejtekkel ellentétben a (p)ppGpp° ill.relP és ΔrelQ sejttörzsek (2G és 2H ábra, S2C és S2D ábra), a Δrel törzs erősen megnövekedett hőrezisztenciát mutatott, ami a Δ magas számából is látszottrel A sejtek még mindig képesek kolóniákat képezni az egyébként halálos hősokk után (2G. ábra). Következetesen a fehérje aggregáció erős csökkenését is megfigyeltük a 37/53 °C-os hősokk során a Δ esetébenrel törzs, míg a (p)ppGpp° törzs nagyobb fehérje-aggregációt mutatott, amikor 37/53 °C-os hősokknak volt kitéve (2I. ábra).

Annak vizsgálata, hogy a Δ megnövekedett hőállóságarel törzset az alarmone (p)ppGpp megemelkedett szintje okozta, nem pedig a Rel fehérje hiánya, hanem csonkolt formáját fejeztük ki. E. coli RelA (RelAhiper), amely konstitutív és hiperaktív alarmon-szintetáz aktivitást mutat átv vad típusban B. subtilis sejtek [55,56]. Kontrollként a csonka formáját is kifejeztük E. coli RelA (RelAinaktív), amely nem rendelkezik alarmon-szintetáz aktivitással [55,56]. Második megközelítésben megvizsgáltuk B. subtilis A szintetázban (Rel E324V ) vagy a hidrolázban (Rel H77A/D78A ) inaktív rel variánsok átv ban,-ben B. subtilis (p)ppGpp° törzs.

Kifejezése E. coli RelAhiper vagy hidroláz-inaktív B. subtilis Rel H77A/D78A átv megnövekedett riasztószintet (S3A ábra) és magas hőellenállást eredményezett (S3B és S3C ábra), amint azt a B. subtilis Δrel törzs (2G. ábra). Ellentétben, B. subtilis (p)ppGpp° törzsek expresszálják E. coli RelAinaktív vagy a B. subtilis szintetáz inaktív Rel E324V átv nem mutatott sem megnövekedett riasztási szintet (S3A ábra), sem megnövekedett túlélést súlyos hőstressz esetén (S3D és S3E ábra). Ez arra utal, hogy a szintetáztól független megnövekedett riasztószint felelős a hőrezisztencia fenotípusáért. B. subtilis.

A celluláris GTP-szintek szerepe hőstressz során

Magas (p)ppGpp szintek az SR alatt bevezetnek B. subtilis a celluláris GTP szintjének csökkenéséhez, és ez a csökkenés köztudottan szerepet játszik az SR alatti transzkripciós változások előidézésében [33,34] (S1, S2A és S3A ábra). Annak vizsgálata, hogy a Δ-ben megfigyelhető-e a hőfeszültséggel szembeni ellenállásrel törzs közvetíthető egyszerűen a celluláris GTP szintjének csökkentésével, a vad típusú sejteket decoyininnel, a GMP szintetáz inhibitorával kezelték, amely csökkenti a sejt GTP szintjét (>gt háromszorosára) anélkül, hogy növelné a (p)ppGpp szintet [57,58] . Az 50 μg ml -1 decoyininnel végzett kezelés nem mutatott hatást, míg 250 μg/ml decoyinin hozzáadása részben megnövekedett hőrezisztenciát eredményezett. (S4 ábra). A tovább növelt decoyinin koncentráció azonban csökkentette (400 μg/ml), sőt megszüntette (1000 μg/ml) mind a hőrezisztencia, mind a hőtolerancia kialakulását (S4 ábra). Ezek a kísérletek arra utalnak, hogy a decoyinin által közvetített csökkent celluláris GTP szint, amely a transzkriptom SR alatti átprogramozásának előfeltétele [33,34,59], csak korlátozott mértékben képes hőállóságot kiváltani. Azonban a decoyinin megfigyelt hatása a hőrezisztenciára gyengébb volt, mint a megemelkedett (p)ppGpp szint hatása (2F és 2G és S3 ábra).

Ezekből a megfigyelésekből arra következtetünk, hogy a megemelkedett (p) ppGpp szintek elegendőek ahhoz, hogy fokozott stressz-ellenállást és csökkentsék a hő által kiváltott fehérje-aggregátumok szintjét. A sejtes GTP-szint SR-közvetített csökkenése [33] azonban nem volt megfigyelhető a hősokk-válasz során (S1 ábra), és a sejtes GTP-szint mesterséges csökkentése decoyininnel csak mérsékelten befolyásolta a hőrezisztenciát, sőt a hőtoleranciát is megszüntethette. (S4 ábra).

Ezért tovább folytattuk, és vizsgáltuk a transzkriptumot, a transzlációt és a proteomot emelt hőmérsékleten, valamint (p)ppGpp hiányában és jelenlétében.

A transzkriptom változásai a (p)ppGpp jelenlétében és hiányában emelt hőmérsékleten

Globális RNS-seq kísérleteket végeztünk, hogy összehasonlítsuk a transzkriptom változásait B. subtilis vad típusú, Δrel és (p)ppGpp° törzsek exponenciális növekedés alatt (37 °C) hősokk után (15 perc 48 °C), valamint 37/53 °C és 48/53 °C hőtolerancia (1A ábra) vad típusú sejtekben . Mivel a „stabil” rRNS leszabályozása az SR jellemzője, bevezettünk egy korábban megállapított kromoszómális rrnJp1-lacZ fúziót a vizsgált törzsekbe, ami lehetővé tette, hogy ezen rRNS-promoter aktivitását RNS-seq és RT-qPCR kísérletekkel kövessük ezekben. B. subtilis törzsek [17].

Ezáltal betekintést nyerhettünk (i) az a.-hoz kapcsolódó erős fenotípusba rel deléció, különösen a (p)ppGpp°-hoz képest B. subtilis törzset (3A. és 3B. ábra), és hasonlítsa össze a (ii) vad típusú sejtek transzkripciós változásaival a 37 vs. 48/53 °C hőtolerancia alatt (3C. és 3D. ábra). Ezzel egyidejűleg (iii) az összes érdeklődésre számot tartó génkészlet transzkripciós mintázata összehasonlítható és ellenőrizhető volt az összes vizsgált körülmény és bevitt mutáció tekintetében (4. ábra, S5, S6 és S7 ábra). Ezenkívül RT-qPCR kísérleteket használtunk RNS-seq kísérletünk validálására és különböző körülmények, például 50 °C-on történő növekedés vizsgálatára.

(A) Globális különbségek a génexpresszióban Δ-benrel a (p)ppGpp° törzsekkel szemben. Az oszlopsávok jelzik a gének eloszlását a megfelelő funkcionális csoportokban. (B) A szabályozott transzkriptumok génkészlet-dúsítási analízisének kiválasztott kategóriaeredményei Δ-benrel vs. (p)ppGpp° cellák. A pozitív/negatív dúsítási pontszámok a fel- vagy lefelé szabályozott gének gazdagodását jelentik. (C) Globális különbségek a génexpresszióban exponenciálisan növekvő (37 °C) vagy hőtoleráns (48/53 °C) vad típusú sejtekben. Az oszlopsávok jelzik a gének eloszlását a megfelelő funkcionális csoportokban. (D) A szabályozott transzkriptumok génkészlet-dúsítási analízisének válogatott kategóriaeredményei stresszmentes (37 °C) vagy termotoleráns (48/53 °C) vad típusú sejtekben. A pozitív/negatív dúsítási pontszámok a felfelé vagy lefelé szabályozott gének gazdagodását jelentik.

(A/B) Globális különbségek a génexpresszióban vad típusú és (p)ppGpp° törzsekben 37 °C-on, illetve 48 °C-on. Az oszlopsávok jelzik a gének eloszlását a megfelelő funkcionális csoportokban. (C) Hőtérkép, amely a kiválasztott transzkriptumok expressziós változásait mutatja enyhe hőstressz során vad típusú, (p)ppGpp° vagy Δ eseténrel sejteket. Az értékek log2 a transzkriptumszintek többszörös változása a vad típusú sejtekhez képest 37 °C-on. (D) A kiválasztott gének transzkripciójának relatív változásai hősokk során vad típusú és (p)ppGpp° törzsekben RT-qPCR-rel meghatározva. Három ismétlés átlaga és SEM látható. A csillagok a jelentőségét jelzik (p ≤ 0,05) Welch szerint t-teszt.

Szigorú válasz.

Először elemeztük az exponenciálisan növekvő vad típus, (p)ppGpp° és Δ transzkriptomikai adatait.rel törzsek (3A. és 3B. ábra, S1, S2 és S3 adatkészletek). Δ összehasonlításávalrel sejtek, amelyek konstitutívan magas riasztószintet mutatnak (2F. ábra), (p)ppGpp° sejtekkel, 682 gént találtunk a (p)ppGpp által szabályozottnak (3A. ábra), és jó korrelációt figyeltünk meg a kiválasztott sejtek RT-qPCR kísérleteivel. szabályozott gének (S5A ábra). Észrevettük, hogy számos transzlációval kapcsolatos gén, köztük a rrnJp1-lacZ riporter, valamint a CodY által szabályozott aminosavszintézis gének kiterjedt de-repressziója (pl. ilvB (3A. és 3B. ábra, S5B és S6. ábra)), amelyek mindegyike jellemző az SR-re a korábbi transzkriptomikai vizsgálatok szerint [37,53,60,61]. Továbbá az alternatív szénforrások hasznosításához szükséges CcpA által szabályozott gének transzkripciójának erőteljes csökkenése volt megfigyelhető (pl. rbsC (3A. és 3B. ábra, S5B és S6. ábra)). Érdekes módon számos hősokk-gén transzkripciója csökkent Δ-benrel sejtek (pl. dnaK és clpE (S5B ábra)). Ezzel szemben a SigB regulon számos általános stresszgénjének megnövekedett transzkriptumszintjét észleltük (pl. ssrA, dps, gsiB, ysnF) feszültség hiányában 37 °C-on Δrel cellák (3B. ábra és S5B. ábra). Nevezetesen az átírási szint hpf (yvyD), amely a hibernációt elősegítő Hpf faktort kódolja, megemelkedett a megemelkedett (p)ppGpp-szintekkel (24-szeresen szabályozott, (S5A és S5B ábra)), megerősítve, hogy a megnövekedett transzkripció hpf az SR aktiválásának riporterének tekinthető [52,53].

A hő által kiváltott (p)ppGpp impulzus csak kisebb transzkripciós változásokat közvetít.

Miután megállapítottuk, hogy az alarmonok védő szerepet játszhatnak a hősokk reakció során, megpróbáltuk felmérni a (p)ppGpp szerepét a hőhatás során bekövetkező transzkripciós változásokban. Ennek érdekében elemeztük a hőrezisztencia (37/53 °C) és hőtolerancia (48 °/53 °C) viszonyait (1A, 3C és 3D ábra) [9,17] vad típusú sejtekben, és megvizsgáltuk a vad típust, ( p)ppGpp° és Δrel törzsek szintén 48 °C-on, ugyanabból az RNS-seq kísérletből. Összességében csak kis változásokat észleltünk a vad típusú sejtek és a (p)ppGpp° sejtek transzkripciójának összehasonlításakor 37 °C-on és 48 °C-on, ami azt jelzi, hogy a hőstressz válasz transzkripciós változásainak többsége a (p)-től függetlenül közvetítődik. ppGpp (4A és 4B ábra). A hőtoleráns vad típusú sejtek (48/53 °C) a transzlációval kapcsolatos gének átfogó leszabályozását mutatták, beleértve a rrnJp1-lacZ riporter, amelyet kisebb mértékben az enyhe sokk előtti (48 °C) és súlyos hősokk (37/53 °C) körülmények között is megfigyeltek (3. és 4. ábra, S5 és S6 ábra), az előzőekkel összhangban megfigyelések [17]. Fontos, hogy a hő által közvetített leszabályozás rrnJp1-lacZ részlegesen (p)ppGpp-függőnek tűnt, ezért kevésbé volt kifejezett a (p)ppGpp° törzsben (4C. és 4D. ábra). Független RT-qPCR kísérletek megerősítették ezt a megfigyelést. A (p)ppGpp követelménye az elnyomáshoz rrnJA hőstressz alatt lévő p1 még nyilvánvalóbbá vált, amikor az 50 °C-os hősokk állapotát vizsgáltuk (S7A ábra).

Ezzel szemben úgy tűnt, hogy számos riboszomális fehérjegén és más transzlációval kapcsolatos gének hő által közvetített leszabályozása a (p)ppGpp hiányában is megtörténik, ami azt jelzi, hogy a transzkripció bonyolultabb és (p)ppGpp-függetlenebb. ezek a gének (4C. ábra). Továbbá, míg a CodY regulon kiterjedt de-repressziója figyelhető meg Δ-benrel sejtekben, mint az SR ismertetőjele, a CodY által szabályozott gének megnövekedett transzkripciója egyik vizsgált hősokk körülményben sem volt megfigyelhető (S6 és S7B ábra), ami a hősokkolt sejtek változatlan GTP szintjével magyarázható (S1 ábra). .

A hősokk-válasz regulon konzervált chaperonjait és proteázait kódoló gének transzkriptumszintje minden hőmérséklet-emelkedéskor erősen felfelé szabályozott volt, függetlenül a (p)ppGpp jelenlététől vagy hiányától (S6 és S7C ábra). Érdekes módon az 50 °C-os hősokk-kezelt sejtekből származó RNS-sel végzett további RT-qPCR kísérletek során kiderült, hogy egyes SigB által szabályozott gének hő által kiváltott expressziója károsodott a (p)ppGpp° háttérben, pl. ssrA (kb. 2-szer alacsonyabb expresszió a (p)ppGpp° sejtekben 50 °C-on) és dps (kb. 3-szor alacsonyabb expresszió), jelezve az SR és az általános stresszválasz közötti lehetséges funkcionális kapcsolatot (S7C és S7D ábra) [62,63]. A SigB regulon génjeinek többsége azonban a (p)ppGpp° törzsben a vad típusú sejtekhez hasonlóan indukálódik 48 °C-on (S6 ábra).

Nevezetesen a hő által kiváltott kifejeződése hpf, amelyet az SR pozitívan szabályoz (S5A ábra), alacsonyabb volt a (p)ppGpp° törzsben a vad típusú sejtekhez képest hőstressz alatt (4D ábra és S7A ábra). Továbbá, míg a CcpA által szabályozott géneket vad típusú és (p)ppGpp° sejtekben hősokk körülmények között elnyomták (3. ábra és S6. ábra), egyes gének (pl. rbsD, ganP, licH) a (p)ppGpp° törzsben 48 °C-on kevésbé szabályozottak, sőt indukáltak is (4B. ábra). Ezzel szemben a (p)ppGpp° mutánsban a motilitás-géneket a hő különösen erősen leszabályozta (4B. ábra, S5 és S6 ábra), míg ezeknek a géneknek a leszabályozása a vad típusú sejtekben nem volt szignifikáns. 48 °C (medián 1,14-szeres változás, S6 ábra) [64].

Összességében a (p)ppGpp kis, de észrevehető hatással van a transzkriptomra hőstressz alatt. A hő által közvetített felszabályozás hpf és leszabályozása rrnJp1-lacZ úgy tűnik, hogy a (p)ppGpp-től függ. Úgy tűnik azonban, hogy a hősokk-válasz általános indukciója, valamint számos riboszomális fehérje gén erős elnyomása, amelyet a hőstressz során figyeltek meg, többnyire függetlenek a riasztóktól. A CodY regulon indukciója, amely az SR egyik jellemzője, szintén nem sokat befolyásolt hőstressz alatt, valószínűleg azért, mert a (p)ppGpp hő által közvetített tranziens növekedése nem biztos, hogy elegendő a celluláris GTP szintjének csökkentéséhez a későbbi átalakuláshoz. A teljesen indukált SR-ből ismert transzkriptum [60].

Megjegyzendő, hogy az RNA-seq kísérlet megtervezésekor a 48 °C-ot választottuk egyszerű hősokk-feltételként a mutáns törzsek számára, mivel ez hasonlít a termotolerancia protokollra (1A ábra) és a korábban publikált microarray-k állapotára [17]. Azonban az Spx és a (p)ppGpp számos fenotípusát egy erősebb, de nem halálos hősokk esetén lehetett a legjobban megfigyelni 50 °C-on [17], amit RT-qPCR-rel tudtunk megbecsülni.Azt is megfigyeltük, hogy míg a 37/53 °C-kal kezelt vad típusú sejtek a (p)ppGpp erős növekedését mutatják a stressz első perceiben (1D. ábra), a sejtfiziológia vizsgálatát ilyen halálos körülmények között befolyásolhatja a látszólagos életképességének csökkenése körülbelül egy nagyságrenddel (2G. ábra) [9,17].

Az Spx kiegészítő szerepe és a szigorú reakció hősokk közben

Korábban már beszámoltunk arról, hogy az Spx, a hő- és oxidatív stresszválasz központi szabályozója, csökkentheti a transzlációval kapcsolatos gének és az rRNS transzkripcióját [17]. Azonban egy spx deléciós törzs nem károsodott e gének hő által közvetített leszabályozásában [17]. Itt észleltük az SR kimutatható, bár korlátozott részvételét a specifikus gének transzkripciós leszabályozásában hőstressz alatt (rrnJp1-lacZ), ami e gének különböző tényezők általi bonyolult szabályozására utal. Az Spx és a (p)ppGpp egyidejű és komplementer transzkripciós szabályozásának teszteléséhez egy B. subtilis törzs kombinálása a spx deléciót hoztunk létre a (p)ppGpp° mutációkkal. leszabályozása rrnJp1-lacZ hősokk esetén nagymértékben függ a (p)ppGpp-től (5A. ábra), azonban az Spx a (p)ppGpp hiányában is képes elnyomni ezt a promotert (S9B ábra) [17]. Érdekes módon ez a (p)ppGpp° Δspx törzs szintén lassú növekedésű fenotípust mutatott 37 °C-on, és súlyosabb növekedési hibát 50 °C-on, mint a (p)ppGpp° vagy Δ egyszeri delécióját tartalmazó törzsek.spx (5B. ábra és S8B. ábra). Ezek az eredmények az SR és a spx regulon hőstressz körülmények között. Következetesen a (p)ppGpp° Δspx törzs több hő által kiváltott fehérje aggregátumot halmozott fel 50 °C-on, mint a (p)ppGpp vagy spx (S8C ábra). Azonban a kiválasztott r-protein gének transzkripciója szintén leszabályozott a (p)ppGpp° Δ-ben.spx törzs (S8A ábra), ami az Spx-en és a (p)ppGpp-n kívül további faktorokra utal, amelyek szintén befolyásolhatják ezen transzkriptumok promóterét és/vagy stabilitását.

(A) Hőközvetített leszabályozás az rrnJp1-lacZ vad típusú transzkripció (BHS220), Δspx (BHS222), (p)ppGpp° (BHS319) és Δspx (p)ppGpp° (BHS766) törzsek RT-qPCR-rel meghatározva. Három független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. A csillagok a jelentőségét jelzik (p ≤ 0,05) Welch szerint t-teszt. (B) Ugyanezen törzsek tenyésztése LB táptalajban 50 °C-on.

Amikor a mutációk be rpoA bevezették a (p)ppGpp° törzsbe, amely megszünteti az Spx által közvetített fel- és leszabályozást (cxs-1/rpoA Y263C), vagy csak az rRNS Spx-közvetített represszióját zavarja, miközben lehetővé teszi a redox chaperonok felszabályozását (cxs-2 / rpoA V26 ° A ) [17], csak a (p)ppGpp° cxsA -1 törzs súlyos növekedési hibát mutatott, amint azt a (p)ppGpp° Δ esetében megfigyeltükspx törzs (S8B ábra). Ez a kísérlet azt sugallja, hogy a (p)ppGpp° háttérben a hatékony növekedéshez a stresszválasz gének Spx-közvetített felszabályozása szükséges, nem pedig a transzlációval kapcsolatos gének leszabályozásának képessége. Nevezetesen, a (p) ppGpp elegendő a transzlációval kapcsolatos gének leszabályozására a norvalin által kiváltott aminosavkorlátozás során, míg az Spx nélkülözhetetlen ehhez a folyamathoz (S9A ábra). Ezzel szemben az Spx a (p)ppGpp-től függetlenül képes hatni az rRNS-promoterekre in vivo (S9B ábra) [17]. Továbbá, in vitro A tisztított Spx-szel és RNAP-vel végzett transzkripciós kísérletek nem utaltak arra, hogy a ppGpp közvetlenül befolyásolhatja az RNAP Spx által közvetített transzkripciós aktiválását vagy gátlását (S9C ábra). Továbbá az Spx-függő stresszválasz gének (pl. trxB, clpX) nincsenek felfelé szabályozva a Δ-benrel törzs (S3 Dataset), ami arra utal, hogy az Spx-et nem aktiválja a (p)ppGpp in vivo.

Ezek a kísérletek együttesen azt sugallják, hogy az Spx és a (p) ppGpp komplex kölcsönhatás lép fel a hősokk-válasz során, és hogy legalább az Spx vagy a (p) ppGpp aktivitása fontos a hatékony növekedéshez hőstressz alatt. Úgy tűnik azonban, hogy az Spx transzlációval kapcsolatos génekre gyakorolt ​​gátló hatása nélkülözhetetlen a stressztűréshez, és sok r-protein gén leszabályozott hőstressz alatt, még az Spx és a (p) ppGpp hiányában is.

Az a megfigyelés, hogy az átírás spx a (p)ppGpp is aktiválja a CodY bemeneten keresztül Enterococcus faecalis és az rel a transzkripciót a σ R in diszulfid-stressz szabályozó aktiválja Streptomyces coelicolor e két szabályozó lehetséges funkcionális kapcsolata felé mutat [65,66].

(p)ppGpp szabályozza a transzlációt hőstressz alatt

Hősokk esetén a (p)ppGpp emelkedett szintjét figyeltük meg, de a transzkripciós átprogramozást nem, amelyet az alacsonyabb GTP szintek váltottak ki (3. és 4. ábra, S6 és S7 ábra). Ezért meg akartuk határozni a (p)ppGpp hőstressz alatti transzlációra gyakorolt ​​hatását. Ebből a célból újonnan szintetizált naszcens peptidláncok impulzusos jelölésére szolgáló módszert alkalmaztak puromicin segítségével a fehérjeszintézis sebességének becslésére (lásd Módszerek, S10 ábra) [67]. Ahogy az várható volt, a kis alarmon szintetázt fejezi ki relP (ywaC) in transz, magas (p)ppGpp szintek felhalmozódását eredményezi, ami egyidejűleg a transzlációs sebesség erőteljes csökkenéséhez vezet, jelezve, hogy ezekben a sejtekben a transzláció gátolt (S10D és S10E ábra) [39,53,68].

Amikor megvizsgáltuk a transzlációs sebességet a sejtekben, azt tapasztaltuk, hogy a Δrel törzs mindig alacsonyabb transzlációs sebességet mutatott a vad típusú sejtekhez képest 37 °C-on (6A. és 6B. ábra), ami összhangban van emelkedett (p)ppGpp-szintjével és a törzs megfigyelt „szigorú” fenotípusával. A különbség a vad típus és a Δ közöttrel A törzs csökkent a magasabb hőmérsékletnek való kitettség hatására, amit valószínűleg a stressz által kiváltott, vad típusú sejtekben megemelkedett alarmonszint is befolyásolt ezeken a magasabb hőmérsékleteken. Ezzel szemben a „lazított” (p)ppGpp° törzs mindig magasabb transzlációs sebességet mutatott (6A és 6B ábra), ami dereguláltabb transzlációt jelez, mint a vad típusú vagy Δ.rel törzsek. A nem halálos 50 °C-os hősokk során a transzlációs sebesség átmenetileg nőtt minden törzsben (6A. ábra). Ennek ellenére a (p)ppGpp° törzs még mindig szignifikánsan magasabb transzlációs sebességet mutatott a vad típushoz és a Δ-hez képest.rel B. subtilis törzsek (6A. és 6B. ábra). A (p)ppGpp megfigyelt hatása a transzlációra azt sugallja, hogy a (p)ppGpp hőstressz alatti legfontosabb hatása nem a transzkripcióra gyakorolt ​​hatása (4. és S5. ábra), hanem a transzláció közvetlen modulációja (6. ábra). , esetleg a különböző transzlációs GTPázok aktivitásának közvetlen megzavarásával [39,40,68,69].

(A/B) A vad típusú, (p)ppGpp° (BHS214) és Δ relatív transzlációja (a puromicin beépülése alapján becsült)rel (BHS126) törzsek hőstressz során (A) 50 °C-on ill (B) 48 °C-on vagy 48/53 °C-on. Közvetlenül (0-15 perc) vagy 15 perccel azután, hogy a mintát a jelzett hőmérsékletre állítottuk, 1 μg ml -1 puromicint adtunk a táptalajhoz 15 percig. Négy független kísérlet átlagát és SEM-jét mutatjuk be. A csillagok a jelentőségét jelzik (p ≤ 0,05) a vad típushoz viszonyítva Welch szerint t-teszt. (C) A vad típusú, (p)ppGpp0 és Δ kiválasztott kategóriáinak relatív kumulált fehérjeszintjeirel feszültségek hőstressz során. A kategóriákra a SubtiWikiből következtettünk. Az adott kategória összes fehérje relatív abundanciáit kumuláltuk és a kontrollállapotra (vad típusú 37 °C) normalizáltuk. (D) Metilénkékkel festett membránok, amelyek az rRNS integritását vagy lebomlását mutatják súlyos hőstressz (53 °C) után. Vad típusú, (p)ppGpp° (BHS214) vagy Δrel (BHS126) sejteket hősokkoltunk 48 °C-on, 53 °C-on vagy 48/53 °C-on 15 percig. 2 μg teljes RNS-t választottunk le denaturáló agaróz gélen, majd nylon membránra blottoltuk. (E) Kezeletlen (37 °C) vagy hőtoleráns (48/53 °C, egyenként 15 percig) vad típusú vagy (p)ppGpp° (BHS214) sejtekből származó kivonatok szacharóz gradiens profilja. A kezeletlen vad típusú sejtek szaggatott kék vonala referenciaként látható.

A transzláció lassabb növekedéssel kísért leszabályozása, amely növeli a hőrezisztenciát, a hibás riboszómákkal rendelkező sejtekben is megfigyelhető, hiányzik pl. az L11 riboszómális fehérje (RplK). Az RplK nem lényeges, azonban a ΔrplK törzs súlyos transzlációs hibákat és erősen lecsökkent növekedési rátát mutat (S11 ábra), annak ellenére, hogy nem képes szintetizálni (p)ppGpp [70]. Ilyen B. subtilis ΔrplK törzs fokozott hőstressz toleranciát mutat, hasonlóan a Δ-hezrel cellák (S11 ábra). Ez a megfigyelés arra utal, hogy a hibás riboszóma által okozott lecsökkent transzlációs sebesség elegendő a hőstressz alatti túlélés növeléséhez, még riasztó hiányában is. Összefoglalva, ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az intracelluláris (p)ppGpp másodlagos hírvivő azonnal képes modulálni a transzlációt hőstressz alatt, és hogy csökkenti a fehérjeszintézis sebességét. önmagában fokozhatja a stressztűrést.

Hősokk és (p)ppGpp által közvetített fehérjeszint-változások

Az a megfigyelés, hogy úgy tűnik, hogy a (p)ppGpp közvetlenül szabályozza a transzlációt hőstressz hatására, arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk a riasztások és a hő hatását a proteom változásaira. Ezért tömegspektrometriát alkalmaztunk a stresszes (15 perc 50 °C) és stressz nélküli (37 °C) vad típusú, (p)ppGpp° és Δ sejtfehérjék proteomszintű azonosítására és mennyiségi meghatározására.rel sejteket. Összesen 2641 fehérjét határoztunk meg, amelyeket legalább két peptiddel azonosítottunk minden körülmények között (S4 és S5 adatkészletek, S12 és S13 ábra). Hőstressz hatására (50 °C) a hőspecifikus stresszválasz fehérjék kifejezett növekedése, pl. ClpC vagy GroEL, minden törzsben megfigyelhető volt, ami azt jelzi, hogy a transzlációs kapacitás elegendő ahhoz, hogy elősegítse a hősokkfehérjék szintézisét vad típusban, sőt a Δ-ben is.rel törzsek, ahol a transzlációs sebesség csökkent (6C. ábra és S12. ábra).

Ezzel szemben a SigB által szabályozott általános stresszfehérjék hő által közvetített szintézise csökkent a (p)ppGpp° sejtekben, míg szintje megnőtt a Δ sejtekben.rel törzs, amely megerősíti az alarmon szintézis és az általános stresszválasz közötti szabályozó összefüggést, amelyet az RNS-seq kísérletben már megfigyeltek (6C. és S12. ábra).

A vad típusú és (p)ppGpp° sejtekben a bőséges riboszómális fehérjék a celluláris fehérjetömeg nagy részét képviselik, azonban szintjük erősen csökkent Δ-benrel sejtek az ennél a törzsnél megfigyelt konstitutív szigorú szabályozásnak megfelelően (6C. ábra, S12 és S13 ábra). Érdekes módon számos r-protein szintje csökkenni látszik hőstressz hatására a vad típusú sejtekben, de nem a (p)ppGpp° sejtekben (6C. és S12. ábra), ami alátámasztja a riasztószertől függő poszttranszlációs szabályozási mechanizmust a vad típusú sejtekben. ezek a transzlációval kapcsolatos fehérjék.

Ha összehasonlítjuk a Δ proteomjaitrel vad típusú sejtekkel, stresszmentes körülmények között, nagy léptékű változásokat figyeltünk meg, amelyek sok tekintetben hasonlítanak az RNS-seq eredményeire (S13 ábra). Ezzel szemben a vad típusú és (p) ppGpp° sejtek közötti proteom különbségek 37 °C-on és 50 °C-on is viszonylag kisebbek voltak (S13 ábra). Fontos, hogy a vad típusú vagy (p) ppGpp°-ból származó, differenciálisan szabályozott fehérjék génkészlet-dúsítási elemzése 37 °C-on vagy 50 °C-on csak néhány dúsított funkcionális kategóriát tárt fel (S5 adatkészlet). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a (p)ppGpp részt vesz a teljes fordítási kapacitás szabályozásában.

Összefoglalva, bár a (p)ppGpp részt vehet egyes fehérjék poszt-transzkripciós szabályozásában, úgy tűnik, hogy a riasztók elősegítik a stressztolerancia kialakulását azáltal, hogy szabályozzák a transzlációs sebesség globális változásait. Megfigyeltük azonban a proteom specifikus fehérjeosztályainak (p)ppGpp-függő szabályozását. (6C. ábra). Figyelemre méltó, hogy az r-fehérjék csökkenését figyeltük meg az alarmontól függően, és a chaperon szintjének relatív növekedését a hősokk során, függetlenül az alarmontól (6C. ábra, S12 és S13 ábra). Mivel a chaperonok hő által közvetített indukcióját még a rel strain állandóan emelkedett (p)ppGpp szintjei és lelassult fordítása miatt egy olyan mechanizmus lehetőségét gyanítjuk, amely lehetővé teszi a chaperonok specifikus fordítását, jóllehet az általában lelassult fordítás.

Ezen a védőfunkción túlmenően a (p)ppGpp, amelyet a Rel csak impulzusként szintetizál 50 °C-on, viszonylag gátlástalan növekedés során, modulálhatja vagy gátolja a transzlációt, feltehetően a transzlációs faktorok közvetlen interferálásával [38,39,41, 69]. Egy sor érdekes in vitro kísérletek a ppGpp és a (p)ppGpp IF2-re és a transzlációs iniciációra gyakorolt ​​moduláló hatását sugallták, ami a transzlált mRNS specifikus strukturált elemeitől is függött, lehetővé téve a specifikus mRNS-ek transzlációját riasztók jelenlétében [41]. Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az IF2-vel kölcsönhatásba lépő alarmonok specifikusan képesek korlátozni a transzlációt, miközben esetleg még mindig lehetővé teszik a stresszrezisztenciához szükséges specifikus gének expresszióját [41].

(p)ppGpp szükséges a riboszóma integritásához és a 100S képződéshez hőstressz során

A letális hőmérséklet-eltolással (37/53 °C) végzett kezelés elősokk nélkül a transzlációs hatékonyság erős csökkenését eredményezte vad típusú és (p)ppGpp° törzsekben. Érdekes módon a transzláció erősen csökkent a (p)ppGpp° sejtekben 37/53 °C-on, miközben a vad típusú sejtek továbbra is aktív transzlációt tartottak fenn ilyen körülmények között (S14A ábra). Úgy tűnik, hogy a (p)ppGpp° sejtekben tapasztalható lecsökkent transzlációs aktivitás a celluláris 16S rRNS szintjének erőteljes csökkenésével jár együtt e súlyos hősokk során (6D. ábra). Ez hibára utalhat a 16S rRNS érésében és a kis riboszomális alegység összeállításában és/vagy aktivitásában, ami összhangban van a megfigyelt hőérzékenységgel. B. subtilis (p)ppGpp° törzs (2A. és 2B. ábra). Ezzel szemben a fordítás Δ-benrel a sejtszám átmenetileg megnövekedettnek tűnt a vad típusú és (p)ppGpp° törzsekhez képest (S14A ábra), összhangban azzal, hogy ez a törzs nagy hőállósággal bír az egyébként halálos hősokkkal szemben, ami negatívan befolyásolja a törzs növekedését. érzékenyebb vad típusú és (p)ppGpp° törzs (2G. ábra).

A (p)ppGpp° törzs sem tudta indukálni a hpf gén a hőstressz alatt, és nem halmozta fel a Hpf fehérjét (4D ábra és S14B ábra). Így a 100S-diszómák kialakulása hőstressz hatására, ami jól látható volt a vad típusú és a Δ riboszóma profiljában.rel sejtek (különösen termotolerancia körülmények között) megszűnt a (p)ppGpp° törzsben, ahol csak poliszómák voltak kimutathatók, hasonlóan, mint a Δ-ben.hpf cellák (6E. ábra és S14C. ábra) [71]. A 16S rRNS súlyos stressz körülmények között megfigyelt látszólagos csökkenését azonban nem akadályozták meg átv A Hpf expressziója (S14D ábra) és a Hpf túlzott expressziója nem tudta megmenteni a (p)ppGpp° törzsek hőérzékeny fenotípusát (S14E ábra). Ezenkívül a transzlációt gátló antibiotikumok hozzáadása nem tudta megmenteni ezt a fenotípust, ami azt jelzi, hogy a transzláció gátlása önmagában nem elegendő a riboszómák védelméhez erős hőstressz esetén (S14F ábra).

Nemrég figyelték meg ben B. subtilis hogy a tRNS érési hibái az rRNS feldolgozás és a 30S összeállítás gátlásához vezethetnek a (p)ppGpp [72] szintézisén keresztül, alátámasztva az alarmon szerepét a riboszóma érésben.

Összességében ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a (p)ppGpp szükséges a riboszomális alegységek integritásához és a 100S részecskék képződéséhez hőstressz alatt. Ezek a megfigyelések fontosak lehetnek a lehetséges stressz jelátviteli útvonalak, valamint a (p)ppGpp proteotoxikus stressz körülmények között a transzlációra gyakorolt ​​védő hatásainak megértéséhez.

A sztringens válasz aktiválása hőstressz alatt

Az itt bemutatott eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a (p)ppGpp gyorsan felhalmozódik a hő és más környezeti igénybevételek során (1. ábra). Ezenkívül a (p)ppGpp-t szintetizálni nem képes törzsek érzékenyek lesznek a magas hőmérsékletre, és több hő által kiváltott fehérje-aggregátumot halmoznak fel (2A–2D, 2H és 2I ábra). Érdekes módon a (p) ppGpp szintézise és hőtűrése kizárólag a Rel szintetáz aktivitásától függ, ami azt jelzi, hogy ez az enzim felelős a (p) ppGpp szintéziséért ilyen körülmények között (1E és 2A–2D ábra).

A hőstresszhez hasonlóan a diszulfid- vagy sóstressz is a fehérjék inaktiválásához, kibontakozásához és aggregációjához vezethet [48,73]. Lehetséges, hogy a fehérje aggregáció vagy inaktiváció szerepet játszhat a Rel stressz által közvetített aktiválódásának jelében, mivel a proteotoxikus és oxidatív stressz enzimek inaktiválásához vezethet, és károsíthatja bizonyos aminosavak felvételét vagy bioszintézisét [51,74– 76].

A transzkripciós és transzlációs hősokk válasz, amely általában a hőmérséklet érzékelésétől függ közvetve vagy közvetlenül a sejtfehérje kibontakozása révén, 2-5 perc tartományban van [5,6]. Mivel a fehérje kibontakozása megelőzi a transzkripciós vagy transzlációs választ, becsülhető, hogy a sejtfehérje hirtelen proteotoxikus stressz hatására 2-3 percnél gyorsabban megy végbe. Ez összhangban van a megfigyeléssel is in vivo A szubcelluláris fehérje aggregátumok képződése, amelyet ki- és tévedés előz meg, már körülbelül 2 perccel a hősokk után megfigyelhető [7]. A hő által indukált alarmon szintézis viszonylag gyors és átmeneti kinetikája (1. ábra) ezért összhangban van az általános hő által közvetített fehérje téves feltekerődésből és a specifikus stressz-érzékelő fehérjék hőstressz alatti ki- vagy hibás feltekeredésével ismert időkerettel.

Kísérleteink azt mutatják, hogy a hő- vagy oxidatív stressz során a Rel aktiváció gátolható kloramfenikollal, hasonlóan az aminosav-éhezés során (1F és S1E ábra). Ezért a környezeti stressz során a mögöttes aktivációs mechanizmusok valószínűleg hasonlóságot mutatnak a jól tanulmányozott SR-aktivációval aminosavmegvonás esetén, és magában foglalhatják a töltés nélküli tRNS érzékelését a riboszómán [21,22,74,77].

Az aminosavak stressz által kiváltott kimerülése töltés nélküli tRNS felhalmozódását eredményezheti, amely jelként szolgál a Rel aktiválásához. Ezenkívül a transzlációs gépezet tRNS-ei és fehérjéi hajlamosak az oxidációra vagy módosulásra stressz hatására, ami a transzláció leállásához vezet, ami szintén kiválthatja az SR-t [78]. Például a tRNS-ek oxidációja egy konzervált 4-tiouridin-maradékon csökkentette a rokon aminoacil-tRNS-szintetázhoz való affinitását, amelyről kiderült, hogy ez az alapja az SR aktiválódásának UV-sugárzás hatására. S. enterica [79].

Nagyon valószínű, hogy a hőstressz jelét először kibontott fehérjéken keresztül érzékelik, amelyeket aztán a specifikus tRNS továbbíthat a riboszómán lévő Rel-hez a különböző tárgyalt lehetőségek révén. Nem zárható ki azonban, hogy pl. Maga a Rel hőstressz-érzékelő fehérjeként működhet a riboszómán, vagy egy hőstressz-érzékelő fehérje is részt vehet, amely kölcsönhatásba lép a Rel-lel, amint azt például a kompetenciák fejlesztésére javasolják. B. subtilis [80]. Nyilvánvaló, hogy több kísérletre van szükség a Rel aktiválódásának és az SR szabályozásának hátterében álló molekuláris mechanizmus azonosításához hőstressz alatt. B. subtilis.

A (p)ppGpp és a SigB szerepe hőstresszben

Mind a transzkriptomikai, mind a proteomikai adatkészletek a SigB-függő általános stresszválasz lehetséges aktiválását jelzik (p) ppGpp által stresszes és nem stresszes körülmények között (3B és 6C, S5B, S7, S12 és S13 ábra). A SigB a decoyinin által kiváltott csökkent GTP szint hatására aktiválódik [62,63]. Ezen túlmenően a Rel szintetáz aktivitásához szükséges L11 és a (p)ppGpp-vel kölcsönhatásba lépő Obg, a riboszómához kapcsolódó GTPáz szükséges a SigB aktiválásához fizikai stressz hatására és az Obg kölcsönhatása a SigB összetevőivel. szabályozó kaszkádról számoltak be, ami bonyolult összefüggésre utal a Rel riboszóma és az általános stresszválasz aktiválása között [62,70,81].

Az SR szerepe a hőstressz reakcióban

Összességében adataink egy olyan modellre utalnak, amelyben a sejtek reagálnak a hő által közvetített fehérje kibontakozásra és aggregációra, nemcsak a javítóképesség növelésével, hanem a transzláció csökkentésével is, ezzel egyidejűleg csökkentve a celluláris fehérjeminőség-ellenőrző rendszerek terhelését (7. .

A sztringens válasz szerepének modellje a hősokk-válasz szabályozási hálózatában.

Hősokk esetén a Rel aktiválódik, és gyorsan szintetizálja a riasztókat. A második hírvivő (p)ppGpp ezután közvetlenül szabályozhatja a transzlációs faktorok aktivitását, és ezáltal gyors és azonnali választ közvetíthet a transzláció módosítására stressz alatt. Ugyanakkor a (p)ppGpp jelentős szerepet játszhat az aktív riboszómák fenntartásában és védelmében, ami magában foglalhatja a transzláció modulálását már a riboszóma összeállítási szakaszában. A transzláció újrabeállítása lehetővé teheti a sejtes erőforrások hatékony újraelosztását a stresszválasz fehérjék szintéziséhez, és ezzel egyidejűleg minimalizálhatja a fehérjeminőség-ellenőrző rendszerek terhelését, így hozzájárulva a fehérje homeosztázishoz [3,82,83]. Az eukarióta sejtek endoplazmatikus retikulumában a fehérjehomeosztázis egyensúlyzavaraira adott kibontott fehérjeválasz egy jól tanulmányozott és analóg stresszválasz mechanizmus, ahol a chaperonok felszabályozása a transzláció egyidejű leszabályozásával is párosul, bár különböző mechanizmusok révén. 3,84].

Meg kell jegyezni, hogy a celluláris GTP-szint decoyinin-kezeléssel történő csökkentése a hőrezisztencia korlátozott növekedését is eredményezte emelkedett riasztószint hiányában. Hasonlóképpen arról számoltak be, hogy a mutáns törzsek Lactococcus lactis a konstitutívan csökkent GTP-szinttel a stressztűrő képesség is megnövekedett [85]. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a celluláris GTP koncentráció csökkenése önmagában számos olyan sejtfiziológiás hatást reprodukálhat, amely a (p)ppGpp jelenlétében is megfigyelhető. A megnövekedett (p)ppGpp-szintek által biztosított hőstressz ellenállás azonban erősebbnek tűnt, mint a decoyinin-kezelés során megfigyelt, ami arra utalhat, hogy bizonyos, a stressz-ellenállás szempontjából fontos folyamatokat túlnyomórészt közvetlenül a (p)ppGpp szabályozza. Nyilvánvaló, hogy több munkára van szükség a (p)ppGpp celluláris célpontjainak azonosításához és jellemzéséhez, valamint a GTP és (p)ppGpp eltérő szerepének vizsgálatához a hőtolerancia kialakulása során.

Érdekes módon a (p)ppGpp hő- vagy oxidatív stressz hatására felhalmozódásáról és a stressz-ellenállásban betöltött fontosságáról máshol is beszámoltak. Cégek és még Proteobaktériumok amelyek nagymértékben különböznek a (p)ppGpp jelátvitel tekintetében [49,74,77,86,87]. Kimutatták, hogy a (p)ppGpp felhalmozódása megvédi a sejteket a sótól vagy az ozmotikus stressztől [85,88]. Ezzel szemben a (p)ppGpp hiánya köztudottan érzékennyé teszi a sejteket a hőre vagy az oxidatív stresszre [74,89,90], ami arra utal, hogy az SR aktiválása, amely lehetővé teszi a transzláció gyors leszabályozását, fontos és konzervált rész. a baktériumok környezeti stresszre adott válasza. Érdekes megjegyezni, hogy az SR is érintett volt B. subtilis kompetenciafejlesztés, elősegítve azt a sejtállapotot, amikor a sejtek abbahagyják az osztódást, és a legtöbb transzkripció és transzláció erősen leszabályozott (más néven K-állapot). Ezekben a sejtekben csak a kompetencia fehérjék expresszálódnak a DNS-javító és rekombinációs génekkel együtt, ami lehetővé teszi a homológ DNS felvételét és lehetséges felhasználását az állófázisú sejtek egy alpopulációjának ebben a specifikus sejtállapotában [80]. A baktériumsejtek tehát úgy tűnik, hogy a (p)ppGpp másodlagos hírvivőket használják, amelyek közvetlenül megzavarhatják az alapvető sejtfolyamatokat, például a transzlációt, replikációt és növekedést, a különböző szabályozó hálózatok fontos részeként, elősegítve és lehetővé téve a baktériumsejtek túlélését a gyorsan változó körülmények között. korlátozott tápanyag-elérhetőségű és különféle stresszhatásoknak kitett környezetek.


A kobalamin ribokapcsolók széles körben képesek megkülönböztetni a metil-kobalamint és az adenozil-kobalamint

A ribokapcsolók a szabályozó RNS-ek széles körben elterjedt osztálya a baktériumokban, amelyek kis molekula által kiváltott konformációs változásokon keresztül modulálják a génexpressziót. Általában ezeket az RNS-elemeket osztályokba csoportosítják a konzervált elsődleges és másodlagos szerkezet, valamint rokon effektor molekuláik alapján. Bár ez a megközelítés nagyon sikeres volt az új riboswitch családok azonosításában és eloszlásuk meghatározásában, a szerkezetileg rokon RNS-ek közötti kis szekvenciaeltérések megváltoztathatják ligandumszelektivitását és szabályozó viselkedését. Itt szerkezetalapú mutagén megközelítést alkalmazunk annak bizonyítására, hogy a kobalamin ribokapcsolók széles spektrummal rendelkeznek a kobalamin két biológiai formája iránt. in vitro izotermikus titrálási kalorimetriával. Ezt a szelektivitást elsősorban a T-hurok modult alkotó RNS perifériás eleme és a kobalamin-kötő zsebben lévő nukleotidok egy részhalmaza közötti kölcsönhatás közvetíti. Sejtalapú fluoreszcencia riporter vizsgálatok in Escherichia coli feltárta, hogy olyan mutációk, amelyek megváltoztatják az effektor preferenciát in vitro biológiai összefüggésben eltérő szabályozási válaszokhoz vezetnek. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a korábban és az újonnan felfedezett riboswitch-osztályok reprezentatív szekvenciáinak átfogóbb elemzése feltárhatja az RNS-ek alcsoportjait, amelyek különböző effektorokra reagálnak. Továbbá, ez a tanulmány egy második különálló eszközt mutat be, amellyel a kobalamin ribokapcsolókban lévő tercier szerkezeti kölcsönhatások diktálják a ligand szelektivitást.

Kulcsszavak: RNS szerkezete adenozilkobalamin (AdoCbl) aptamer gén szabályozási szubsztrát specificitása.

© 2017: The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük a cikk tartalmával


A kiadó megjegyzése A Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken szereplő joghatósági igényeket és az intézményi kapcsolatokat illetően.

Bővített adatok 1. ábra A fémhez kötött NiCo RNS szerkezete.

a, A NiCo RNS kristályszerkezete (PDB ID: 4RUM) az RNS gerincét (szalag) mutatja a Co 2+ ionokkal (bíborvörös) kölcsönhatásba lépő nukleotidokkal (stick modellek) együtt. A J41 (cián) és J12 (rózsaszín) csomópontok részt vesznek a kobalt koordinálásában, de jelentősen megváltoznak Sensei RNS-ek. b, A NiCo RNS Co 2+-nal való kölcsönhatásainak részletei (magenta gömbök) láthatók. A J12 (rózsaszín), J23 (szürke) és J41 (cián színű) NiCo RNS-csatlakozások konzervált maradványait koordináló kobalt (szaggatott vonal) jelzi.

Kibővített adatok 2. ábra Sensei RNS-ek bioinformatikai előrejelzése.

a, A folyamatábra lépéseket mutat be a Sensei RNS-ek azonosítására a bakteriális genomokban. A NiCo keresési modellt létrehoztuk és az ac kovariancia keresést elvégeztük, lehetővé téve a indels csomópontokban. A csomópontokban megváltozott találatokat (természetes NiCo-változatok) megkaptuk, és visszaadtuk a keresési modellhez az iteratív új találatok keresése érdekében. Ez azt eredményezte, hogy a Sensei RNS-eket nagy biztonsággal előre jelezték a baktériumok között. A találatok elemzése azonosítja a Sensei RNS-ekhez kapcsolódó genomiális összefüggéseket és biológiai folyamatokat. b, Reprezentatív RNS-szekvenciák a NiCo-ra, vaskötés Sensei Az RNS-ek és a nem-kötő RNS-ek láthatók. Az árnyékolt területek kiemelik a P1 (rózsaszín), P2 (kék), P3 (zöld) és P4 (sárga) szárat. c, az RNS-ek, amelyek megtörik a konszenzust a keresési modellből, nem kötik meg a vasat egy egyensúlyi dialízis vizsgálatban, amelyet kolorimetriás kimutatás követ.

Bővített adatok 3. ábra Fémkötő festékek részletes jellemzői.

a, A 2-2’ bipiridin kémiai szerkezete szabad vagy Fe-kelát formában (fent). A bal oldali panelen a vashoz kötött 2-2’-bipiridin standard görbéje látható 520 nm-en leolvasott abszorbanciaként a Fe2+-koncentráció (piros) függvényében. Fe 3+ (kék) jelenlétében nem észleltünk abszorbanciát. Ezt használták a Fe mennyiségének becslésére az egyensúlyi dialízises vizsgálatokban. A jobb oldali panelen az oldatban lévő Fe 2+ -hoz kötődő (szürke) vagy a Sensei RNS-től elkülönített (piros) 2-2'-bipiridin spektrumai láthatók. b, A Mn 2+-hoz kötött nátrium-perjodát standard görbéje 525 nm-en mutat abszorbanciát a Mn 2+ koncentráció függvényében. Ezt használtuk a Mn mennyiségének becslésére különböző RNS-ekkel szembeni egyensúlyi dialízis után. c, Sensei vagy GlmS RNS egyensúlyi dialízise Mn 2+ ellen, majd nátrium-perjodáttal végzett kolorimetriás detektálás nem mutat Mn 2+ megkötést ezen RNS-ek által. A bemutatott adatok n=2 biológiai ismétlésből (körből) származnak, az átlagot ± SD oszlopokkal ábrázolva.

Extended Data 4. ábra Hdu RNS-ek részletes jellemzése ITC segítségével.

a, ITC-kísérletek szimulációs görbéi Hdu RNS esetén 10-szer alacsonyabb (piros, 0,16 μM), 10-szer magasabb (szürke, 16 μM) és K értékenD (kék, 1,6 μM) láthatók. b, az ITC Fe 2+ titrálással vad típusú Hdu RNS-be, különböző monovalens (30 mM, 100 mM és 200 mM KCl) koncentrációkban történt. A kötési affinitás és a sztöchiometria változatlan marad a vizsgált egyértékű ionok tartományán belül. A bemutatott adatok n=2 biológiai ismétlésből (körből) származnak, az átlagot ± SD oszlopokkal ábrázolva.

Kibővített adatok 5. ábra Mag-fura-2 (mf2) kompetíciós vizsgálatai Hdu Sensei RNS-sel.

A mag-fura-2-be történő Fe 2+ titrálások reprezentatív kötési izotermái. A 324 nm-en (narancssárga) mért abszorbancia az mf2 fémes formájára utal. a, 10 μM mf2 önmagában, Fe 2+ -mal titrálva. A folytonos narancssárga vonal egy globális, nemlineáris, legkisebb négyzetek egy 1:1 (mf2: Fe 2+ ) modellhez illeszkedő modelljét jelöli. b, 10 μM mf2 + 10 μM Hdu RNS Fe 2+ -al titrálva. A folytonos kék vonal egy globális, nemlineáris, legkisebb négyzeteket jelöl, amely illeszkedik egy 1:1 (Fe 2+ :Hdu RNS) modellhez. c, 10 μM mf2 önmagában, Co 2+ -al titrálva. A folytonos narancssárga vonal egy globális nemlineáris, legkisebb négyzetek 1:1 (mf2: Co 2+ ) modellhez illeszkedő modelljét jelöli. d, 10 μM mf2 + 50 μM Hdu RNS Co 2+ -al titrálva. A folytonos kék vonal egy globális, nemlineáris, legkisebb négyzetek 1:1 (Co 2+ :Hdu RNS) modellhez illeszkedő modelljét jelöli. Az n=3 kísérletből becsült kötési affinitásokat az alábbi táblázat mutatja be. A szaggatott fekete vonalak tízszer szorosabb és gyengébb affinitással végrehajtott szimulációkat jelölnek.

Kibővített adatok 6. ábra Az apo-Hdu Sensei RNS szerkezeti analízise in-line probing assay segítségével.

Az 5'-P 32-vel jelölt RNS-t lúgos körülmények között 30 órán át inkubáltuk, lehetővé téve a gerinc spontán hasítását. Az RNS hasítási termékeket (in-line jelölve) denaturáló gélen választottuk el, és autoradiográfiával tettük láthatóvá a kontrollok mellett (NR-reagálatlan, OH-hasítás minden nukleotidnál és RNázT1-hasítás Gs-nél). A strukturált régiók résként jelennek meg (kék vonallal jelölve), az RNS rugalmas régiói pedig sávként jelennek meg. A kísérletet biológiai ismétlésekkel végeztük (n=2).

Kibővített adatok 7. ábra 2AP spektrumok a Hdu RNS-hez.

a, A vad típusú Hdu Sensei RNS reprezentatív emissziós spektruma, amelyet 2AP próbával jelöltek a J23-ban (bal oldali panel) és a J12-ben (jobb panel). A J23-ban jelölt RNS csökkenést mutat, míg a J12-ben a fluoreszcencia intenzitása nő a Fe 2+ koncentráció növekedésével. b, A normalizált fluoreszcencia intenzitás a Fe 2+-koncentráció függvényében ábrázolva a vad típusú Hdu RNS-hez, amelyet 2AP-vel jelöltek J23-ban (kék), J34-ben (piros), J12-ben (zöld) vagy L4-ben (sárga). Az adatokat egyhelyes kötési egyenlethez és látszólagos K-hez illesztettükD értékeket kaptunk, amint az az ábrákon látható. A bemutatott adatok n=3 kísérletből származnak (körök), amelyek átlag ± SE.

Kibővített adatok 8. ábra RT-PCR standard görbe és in vivo szabályozási vizsgálat vad típusú Hdu sensei és +J41 mutáns RNS esetén.

a, A teljes RNS-t a módszerekben leírtak szerint különböző fémkiegészítési körülmények között növesztett sejtekből vontuk ki. Szemikvantitatív RT-PCR, amelyet az 1. próbával (balra) vagy a kontroll RpoA próbával (jobbra) hajtunk végre, változó ciklusszámokkal, amint az ábrán látható (n=1 két független gén esetén). b, RT-PCR standard görbe, amelyet az A panel sávintenzitásának a ciklusszám függvényében történő ábrázolásával állítunk elő. A 25-29. ciklus a lineáris érzékelési tartományban található. cNövekvő vaskoncentráció mellett szintetizált RnhB-DHFR-3myc-címkézett fúziós fehérjét egy Western bloton teszünk láthatóvá, amelyet anti-myc antitestekkel detektáltunk. Mind a vad típusú Hdu sensei (fent), mind a +J41 mutáns RNS (lent) fehérjeszint növekedést mutat a növekvő Fe-koncentráció mellett. A blotok mennyiségi meghatározása különbségeket mutat a Hdu vad típusú és a +J41 RNS között, különösen 100 μM Fe mellett, ahol a kétoldali páros t-teszt szignifikáns (n=3, pérték<0,001 ***) különbséget mutatott. e két RNS szabályozó válasza között. d, A sematikus nukleotidok a Hdu Senseiben (rózsaszín), amelyek tökéletesen komplementerek Haemophillus ducreyi16S rRNS szekvencia. A Sensei és a 16S rRNS közötti bázispárosítás részletesen látható (jobbra).

Kibővített adatok 9. ábra Művelt RNS-szekvenciák és egyensúlyi dialízis vizsgálat.

a, Sequences of E. baktérium A NiCo és a Hdu Sensei látható. Megjelennek a J12-ben és J41-ben a Nico2Fe-re, illetve a Fe2NiCo-ra való átalakításuk érdekében végrehajtott konkrét változtatások. b, Fémek elleni egyensúlyi dialízis, majd 2-2’ bipiridil festékkel végzett kolorimetriás detektálás azt mutatja, hogy a NiCo2Fe RNS most megköti a Fe 2+ -ot. A vaskötés mértéke akkor is megmarad, ha az RNS-t Fe 2+ és Co 2+ keverékével szemben dializáljuk, ami a kobalt felismerés elvesztésére utal. A bemutatott adatok biológiai hármas példányokból származnak, amelyek átlag ± SD. c, Fémek elleni egyensúlyi dialízis, majd 2-2’ bipiridil festékkel végzett kolorimetriás detektálás azt mutatja, hogy a Fe2NiCo RNS nem köt Fe 2+ -ot, ha önmagában vagy versengő mennyiségű Co 2+ jelenlétében. A bemutatott adatok n=2 biológiai ismétlésből származnak, ami átlag ± SD.


ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Érdeklődési rendszer

Két eltérő kapcsolási viselkedésű és szabályozó funkciójú riboswitch aptamer régióit vizsgáljuk. Az S-adenozil-metionin (SAM)-I ribokapcsoló a Thermoanaerobacter tengcongensis egy „ki” kapcsoló, amely szabályozza a transzkripciót. Az általunk vizsgált szekvencia 94 nt-ből áll (PDB: 2GIS) (31) (az 1A. ábrán látható, a részletes bázispárosítás az SI-1 kiegészítő ábrán). A 94 nt egy négyirányú spirális csomópontban vannak elrendezve, két pár koaxiálisan egymásra helyezett, P1–P4 néven nevezett hélixsel. Száraik 8, 7, 6 és 5 bp-ból állnak. A SAM metabolit a P1 és P3 közötti kötőzsebhez kötődik. Ezen túlmenően az adenin ribokapcsolót tárgyaljuk Vibrio vulnificus. Ez a ribokapcsoló egy „be” kapcsoló, amely modulálja a transzláció iniciációját, és 71 nt-ból áll, amelyek háromutas spirális csomópontban PDB ID 1Y26 (32) vannak elrendezve (az 1B. ábrán látható, a részletes bázispárosítás az S1 kiegészítő ábrán). Három P1-P3 hélix 9, 6 és 6 bp méretű szárral rendelkezik. A ligandum a két koaxiálisan egymásra helyezett P1 és P2 hélix között kötődik.

Annak vizsgálatához, hogy a transzkripció hogyan befolyásolja a hajtogatást, arra összpontosítunk, hogy megértsük, hogyan függ a szerkezeti elemek összehajtási sorrendje a transzkripció sebességétől. Két hajtogatási forgatókönyvet vizsgálunk, a teljes szerkezet szabad hajtogatását és az RNS kotranszkripciós hajtogatását. Elemzéseinkhez reakciókoordinátául a kialakult bázispárok számát választjuk. Ez a választás lehetővé teszi számunkra, hogy sztochasztikusan generált pályákon mintát vegyünk, és a hajtás előrehaladását egy globálisan összehasonlítható változóra vetítsük. A megfigyelhető adatok, amelyekre kíváncsiak vagyunk, a szubstrukturális elemeken belül kialakult bázispárok száma. Konkrétan a riboswitch adott másodlagos szerkezete által meghatározott lokális és nemlokális helikális hurkok szárait vizsgáljuk. Egy bázispár kialakulása az SBM-ben akkor tekinthető megvalósultnak, ha a két bázis közötti natív interatomi érintkezés >50%-a létrejön. További vizsgálatok azt mutatják, hogy az összecsukási jellemzők stabilak ennek a küszöbértéknek a tényleges megválasztása tekintetében (S2 kiegészítő ábra). A reakciókoordináta kiválasztása a dinamikus MC módszerrel való összehasonlíthatóságot is megkönnyíti, ahol a bázispárok száma a természetes reakciókoordináta. Meghatározott reakciókoordináták és szimulációink számára megfigyelhetőek alapján megfelelő módszerekre van szükségünk a transzkripció mint biomolekuláris folyamat modellezésére. A két különböző szimulációs módszer eltérő beállításokat igényel a kérdéses rendszerek modellezéséhez.

Natív szerkezet alapú MD

A bevezetett erőállandók homogének és normalizáltak a rendszer méretéhez és az érintkezők számához képest. Szimulációinkat a Gromacs szoftvercsomaggal (37) futtattuk le redukált Gromacs egységekben, amelyek nem rendelkeznek közvetlen fizikai idő- és hőmérsékletskálákkal (21, 22, 38, 39). Ezért ezeket a megfigyelések kísérletekkel vagy empirikus erőtér szimulációkkal való összehasonlításával kell bevezetni. A relatív hőmérsékleti skálák empirikus erőterekkel történő kalibrálásához minden atomot tartalmazó MD szimulációt végzünk az AMBER99 erőtér alapján TIP3P-vel és ellenionokkal (40). 1 μs-ot szimulálunk 300 K (26,85 °C) referencia-hőmérsékleten, és összehasonlítjuk az egyes maradékok térbeli négyzetes középérték-ingadozásait (RMSF) (41) SBM-szimulációkkal különböző hőmérsékleteken. A legjobb egyezést az SBM szimulációja kapja 90 °C hőmérsékleten (csökkentett Gromacs egységek, S10 kiegészítő ábrák és kiegészítő adatok ). A riboswitch kezdi elveszíteni szerkezeti stabilitását a 90 feletti bázispárokban (csökkentett Gromacs-egységek), és a hajtogatási utak kevésbé elkülönülnek. 90 alatt a behajtási események sorrendje nem változik 62 és 90 között (csökkentett Gromacs egységek).Az alacsonyabb hőmérséklet azonban körülbelül egy nagyságrenddel felgyorsítja a hajtogatást, és jelentősen csökkenti a számítási erőfeszítést, ami lehetővé teszi a jobb mintavételezést.

180 szabad hajtogatási szimulációt futtatunk 62 °C hőmérsékleten (csökkentett Gromacs-egység), hogy a kísérleti eredményekkel összehasonlítható becslést kapjunk a hajtogatási időre (42). A szimulációs hajtogatási idő becslése érdekében az egyes szimulációs keretek natív hajtásához viszonyított négyzetes eltéréseket (RMSD) kivonjuk a pályából. Amint az RMSD egy 3 Å küszöb alá esik, a megfelelő keretet hajtogatási eseménynek tekintjük. Ennek a 180 hajtogatási eseménynek a hisztogramja enyhén aszimmetrikus eloszlást eredményez, amelynek maximumát a hajtogatási idő becslésének tekintjük (S3 kiegészítő ábra). Az adenin ribokapcsoló (42) hajtogatási idejére vonatkozó kísérleti értékkel való összehasonlítás 20 nt/s-t eredményez a legkisebb, 0,0025-ös extrudálási sebességnél. A szimulációkat 62 °C és 90 °C hőmérsékleten végezzük (csökkentett mértékegységek, 90 °C referencia hőmérséklet). Az extrudálási szimulációkhoz 0,001-es, a szabadon hajtogatható szimulációkhoz pedig 0,002-es időlépést használunk. A hőmérsékletet Langevin-dinamikán keresztül vezetjük be és tartjuk állandóan, 1-es csatolási állandóval. Az extrudálási forgatókönyvben állandó sebességű húzási opciót alkalmazunk, különböző állandó sebességgel, 0,0025 és 0,1 között (lásd még az S1 kiegészítő filmet).

Kinetikus MC módszer

Az RNS-t bázisok lineáris láncaként modellezik (b1,b2, … ,bN) ahol bén = A, C, G vagy U. Bázispárok halmaza (bén, bj) meghatározza az RNS másodlagos szerkezetét. Egy adott másodlagos szerkezet szabad energiáját az RNS másodlagos szerkezetének előrejelzésében általánosan használt empirikus modellek és paraméterek segítségével számítják ki (43). Ez a paraméterezés szekvenciafüggő energiaértékeket tartalmaz két egymást követő bázispárból álló halmok, eltérések, rövid hurkok és kidomborodások esetén. A nagyobb hurkok és a több hélixet összekötő hurkok hosszuktól, szimmetriájuktól és a kimenő hélixek számától függően paraméterezhetők. A teljes szabad energiát ezután az összes szerkezeti motívum összegével közelítjük meg. A fentiekben alkalmazott szerkezet alapú megközelítéshez hasonlóan a szerkezeti információ beépül az RNS-modellbe. Megjelenik a natív struktúrában zárt kapcsolatok listája, és az alappárosítási interakciók a felsoroltakra korlátozódnak. A két versengő szerkezettel végzett szimulációkban, amelyek két szabadenergia-minimumnak felelnek meg, a lista mindkét struktúra natív kapcsolatait tartalmazza. Ezért néhány névjegy a listában kölcsönösen kizárja egymást. MC szimulációs sémát használunk Metropolis árfolyamokkal, ahol az alapvető lépések egyetlen natív bázispár zárása és nyitása. Egy mozgást olyan valószínűséggel fogadunk el, ahol a másodlagos struktúrák szabadenergia-különbsége a mozgás előtt és után. A hozzá vezető mozdulatokat mindig elfogadják. A szimulációs időskála rögzítéséhez kiszámítjuk az átlagos átmeneti időt az adenin riboswitch aptamer régió kibontott állapotából a hajtogatott állapotba (S4 kiegészítő ábra). A kísérleti eredményekkel (42) összehasonlítva megkapjuk az (1,2 × 10 5 ) MC lépéseknek megfelelő 1 s összefüggést.


Több választási lehetőség

Valószínűleg melyik a bioszintetikus útvonalon enzimeket kódoló gének operonja az alábbiak közül?

A. indukálható
B. elnyomható
C. konstitutív
D. monocisztronos

Azt mondják, hogy az alábbiak közül melyik az operon, amely olyan géneket kódol, amelyek folyamatosan átíródnak és transzlálódnak, hogy biztosítsák a sejtnek a fehérjetermékek állandó köztes szintjét?

A. elnyomható
B. indukálható
C. konstitutív
D. aktiválva

Az alábbi feltételek közül melyik vezet a maximális kifejezéshez lac operon?

A. laktóz van, glükóz hiányzik
B. laktóz jelen van, glükóz van jelen
C. laktóz hiányzik, glükóz hiányzik
D. laktóz hiányzik, glükóz van jelen

Az alábbiak közül melyik az eukariótákra jellemző génexpresszió-szabályozás?

A. csillapítás
B. alternatív &szigma faktor használata
C. hisztonok kémiai módosítása
D. alarmones


Tartalom

A nukleinsavakat először 1868-ban Friedrich Miescher [10] fedezte fel, és 1939-ben az RNS-t a fehérjeszintézisben vették részt. [11] Két évtizeddel később Francis Crick megjósolt egy funkcionális RNS-komponenst, amely transzlációt közvetített, és úgy vélte, hogy az RNS jobban megfelel az mRNS-transzkriptum bázispárjának, mint a tiszta polipeptid. [12]

Az első jellemezhető nem kódoló RNS egy sütőélesztőben található alanin tRNS volt, szerkezetét 1965-ben publikálták. [13] Tisztított alanin tRNS minta előállításához Robert W. Holley et al. 140 kg kereskedelmi forgalomban kapható sütőélesztőt használtak fel, hogy mindössze 1 g tisztított tRNS Ala-t adjon az elemzéshez. [14] A 80 nukleotidból álló tRNS-t először hasnyálmirigy-ribonukleázzal emésztjük (citozinra vagy uridinre végződő fragmentumokat termel), majd takadiasztáz Tl-ribonukleázzal (a guanozinnal végződő fragmentumokat termeli). A kromatográfia és az 5' és 3' végek azonosítása ezután segített a fragmensek elrendezésében az RNS-szekvencia megállapításához. [14] Az ehhez a tRNS-hez eredetileg javasolt három struktúra közül [13] a „lóherelevél” szerkezetet egymástól függetlenül javasolták számos következő publikációban. [15] [16] [17] [18] A lóhere másodlagos szerkezetét két független kutatócsoport 1974-ben végzett röntgenkrisztallográfiai elemzése után véglegesítették. [19] [20]

Ezután a riboszómális RNS-t fedezték fel, majd az 1980-as évek elején az URNA-t. Azóta az új, nem kódoló RNS-ek felfedezése folytatódott a snoRNS-ek, a Xist, a CRISPR és még sok más segítségével. [21] A közelmúlt figyelemre méltó kiegészítései közé tartozik a riboswitch és a miRNS. Az utóbbihoz kapcsolódó RNSi-mechanizmus felfedezése révén Craig C. Mello és Andrew Fire 2006-ban megkapta az élettani és orvosi Nobel-díjat. [22]

Az ncRNS-ek legújabb felfedezéseit kísérleti és bioinformatikai módszerekkel is sikerült elérni.

A nem kódoló RNS-ek több csoportba tartoznak, és számos sejtfolyamatban vesznek részt. Ezek a központi jelentőségű ncRNS-ektől, amelyek az egész vagy a legtöbb sejtéletben konzerváltak, a tranziensebb ncRNS-ekig, amelyek egy vagy néhány közeli rokon fajra specifikusak. A konzerváltabb ncRNS-ekről azt gondolják, hogy az utolsó univerzális közös ős és az RNS-világ molekuláris kövületei vagy relikviái, és jelenlegi szerepük továbbra is főként a DNS-ből fehérjébe való információáramlás szabályozásában marad. [23] [24] [25]

Fordításban Szerk

A konzervált, esszenciális és bőséges ncRNS-ek közül sok részt vesz a transzlációban. A ribonukleoprotein (RNP) részecskék, az úgynevezett riboszómák azok a „gyárak”, ahol a transzláció végbemegy a sejtben. A riboszóma több mint 60%-ban riboszómális RNS-ből áll, ezek a prokariótákban 3 ncRNS-ből és az eukariótákban 4 ncRNS-ből állnak. A riboszómális RNS-ek katalizálják a nukleotidszekvenciák fehérjékké történő transzlációját. Az ncRNS-ek másik csoportja, a transzfer RNS-ek „adapter molekulát” alkotnak az mRNS és a fehérje között. A H/ACA box és a C/D box snoRNS-ek archaeában és eukariótákban található ncRNS-ek. Az RNáz MRP az eukariótákra korlátozódik. Az ncRNS mindkét csoportja részt vesz az rRNS érésében. A snoRNS-ek irányítják az rRNS-ek, tRNS-ek és snRNS-ek kovalens módosításait. Az RNáz MRP hasítja a belső átírt spacer 1-et a 18S és 5.8S rRNS-ek között. A mindenütt jelenlévő ncRNS, az RNáz P, az RNáz MRP evolúciós rokona. [27] Az RNáz P érleti a tRNS-szekvenciákat azáltal, hogy a tRNS-ek érett 5'-végét generálja a prekurzor-tRNS-ek 5'-vezető elemeinek hasítása révén. Egy másik, mindenütt jelenlévő RNP, az SRP felismer és szállít specifikus születő fehérjéket az endoplazmatikus retikulumba eukariótákban és a plazmamembránba prokariótákban. Baktériumokban a transzfer-hírvivő RNS (tmRNS) egy RNP, amely részt vesz az elakadt riboszómák megmentésében, a nem teljes polipeptidek megjelölésében és az aberráns mRNS lebomlásának elősegítésében. [ idézet szükséges ]

RNS splicingben Szerk

Az eukariótákban a spliceoszóma hajtja végre az intronszekvenciák eltávolításához elengedhetetlen spliceos reakciókat, ez a folyamat szükséges az érett mRNS képződéséhez. A spliceoszóma egy másik RNP, amelyet gyakran snRNP vagy tri-snRNP néven is ismernek. A spliceoszómának két különböző formája van, a fő és a mellékforma. A fő spliceoszóma ncRNS komponensei az U1, U2, U4, U5 és U6. A minor spliceoszóma ncRNS komponensei az U11, U12, U5, U4atac és U6atac. [ idézet szükséges ]

Az intronok egy másik csoportja katalizálhatja saját eltávolítását a gazdatranszkriptumokból, ezeket önillesztő RNS-eknek nevezzük. Az önillesztő RNS-eknek két fő csoportja van: az I. csoport katalitikus intronja és a II. csoport katalitikus intronja. Ezek az ncRNS-ek katalizálják saját kivágásukat az mRNS-ből, a tRNS-ből és az rRNS-prekurzorokból az organizmusok széles körében. [ idézet szükséges ]

Emlősökben azt találták, hogy a snoRNS-ek az mRNS alternatív splicingjét is szabályozhatják, például a snoRNS HBII-52 szabályozza a 2C szerotonin receptor splicingjét. [28]

Fonálférgekben úgy tűnik, hogy az SmY ncRNS részt vesz az mRNS transz-illesztésében. [ idézet szükséges ]

A DNS-replikációban Szerk

Az Y RNS-ek szárhurkok, amelyek szükségesek a DNS-replikációhoz a kromatinnal és az iniciációs fehérjékkel (beleértve az eredetfelismerő komplexet) való kölcsönhatások révén. [30] [31] Szintén az Ro60 ribonukleoprotein részecske komponensei [32], amely az autoimmun antitestek célpontja szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegeknél. [33]

A génszabályozásban Szerk

Sok ezer gén expresszióját az ncRNS-ek szabályozzák. Ez a szabályozás történhet transz vagy cisz. Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az ncRNS-ek speciális típusa, az enhanszer RNS-ek, amelyek egy gén enhanszer régiójából íródnak át, elősegítik a génexpressziót. [ idézet szükséges ]

Transz-acting Edit

A magasabb rendű eukariótákban a mikroRNS-ek szabályozzák a génexpressziót. Egyetlen miRNS több száz gén expressziós szintjét csökkentheti. Az érett miRNS-molekulák működésének mechanizmusa egy vagy több hírvivő RNS (mRNS) molekulával részlegesen komplementer, általában a 3' UTR-ekben. A miRNS-ek fő funkciója a génexpresszió leszabályozása.

Kimutatták, hogy az ncRNS RNáz P is befolyásolja a génexpressziót. A humán sejtmagban az RNáz P szükséges az RNS polimeráz III által átírt különféle ncRNS-ek normális és hatékony transzkripciójához. Ide tartoznak a tRNS, az 5S rRNS, az SRP RNS és az U6 snRNS gének. Az RNáz P a transzkripcióban az aktív tRNS és 5S rRNS gének Pol III-mal és kromatinnal való asszociációján keresztül fejti ki szerepét. [34]

Kimutatták, hogy a 7SK RNS, egy metazoan ncRNS, az RNS polimeráz II elongációs faktor P-TEFb negatív szabályozójaként működik, és ezt az aktivitást befolyásolják a stresszre adott válaszutak. [ idézet szükséges ]

A bakteriális ncRNS, a 6S RNS specifikusan asszociálódik a sigma70 specificitási faktort tartalmazó RNS polimeráz holoenzimmel. Ez a kölcsönhatás elnyomja a sigma70-függő promoter expresszióját az állófázisban. [ idézet szükséges ]

Egy másik bakteriális ncRNS, az OxyS RNS elnyomja a transzlációt azáltal, hogy Shine-Dalgarno szekvenciákhoz kötődik, ezáltal elzárja a riboszóma kötődést. Az OxyS RNS az Escherichia coli oxidatív stresszre adott válaszként indukálódik. [ idézet szükséges ]

A B2 RNS egy kisméretű, nem kódoló RNS polimeráz III transzkriptum, amely egérsejtek hősokkjára reagálva elnyomja az mRNS transzkripciót. A B2 RNS gátolja a transzkripciót azáltal, hogy a Pol II maghoz kötődik. Ezen kölcsönhatás révén a B2 RNS preiniciációs komplexekké áll össze a promoternél, és blokkolja az RNS szintézist. [35]

Egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy az ncRNS-szekvencia transzkripciójának hatása lehet a génexpresszióra. Az ncRNS-ek RNS-polimeráz II transzkripciója szükséges a kromatin átalakulásához a Schizosaccharomyces pombe-ban. A kromatin fokozatosan nyílt konfigurációvá alakul át, mivel számos ncRNS-faj átíródik. [36]

Cis-működő Edit

Számos ncRNS van beágyazva a fehérjét kódoló gének 5' UTR-eibe (Untranslated Regions), és különböző módokon befolyásolja expressziójukat. Például egy riboswitch közvetlenül képes megkötni egy kis célmolekulát, a célpont kötődése befolyásolja a gén aktivitását. [ idézet szükséges ]

Az RNS-vezérszekvenciák az aminosav-bioszintetikus operonok első génje előtt találhatók. Ezek az RNS-elemek két lehetséges szerkezet egyikét alkotják azokban a régiókban, amelyek nagyon rövid peptidszekvenciákat kódolnak, amelyek gazdagok az operon végtermék aminosavában. A terminátor szerkezet akkor képződik, ha a szabályozó aminosav feleslege van, és a riboszóma mozgása a vezető transzkriptumhoz képest nem akadályozott. A szabályozó aminosav töltött tRNS-ének hiánya esetén a vezérpeptidet transzláló riboszóma leáll, és kialakul az antiterminátor szerkezet. Ez lehetővé teszi az RNS polimeráz számára, hogy átírja az operont. Az ismert RNS-vezetők a hisztidin operonvezető, a leucin operonvezető, a treonin operonvezető és a triptofán operonvezető. [ idézet szükséges ]

A vas válaszelemeket (IRE) a vasválasz fehérjék (IRP) kötik meg. Az IRE különböző mRNS-ek UTR-eiben található, amelyek termékei részt vesznek a vas anyagcseréjében. Ha a vas koncentrációja alacsony, az IRP-k megkötik a ferritin mRNS IRE-t, ami transzlációs represszióhoz vezet. [ idézet szükséges ]

A belső riboszóma belépési helyek (IRES) olyan RNS-struktúrák, amelyek lehetővé teszik a transzláció iniciációját az mRNS-szekvencia közepén a fehérjeszintézis folyamatának részeként. [ idézet szükséges ]

A genomvédelemben Szerk

Az emlős herékben és szomatikus sejtekben expresszált Piwi-kölcsönhatású RNS-ek (piRNS-ek) RNS-fehérje komplexeket alkotnak a Piwi fehérjékkel. Ezeket a piRNS-komplexeket (piRC-ket) a retrotranszpozonok és más genetikai elemek transzkripciós géncsendesítéséhez kapcsolták csíravonal sejtekben, különösen a spermatogenezisben.

A Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) számos baktérium és archaea DNS-ében található ismétlődések. Az ismétlődéseket hasonló hosszúságú távtartók választják el egymástól. Kimutatták, hogy ezek a távtartók fágból származhatnak, és ezt követően segítenek megvédeni a sejtet a fertőzéstől.

Kromoszóma szerkezet Szerk

A telomeráz egy RNP enzim, amely specifikus DNS-szekvencia ismétlődéseket (gerincesekben "TTAGGG") ad az eukarióta kromoszómák végein található telomer régiókhoz. A telomerek kondenzált DNS-anyagot tartalmaznak, ami stabilitást biztosít a kromoszómák számára. Az enzim egy reverz transzkriptáz, amely Telomeráz RNS-t hordoz, amelyet templátként használnak, amikor meghosszabbítja a telomereket, amelyek minden replikációs ciklus után lerövidülnek.

A Xist (X-inaktív-specifikus transzkriptum) egy hosszú ncRNS-gén a placentális emlősök X-kromoszómájában, amely az X-kromoszóma inaktivációs folyamatának fő effektoraként működik, és Barr-testeket képez. Egy antiszensz RNS, a Tsix, a Xist negatív szabályozója. Azok az X-kromoszómák, amelyekből hiányzik a Tsix-expresszió (és így magas szintű Xist-transzkripció), gyakrabban inaktiválódnak, mint a normál kromoszómák. Az XY nemmeghatározó rendszert is használó drosofilidekben az roX (X-en lévő RNS) RNS-ek részt vesznek a dóziskompenzációban. [37] Mind a Xist, mind a roX a transzkripció epigenetikus szabályozásával működik, hisztonmódosító enzimek toborzásán keresztül.

Bifunkcionális RNS szerkesztés

Bifunkcionális RNS-ek, vagy kettős funkciójú RNS-ek, olyan RNS-ek, amelyeknek két külön funkciója van. [38] [39] Az ismert bifunkcionális RNS-ek többsége mRNS, amely fehérjét és ncRNS-t is kódol. Azonban egyre több ncRNS esik két különböző ncRNS-kategóriába, például a H/ACA box snoRNS-be és a miRNS-be. [40] [41]

A bifunkcionális RNS-ek két jól ismert példája az SgrS RNS és az RNAIII. Mindazonáltal egy maroknyi más bifunkcionális RNS is létezik (pl. szteroid receptor aktivátor/SRA, [42] VegT RNS, [43] [44] Oskar RNS, [45] ENOD40, [46] p53 RNS [47] és SR1 RNS [48] A bifunkcionális RNS-ek a közelmúltban a Biochimie különszámának tárgyát képezték [49].

Hormonként Szerk

Fontos kapcsolat van bizonyos nem kódoló RNS-ek és a hormon által szabályozott útvonalak szabályozása között. Ban ben Drosophila, az olyan hormonok, mint az ekdizon és a juvenilis hormon, elősegíthetik bizonyos miRNS-ek expresszióját. Ezen túlmenően ez a szabályozás belül különálló időbeli pontokon történik C. elegans fejlődés. [50] Emlősökben a miR-206 az ösztrogén-receptor-alfa kulcsfontosságú szabályozója. [51]

A nem kódoló RNS-ek kulcsfontosságúak számos endokrin szerv fejlődésében, valamint az endokrin betegségekben, például a diabetes mellitusban. [52] Különösen az MCF-7 sejtvonalban a 17β-ösztradiol hozzáadása megnövelte a nem kódoló RNS-ek, az úgynevezett lncRNS-ek globális transzkripcióját az ösztrogénaktivált kódoló gének közelében. [53]

A kórokozók elkerülésében Szerk

C. elegans kimutatták, hogy megtanulja és örökli a patogén elkerülést, miután egy bakteriális kórokozó egyetlen nem kódoló RNS-ének volt kitéve. [54] [55]

A fehérjékhez hasonlóan a szervezeten belüli ncRNS-repertoár mutációi vagy egyensúlyhiányai számos betegséget okozhatnak.

Rák Szerkesztés

Sok ncRNS abnormális expressziós mintázatot mutat a rákos szövetekben. [5] Ide tartoznak a miRNS-ek, a hosszú mRNS-szerű ncRNS-ek, [56] [57] GAS5, [58] SNORD50, [59] telomeráz RNS és Y RNS-ek. [60] A miRNS-ek számos fehérjét kódoló gén nagy léptékű szabályozásában vesznek részt, [61] [62] az Y RNS-ek fontosak a DNS-replikáció megindításában, [30] a telomeráz RNS, amely a telomeráz primerjeként szolgál. RNP, amely kiterjeszti a telomer régiókat a kromoszómavégeken (további információért lásd: telomerek és betegségek). A hosszú mRNS-szerű ncRNS-ek közvetlen funkciója kevésbé egyértelmű.

Kimutatták, hogy a miR-16-1 és miR-15 primer prekurzorok csíravonali mutációi sokkal gyakrabban fordulnak elő krónikus limfocitás leukémiában szenvedő betegeknél, mint a kontrollcsoportokban. [63] [64]

Felmerült, hogy egy ritka SNP (rs11614913), amely átfedésben van a has-mir-196a2-vel, összefüggést mutat a nem kissejtes tüdőkarcinómával. [65] Hasonlóképpen, egy 17 miRNS-t tartalmazó szűrés, amelyekről azt jósolták, hogy számos emlőrákhoz kapcsolódó gént szabályoznak, eltéréseket találtak a miR-17 és miR-30c-1 mikroRNS-ekben azoknál a betegeknél, akik nem hordoztak BRCA1- vagy BRCA2-mutációt. annak a lehetősége, hogy a családi emlőrákot ezen miRNS-ek variációja okozhatja. [66] A p53 tumorszuppresszor vitathatatlanul a legfontosabb szer a tumor kialakulásának és progressziójának megelőzésében. A p53 fehérje transzkripciós faktorként működik, és kulcsfontosságú szerepet játszik a celluláris stresszválasz megszervezésében. A rákban betöltött döntő szerepe mellett a p53 más betegségekben is szerepet játszik, beleértve a cukorbetegséget, az ischaemiát követő sejthalált, és különféle neurodegeneratív betegségekben, mint például a Huntington, a Parkinson és az Alzheimer. A vizsgálatok azt sugallták, hogy a p53 expresszióját nem kódoló RNS szabályozza. [4]

Egy másik példa a nem kódoló RNS szabályozására a rákos sejtekben a hosszú, nem kódoló Linc00707 RNS.A Linc00707 felszabályozott, és miRNS-eket szivacsosít az emberi csontvelőből származó mezenchimális őssejtekben, [67] hepatocelluláris karcinómában, [68] gyomorrákban [69] vagy emlőrákban, [70] [71], és így elősegíti az oszteogenezist, hozzájárul a hepatocelluláris karcinóma kialakulásához. a progressziót, elősegíti a proliferációt és a metasztázisokat, vagy közvetve szabályozza a rák agresszivitásában szerepet játszó fehérjék expresszióját.

Prader–Willi szindróma Szerk

Kimutatták, hogy a C/D box snoRNS SNORD116 48 másolatának törlése a Prader–Willi-szindróma elsődleges oka. [72] [73] [74] [75] A Prader–Willi túlevéssel és tanulási nehézségekkel összefüggő fejlődési rendellenesség. A SNORD116 potenciális célhelyekkel rendelkezik számos fehérjét kódoló génben, és szerepet játszhat az alternatív splicing szabályozásában. [76]

Autizmus Edit

A kis nukleoláris RNS SNORD115 génklasztert tartalmazó kromoszómális lókuszt az autista tulajdonságokkal rendelkező egyének körülbelül 5%-ánál megduplikálták. [77] [78] A SNORD115 klaszter megkettőzésére tervezett egérmodell autista viselkedést mutat. [79] Egy közelmúltban végzett, post mortem agyszövet vizsgálata kimutatta, hogy az autista agy prefrontális kéregében és kisagyában a hosszú, nem kódoló RNS-ek expressziója megváltozott a kontrollokhoz képest. [80]

Porc-haj hypoplasia Szerk

Kimutatták, hogy az RNáz MRP-n belüli mutációk porc-szőr hipopláziát okoznak, egy olyan betegséget, amely egy sor olyan tünethez kapcsolódik, mint például az alacsony termet, a ritka szőr, a csontrendszeri rendellenességek és az elnyomott immunrendszer, ami gyakori az amishek és a finnek körében. [81] [82] [83] A legjobban jellemezhető variáns egy A-ból G-be való átmenet a 70. nukleotidnál, amely egy konzervált pszeudoknot két bázisától 5' hurokrégióban található. Az RNáz MRP-n belül azonban sok más mutáció is CHH-t okoz.

Alzheimer-kór Szerk

Az antiszensz RNS, a BACE1-AS, az ellenkező szálról íródik át BACE1-vé, és az Alzheimer-kórban szenvedő betegekben felfelé szabályozódik. [84] A BACE1-AS szabályozza a BACE1 expresszióját a BACE1 mRNS stabilitásának növelésével és további BACE1 generálásával egy poszt-transzkripciós feed-forward mechanizmuson keresztül. Ugyanezen mechanizmus révén növeli a béta-amiloid koncentrációját is, amely az öregkori plakkok fő alkotóeleme. A BACE1-AS koncentrációja emelkedett Alzheimer-kórban szenvedő alanyokban és amiloid prekurzor fehérje transzgenikus egerekben.

MiR-96 és halláscsökkenés Szerk

Az érett miR-96 magterületén belüli eltéréseket autoszomális domináns, progresszív hallásveszteséggel hozták összefüggésbe emberekben és egerekben. A homozigóta mutáns egerek mélyen süketek voltak, és nem mutattak cochleáris választ. A heterozigóta egerek és az emberek fokozatosan elveszítik a hallás képességét. [85] [86] [87]

A tudósok elkezdték megkülönböztetni funkcionális RNS (fRNS). [88] [89] [90] Ez azt jelenti, hogy az fRNS (például ribokapcsolók, SECIS elemek és más cisz-szabályozó régiók) nem ncRNS. Az fRNS azonban tartalmazhat mRNS-t is, mivel ez fehérjét kódoló RNS, és ezért funkcionális. Ezenkívül a mesterségesen kifejlesztett RNS-ek is az fRNS ernyőfogalom alá tartoznak. Egyes publikációk [21] azt állítják ncRNS és fRNS szinte szinonimák, mások azonban rámutattak, hogy az annotált ncRNS-ek nagy részének valószínűleg nincs funkciója. [8] [9] Javasolták a kifejezés egyszerű használatát is RNS, mivel a fehérjét kódoló RNS-től (messenger RNS) való megkülönböztetést már a minősítő adja meg. mRNS. [91] Ez kiküszöböli a kétértelműséget, amikor egy "nem kódoló" RNS-t kódoló gént kezelünk. Emellett előfordulhat, hogy számos ncRNS tévesen szerepel a publikált irodalomban és adatkészletekben. [92] [93] [94]


Nézd meg a videót: PANASZKÖNYV - Mi történik, ha hibás a bank által küldött hibaüzenet? (Június 2022).


Hozzászólások:

  1. Vunris

    Véleményem szerint téved. Bizonyíthatom. Írj nekem PM -ben.

  2. Zulutilar

    I apologize for interrupting you, but I offer to go in another way.

  3. Fern

    the answer Excellent, bravo :)

  4. Courtnay

    She is supposed to tell you the wrong way.

  5. Cleveland

    Igen valóban. A fentiek mind elmondták az igazat. Beszéljük meg ezt a kérdést. Itt vagy PM -ben.



Írj egy üzenetet